靶向肿瘤的体内原位诱导CAR-T细胞的递送系统及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统及其应用，属于免疫肿瘤学技术领域。所述递送系统包括纳米颗粒以及用血小板膜包裹所述纳米颗粒形成的纳米载体；其中，所述纳米颗粒是由阳离子聚合物、CAR基因质粒和CRISPR系统组装而成，通过所述纳米载体递送CRISPR系统至所述肿瘤实现原位编辑T细胞。本发明实现了在实体瘤原位编辑T细胞，改善了肿瘤微环境、增强了CAR‑T细胞的增殖和持久性，相比传统的CAR‑T，安全性更高，工艺简单且成本低。

权利要求

1.一种靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统，其特征在于，所述递送系统包括纳米颗粒、用血小板膜包裹所述纳米颗粒形成的纳米载体以及Anti‑CD3ef（ab’）2；其中，所述纳米颗粒是由阳离子聚合物、CAR基因质粒和CRISPR系统组装而成，通过所述纳米载体递送CRISPR系统至所述肿瘤实现原位编辑T细胞；

CD123基因质粒和CRISPR的质粒比例为1：1，阳离子聚合物与CD123基因质粒的比例为

30：1；所述阳离子聚合物为PBAE；

所述CRISPR系统包括如下任一项组合方式：

(1)Cas9和gRNA的质粒DNA；

(2)Cas9蛋白与gRNA组装成的核蛋白颗粒RNP；

(3)Cas9 mRNA和gRNA；

所述肿瘤为淋巴瘤。

2.如权利要求1所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统，其特征在于，所述血小板膜源自动物或者人的血浆样品中的血小板。

3.如权利要求1所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统，其特征在于，所述CAR基因质粒包括T细胞中能表达特异性靶向肿瘤细胞或者肿瘤微环境细胞的抗体，同时能分泌刺激T细胞活化和增殖的细胞因子。

4.如权利要求1所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统，其特征在于，所述CAR基因质粒和所述gRNA具有相匹配的同源臂序列，所述同源臂序列为所述gRNA靶向T细胞基因序列左侧和右侧不少于200bp序列。

5.如权利要求1‑4任一项所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将组装纳米颗粒的阳离子聚合物、CAR基因质粒和CRISPR系统分别用乙酸钠稀释后，再将阳离子聚合物等体积滴加CRISPR系统中，然后加入CAR基因质粒，室温静置15‑20min，组装成纳米颗粒；

步骤2：自血浆样品中分离血小板，得到血小板膜，再将所述血小板膜与所述纳米颗粒混合孵育，经超声、过滤，得到血小板膜包裹纳米颗粒的纳米载体。

6.如权利要求1所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为淋巴瘤。

说明书

靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫肿瘤学技术领域，特别是涉及一种靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统及其应用。

背景技术

[0002] 近年来，CAR‑T细胞免疫治疗(即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)在临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤性和持久性，在治疗血液肿瘤方向有突破性进展，成为了研究的热点。随着2017年8月诺华公司Kymrial被美国FDA批准上市，标志着CAR‑T细胞疗法真正进入临床应用。但CAR‑T治疗在淋巴瘤等实体瘤中治疗效果欠佳，原因主要在于：1)肿瘤细胞表面缺乏特异性抗原。实体瘤缺乏类似CD19这种在血液肿瘤中特异性存在的肿瘤相关抗原，导致CAR‑T细胞的分子靶点会同时出现在癌细胞和正常细胞的表面，从而导致杀伤非肿瘤细胞的严重副作用；2)肿瘤区域缺乏适合CAR‑T细胞发挥功能的微环境；实体肿瘤周围常有物理基质及较高的组织压力阻碍CAR‑T细胞的进入，少部分进入实体瘤的CAR‑T细胞由于受到低氧、营养饥饿状态、免疫抑制细胞(如M2型巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞等)的肿瘤微环境抑制作用，难以增殖、产生细胞因子等发挥抗肿瘤效应；3)CAR‑T细胞在体内的增殖和持久性不足。体外扩增的CAR‑T细胞进入机体归巢至肿瘤部位后，必须经历扩增达到相对于肿瘤负荷的适当数量才能消除肿瘤，由于CAR‑T细胞在血循环中的损耗、受到肿瘤区域的免疫微环境抑制，使其难以持续存活和扩增；而增加CAR‑T细胞输注剂量又会引起难以控制的系统毒性，例如细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)等。

[0003] 最近纳米载体(Nanoparticles,NPs)在体内诱导CAR‑T细胞为RR‑HL的治疗提供新策，Smith等创新性的构建了CD3‑PGA负载CD19 CAR基因的纳米粒子，在小鼠体内原位编辑T细胞构建CAR‑T19细胞治疗急性淋巴细胞白血病，相比于传统CAR‑T策略，体内CAR‑T策略具有良好的疗效，同时简化了传统CAR‑T策略存在的T细胞分离、扩增程序复杂，专用设备、技术专长要求严格，医疗成本昂贵等不足。可见NPs递送CAR基因的方式具有良好的应用前景，但目前还没有涉及到实体瘤的治疗。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该递送系统实现了在实体瘤原位编辑T细胞，改善了肿瘤微环境、增强了CAR‑T细胞的增殖和持久性，相比传统的CAR‑T，安全性更高，工艺简单且成本低。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一种靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统，所述递送系统包括纳米颗粒以及用血小板膜包裹所述纳米颗粒形成的纳米载体；其中，所述纳米颗粒是由阳离子聚合物、CAR基因质粒和CRISPR系统组装而成，通过所述纳米载体递送CRISPR系统至所述肿瘤实现原位编辑T细胞。

[0007] 优选的是，所述血小板膜源自动物或者人的血浆样品中的血小板。

[0008] 优选的是，所述阳离子聚合物包括带有氨基的阳离子聚合物。

[0009] 进一步地，所述阳离子聚合物为聚β氨酯，聚乙烯亚胺，但不限于此。

[0010] 优选的是，所述CAR基因质粒包括T细胞中能表达特异性靶向肿瘤细胞或者肿瘤微环境细胞的抗体，同时能分泌刺激T细胞活化和增殖的细胞因子。

[0011] 进一步地，所述CAR基因质粒为CD19,CD123但不限于此。

[0012] 优选的是，所述CRISPR系统包括如下任一项组合方式：

[0013] (1)Cas9和gRNA的质粒DNA；

[0014] (2)Cas9蛋白与gRNA组装成的核蛋白颗粒RNP；

[0015] (3)Cas9 mRNA和gRNA。

[0016] 进一步地，CRISPR系统优选Cas9和gRNA的质粒DNA。

[0017] 优选的是，所述CAR基因质粒和所述gRNA具有相匹配的同源臂序列，所述同源臂序列为所述gRNA靶向T细胞基因序列左侧和右侧不少于200bp序列。

[0018] 本发明还提供一种所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统的制备方法，包括以下步骤：

[0019] 步骤1：将组装纳米颗粒的阳离子聚合物、CAR基因质粒和CRISPR系统分别用乙酸钠稀释后，再将阳离子聚合物等体积滴加CRISPR系统中，然后加入CAR基因质粒，室温静置15‑20min，组装成纳米颗粒；

[0020] 步骤2：自血浆样品中分离血小板，得到血小板膜，再将所述血小板膜与所述纳米颗粒混合孵育，经超声、过滤，得到血小板膜包裹纳米颗粒的纳米载体。

[0021] 本发明还提供一种所述的靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的纳米载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

[0022] 优选的是，所述肿瘤为淋巴瘤。

[0023] 本发明公开了以下技术效果：

[0024] 本发明提出的血小板纳米载体递送CRISPR系统原位诱导CD123 CAR‑T细胞治疗难治‑复发性淋巴瘤的技术方案，具体是利用生物可降解的阳离子聚合物与CRIPSR的质粒或者CRISR系统的核蛋白颗粒(RNP)混合组装成纳米颗粒，然后加入CD123 CAR的质粒，组装成带正电的复合物，然后与分离制备好的血小板膜孵育，包裹上血小板膜后，利用CD3对纳米颗粒表面进行修饰。这样通过血小板膜靶向肿瘤血管通过的功能，将纳米颗粒靶向富集在肿瘤部位，另外，纳米颗粒通过表面的CD3抗体主动结合肿瘤部位的T细胞，吞噬进T细胞后，阳离子聚合物释放出CRISPR系统对T细胞进行基因编辑，完成肿瘤部位原位诱导CAR‑T的产生。肿瘤局部T细胞的编辑和扩增克服了从体外输入CAR‑T的全身性的安全问题，也避免了体外编辑的复杂工艺和高成本问题。因此，本发明利用体内原位构建CAR‑T细胞策略可以极大简化操作，能有效的将目的基因递送至T细胞内，从而有可能获得更稳定、更高效、更安全的CAR‑T原位编辑的效果，为CAR‑T细胞治疗在淋巴瘤等实体瘤的临床应用提供新的方案与思路。

附图说明

[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0026] 图1为负载基因的血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体的制备路线图；

[0027] 图2为血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体的电镜图；标尺为100nm；

[0028] 图3为血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体的粒径分布图；

[0029] 图4为血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体中不同组份的电位值；

[0030] 图5为血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体体外对小鼠T细胞进行荧光标记质粒的转染效果；

[0031] 图6为血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体体内的肿瘤靶向效应。

具体实施方式

[0032] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0033] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0034] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0035] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0036] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0037] 本发明技术构思：针对目前传统CAR‑T策略在实体瘤中的治疗困境，提出了血小板纳米载体递送CRISPR系统原位诱导CD123 CAR‑T细胞治疗RR‑HL的新策略：首先，构建CD123 CAR基因和CRISPR/Cas9基因，将其负载于血小板纳米载体注入小鼠体内，通过血小板膜的被动靶向作用富集于肿瘤局部，诱导针对肿瘤细胞和微环境的双重靶向的CD123 CAR‑T细胞形成，增强抗实体瘤的疗效；同时该策略克服了传统CAR‑T的一些安全性问题，也解决了体外编辑的工艺和成本问题。

[0038] 通过研究血小板纳米载体递送CRISPR系统原位诱导CD123 CAR‑T细胞治疗RR‑HL，发明人希望为CAR‑T细胞治疗在淋巴瘤等实体瘤中的应用探索一条新的思路，该研究无论在基础研究还是在临床转化方面都有重要意义。基础研究方面，传统的CAR‑T技术通过慢病毒、电转等方式构建基因工程化T细胞。发明人则认为可以通过纳米技术将CRISPR/Cas9、CD123CAR基因递送至体内原位诱导CD123 CAR‑T细胞，这是对现有CAR‑T技术的一个重要衍生与补充。临床转化方面，传统的CAR‑T策略通过分离T淋巴细胞、体外激活/富集、基因修饰、回输体内等一系列操作，不仅工艺复杂、成本昂贵，而且通过慢病毒转染进行基因修饰还存在基因突变等安全问题。发明人利用体内原位构建CAR‑T细胞策略可以极大简化操作，能有效的将目的基因递送至T细胞内，从而有可能获得更稳定、更高效、更安全的CAR‑T原位编辑的效果，为CAR‑T细胞治疗在淋巴瘤等实体瘤的临床应用提供新的方案与思路。

[0039] 实施例1靶向肿瘤的体内原位诱导CAR‑T细胞的递送系统

[0040] 1、PBAE/pDNA的制备

[0041] 将PBAE和CD123基因和CRISPR的质粒(公司采购)分别在25mM乙酸钠溶液中稀释，将PBAE溶液滴加到相同体积CRISPR质粒溶液中混合，然后加入CD123基因质粒混匀，室温下静15min，自组装构建PBAE/pDNA纳米颗粒(如图1所示)，其中CD123基因和CRISPR的质粒比例为1：1，PBAE与CD123基因质粒的比例为30：1。

[0042] 2、血小板膜包裹PBAE/pDNA纳米载体的制备

[0043] C57BL/6J小鼠麻醉后，活体心脏取血于抗凝剂管中，加入血小板分离液，在300g条件下离心15min，取第一层血浆层至无菌离心管中，加入同体积样本稀释液，在500g条件下离心20min，回收血小板沉淀，并置于‑80℃条件下反复冻融3次，离心收集沉淀物转移至含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中进行超声处理(100W，40kHz，5min)得到血小板膜。

[0044] 将上述得到的血小板膜与PBAE/pDNA溶液按照血小板膜：PBAE/pDNA溶液体积比为1：0.5‑10：1(优选1:1)混合后，进行超声处理(100W，40kHz，5min)，将混合液置于脂质体挤出器中，设置滤膜孔径为200nm，反复挤压液体透过滤膜，得到负载基因的血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体。

[0045] 实施例2纳米颗粒的表征鉴定

[0046] 利用透射电镜观察实施例1中制备的纳米载体的形态，吸取5ul纳米载体用去离子水稀释3倍，然后吸取少量稀释样品滴加在铜网上，结果如图2所示，纳米的粒径为150‑200nm.

[0047] 利用动态光散射激光纳米粒度分析仪测量纳米粒子的尺寸和zeta电势，分别取1mL纳米载体的样品放入粒度分析仪样品池和电位测定样品池中，结果如图3和图4所示，纳米粒的主要粒径分布在220nm,最后包裹纳米Zeta电势为‑18mV。

[0048] 实施例3纳米颗粒体外转染质粒进T细胞的效率检测

[0049] 单纯pDNA、PBAE/pDNA和血小板膜包裹的PBAE/pDNA组与小鼠脾脏来源T细胞(PBMC)培养后，在转染20min、120min用共聚焦显微镜进行观察转染效率。结果如图5所示，血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体相较于单独的质粒pDNA组，有良好的转染效率。

[0050] 实施例4血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体在体内对肿瘤的靶向效应评价[0051] 将预先用PKH67标记的CD3‑PMPP，经尾静脉注入皮下淋巴瘤的C57BL/6J小鼠体内，分别在给药后0.5h、6h、24h、48h取其心、肝、脾、肺、肾重要脏器及肿瘤进行成像。

[0052] 结果如图6所示，构建的血小板膜包裹的PBAE/pDNA纳米载体在体内具有良好的靶向肿瘤性，经肝肾代谢后，随着时间的延长在肿瘤部位仍有较高浓度。

[0053] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。