一种含氮芥的咪唑杂环衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物及其制备方法和应用，更具体地，本发明先以N‑苯基二乙醇胺为原料，与Vilsmerier试剂反应得到含氮芥中间体，利用氮芥中间体与菲类衍生物、邻菲罗啉类生物分别制备含氮芥的菲并咪唑衍生物PIP‑NM和含氮芥的邻菲罗啉衍生物PLIP‑NM，本发明制备方法简单易行，对设备要求低，目标化合物分离提纯容易。体外抗肿瘤实验表明PIP‑NM和PLIP‑NM具有优异的抗肿瘤效果，在抑制肿瘤细胞增殖方面表现出很强的药理活性，在抗肿瘤药物领域具有广泛的研究开发价值。

权利要求

1.一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)和/或式(Ⅱ)所示分子结构：

2.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅰ)化合物的制备方法包括如下步骤：

S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、9,10‑二氨基菲和酸通过缩合反应制得式(Ⅰ)化合物；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、9,10‑二氨基菲和酸的摩尔比为1：1：0.1～0.2；所述酸为乙酸、丙酸或甲苯磺酸的一种或多种。

3.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅰ)化合物的制备方法包括如下步骤：

S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、菲醌和乙酸铵通过Debus‑Radziszewski反应制得式(Ⅰ)化合物；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、菲醌和乙酸铵的摩尔比为1：1：15～40。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

5.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)化合物的制备方法包括如下步骤：

S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉在酸的催化下缩合反应得到式(Ⅱ)化合物；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉和酸的摩尔比为1：1：0.1～0.2；所述酸为乙酸、丙酸或甲苯磺酸的一种或多种。

6.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)化合物的制备方法包括如下步骤：

S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵经过Debus‑Radziszewski反应合成式(Ⅱ)化合物；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵的摩尔比为1：1：15～40。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

8.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物在制备抑制肿瘤细胞MDA‑MB‑231、A549、

786‑O或HepG2.2.15生长的药物中的应用。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述含氮芥的咪唑并杂环衍生物或其在药学上可接受的盐。

说明书

一种含氮芥的咪唑杂环衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药中间体及抗肿瘤药物技术领域，更具体地，涉及一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 氮芥类药物是临床上最早用于肿瘤治疗的药物之一。其抗肿瘤机理是通过在细胞内形成缺电子的乙撑亚胺离子，进而与DNA、RNA或酶类生物大分子的富电子中心反应，产生
共价结合。这种共价结构，要比插入、静电和沟面等作用方式要牢固，所以氮芥类药物容易
导致这些生物大分子丧失活性，使细胞复制受阻，从而达到抗肿瘤的目的。

[0003] 氮芥类抗肿瘤药主要由两部分组成，即烷基化部分和载体部分：烷基化部分即通式中的双β‑氯乙胺基，也称氮芥基，是抗肿瘤活性的功能基团；载体部分主要影响药物的物
化性质，以及在体内的吸收、分布等药代动力学性质。通过选择不同的载体，可以达到提高
药物选择性和疗效、降低毒性的目的。氮芥类化合物的结构修饰主要集中在载体部分，无论
是游离的还是与各种载体相连，均无结构专一性，都具有抗肿瘤作用。如中国专利
CN107628962A公开了一种苯丁酸氮芥，可以用于制备抗肿瘤药物。仍需要开发新型氮芥类
药物，获得不同载体与活性的构效关系，为开发高效低毒的氮芥抗肿瘤药物提供重要的理
论基础。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，利用氮芥分别与菲并咪唑类衍生物、邻菲罗啉并咪唑衍生物制备偶联物，经过偶联后制得的衍生物具有很好的抗肿
瘤活性。

[0005] 本发明的又一目的是提供一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法。

[0006] 本发明的另一目的是提供一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物的应用。

[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0008] 一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，具有如式(Ⅰ)和/或式(Ⅱ)所示分子结构：

[0009]

[0010] 本发明利用氮芥与菲类衍生物、邻菲罗啉类衍生物分别制备含氮芥的菲并咪唑衍生物，和含氮芥的邻菲罗啉并咪唑衍生物。它们均具有良好的对称性，没有手性中心，具有
良好的平面结构，所制备的含氮芥咪唑并杂环衍生物具有很好的抗肿瘤活性，在抑制肿瘤
细胞增殖现方面表现出很强的药理活性。

[0011] 式(Ⅰ)化合物(PIP‑NM)分子式为：C25H21Cl2N3；化学名称：双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑菲并[9,10‑d]咪唑‑2‑基)苯胺；是一种含氮芥的菲并咪唑类衍生物。

[0012] 式(Ⅱ)化合物(PLIP‑NM)分子式为：C23H19Cl2N5；化学名称：双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]邻菲罗啉‑2‑基)苯胺(PLIP‑NM)；是一种含氮芥的邻菲罗啉并咪唑衍生
物。

[0013] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，所述式(Ⅰ)化合物的制备方法包括如下步骤：

[0014] S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

[0015] S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、9,10‑二氨基菲和酸通过缩合反应制得式(Ⅰ)化合物；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、9,10‑二氨基菲和酸的摩
尔比为1：1：0.1～0.2。

[0016] 反应方程式如下：

[0017]

[0018] 4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体命名为NM‑CHO。

[0019] 优选地，步骤S1的具体步骤为：在冰水浴中，将POCl3滴加至N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌分散后加入溶解有N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺的DMF溶液，升温至90‑100℃条件下反应3‑
5小时，将反应液冷却至室温后倒入冰水中，用1mol/L的氢氧化钠调节pH至中性，抽滤，滤饼
重结晶得4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体。

[0020] 优选地，步骤S2的具体步骤为：将NM‑CHO、单体和催化剂加入到溶剂中，110℃～135℃加热反应4～10小时，反应完毕后将反应液加入到冰水中，冷却后离心，固体再加水重
悬并离心，去上清，通过硅胶柱色谱分离得式(Ⅰ)化合物。

[0021] 优选地，步骤S2所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

[0022] 优选地，所述酸为乙酸、丙酸或对甲苯磺酸。

[0023] 优选地，步骤S2所述溶剂为DMF或乙酸。

[0024] 优选地，所述溶剂体积与9,10‑二氨基菲的物质的量比为7～8mL：1mmol。

[0025] 优选地，步骤S2反应后所加的冰水体积与溶剂体积比为5～8：1。

[0026] 优选地，所述硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷：甲醇＝40～60：1(V/V)。

[0027] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，所述式(Ⅰ)化合物的制备方法包括如下步骤：

[0028] S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体；

[0029] S2.然后将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、菲醌和乙酸铵通过Debus‑Radziszewski反应制得式(Ⅰ)化合物(PIP‑NM)；其中，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间
体、菲醌和乙酸铵的摩尔比为1：1：15～40。

[0030] 反应方程式如下：

[0031]

[0032] 优选地，步骤S2的具体步骤为：将NM‑CHO、9,10‑二氨基菲和催化量的酸加入到溶剂中，加热反应数小时，反应完毕后将反应液加入到冰水中，冷却后离心，固体再加水重悬
并离心，去上清，重复两次，通过硅胶柱色谱分离得化合物式(Ⅰ)化合物。

[0033] 优选地，步骤S2所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

[0034] 优选地，所述溶剂为DMF或乙酸。

[0035] 优选地，溶剂体积与菲醌的物质的量比为7～8mL：1mmol。

[0036] 优选地，步骤S2反应后所加的冰水体积与溶剂体积比为5～8：1。

[0037] 优选地，硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷：甲醇＝40～60：1(V/V)。

[0038] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，所述式(Ⅱ)化合物的制备方法包括如下步骤：

[0039] S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备NM‑CHO；

[0040] S2.然后将NM‑CHO、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉在酸的催化下缩合反应得到式(Ⅱ)化合物(PLIP‑NM)；其中，NM‑CHO、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉和酸的摩尔比为1：1：0.1
～0.2。

[0041] 反应方程式如下：

[0042]

[0043] 优选地，步骤S2的具体步骤为：NM‑CHO、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉和催化量的酸加入到溶剂中，加热反应数小时，反应完毕后将反应液加入到冰水中，冷却后离心，固体再
加水重悬并离心，去上清，重复两次，通过硅胶柱色谱分离得化合物PLIP‑NM。

[0044] 优选地，步骤S2所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

[0045] 优选地，所述酸为乙酸、丙酸或对甲苯磺酸。

[0046] 优选地，所述溶剂为DMF或乙酸。

[0047] 优选地，所述溶剂体积与5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉物质的量比为7～8mL：1mmol。

[0048] 优选地，步骤S2反应后所加的冰水体积与溶剂体积比为5～8：1。

[0049] 优选地，硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷：甲醇＝40～60：1(V/V)。

[0050] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，所述式(Ⅱ)化合物的制备方法包括如下步骤：

[0051] S1.在冰水浴中，以N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺、POCl3为原料，经过Vilsmeier‑Haack反应制备NM‑CHO；

[0052] S2.然后将NM‑CHO、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵经过Debus‑Radziszewski反应合成式(Ⅱ)化合物；其中，NM‑CHO、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵
的摩尔比为1：1：15～40。

[0053] 反应方程式如下：

[0054]

[0055] 优选地，步骤S2的具体步骤为：NM‑CHO、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵加入到溶剂中，加热反应数小时，反应完毕后将反应液加入到冰水中，冷却后离心，固体再加水
重悬并离心，去上清，重复两次，通过硅胶柱色谱分离得化合物PLIP‑NM。

[0056] 优选地，所述反应的温度为110℃～135℃，反应时间为4～10小时。

[0057] 优选地，所述溶剂为DMF或乙酸。

[0058] 优选地，所述溶剂体积与1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮的物质的量比为7～8mL：1mmol。

[0059] 优选地，所述反应后所加的冰水体积与溶剂体积比为5～8：1。

[0060] 优选地，硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷：甲醇＝40～60：1(V/V)。

[0061] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物的制备方法，所述式(Ⅱ)化合物的制备方法包括如下步骤：

[0062] S1.在冰水浴中，将POCl3滴加至N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌分散后加入溶解有N,N‑二(2‑羟乙基)‑苯胺的DMF溶液，升温至90‑100℃条件下反应3‑5小时，将反应液冷却至室
温后倒入冰水中，用1mol/L的氢氧化钠调节pH至中性，抽滤，滤饼重结晶得NM‑CHO；

[0063] S2.然后将NM‑CHO、单体和催化剂加入到溶剂中，110℃～135℃加热反应4～10小时，反应完毕后将反应液加入到冰水中，冷却后离心，固体再加水重悬并离心，去上清(重复
两次)，通过硅胶柱色谱分离得化合物PIP‑NM，其中，所述单体为5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗
啉或1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮，所述催化剂为酸或乙酸铵。

[0064] 优选地，所述单体为5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉，催化剂为酸，NM‑CHO、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉和酸摩尔比为1：1：0.1～0.2。

[0065] 优选地，所述单体为1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮，催化剂为乙酸铵，4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮和乙酸铵的摩尔比为1：1：15～40。

[0066] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0067] 本发明保护上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物在制备抑制肿瘤细胞MDA‑MB‑231、A549、786‑O或HepG2.2.15生长的药物中的应用。

[0068] 一种抗肿瘤药物，所述药物的活性成分为上述含氮芥的咪唑并杂环衍生物或其在药学上可接受的盐。

[0069] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0070] 本发明先以N‑苯基二乙醇胺为原料，与Vilsmerier试剂反应得到含氮芥中间体，利用氮芥中间体与菲类衍生物、邻菲罗啉类衍生物分别制备含氮芥的咪菲并咪唑衍生物
PIP‑NM和含氮芥的邻菲罗啉并咪唑衍生物PLIP‑NM，本发明制备方法简单易行，对设备要求
低，目标化合物分离提纯容易。体外抗肿瘤实验表明PIP‑NM和PLIP‑NM具有优异的抗肿瘤效
果，在抑制肿瘤细胞增殖方面表现出很强的药理活性，在抗肿瘤药物领域具有广泛的研究
开发价值。

附图说明

[0071] 图1为本发明实施例1步骤1制备产物NM‑CHO的核磁氢谱图；

[0072] 图2为本发明实施例1步骤2制备产物PIP‑NM的高分辨率质谱图；

[0073] 图3为本发明实施例1步骤2制备产物PIP‑NM的核磁氢谱图；

[0074] 图4为本发明实施例1步骤2制备产物PIP‑NM的核磁碳谱图；

[0075] 图5为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM的高分辨率质谱图；

[0076] 图6为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM的核磁氢谱图；

[0077] 图7为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM的核磁碳谱图；

[0078] 图8为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM对MDA‑MB‑231细胞毒性的实验结果图；

[0079] 图9为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM对A549细胞毒性的实验结果图；

[0080] 图10为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM对786‑O细胞毒性的实验结果图；

[0081] 图11为本发明实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM对HepG2.2.15细胞毒性的实验结果图；

[0082] 图12为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后的细胞划痕实验结果图；其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄划痕区细胞的迁移情况图，B为对应数据图；

[0083] 图13为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后的Transwell细胞迁移与侵袭实验结果图；其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄Transwell细胞迁移图与侵袭
图，B为对应数据图；

[0084] 图14为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后的克隆实验结果图；其中图A为拍照图，B为对应数据图；

[0085] 图15为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后细胞周期图；

[0086] 图16为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后细胞凋亡情况图；

[0087] 图17为MDA‑MB‑231细胞经实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM孵育后的泳道蛋白的表达图。

具体实施方式

[0088] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

[0089] 实施例1

[0090] 一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，名称为双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑菲并[9,10‑d]咪唑‑2‑基)苯胺(PIP‑NM)，具有如式(Ⅰ)所示分子结构：

[0091]

[0092] 上述PIP‑NM的制备方法，包括如下步骤：

[0093] 步骤S1：4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛中间体(NM‑CHO)的合成

[0094] 向圆底烧瓶中加入干燥的DMF 102.2mmol(7.46g),于冰水浴中边搅拌边缓慢滴加POCl3 45.5mmol(6.97g),滴加完继续于冰浴中继续反应30min。接着加入N,N‑二(2‑羟乙
基)‑苯胺13.8mmol(2.50g)的DMF 13.8mmol(1.01g)溶液,于100℃反应3小时；冷却至室温
后，倒入到200mL的冰水中，搅拌下滴加1mol/L的NaOH，调至中性；抽滤后滤饼用少量冷的乙
醇：水＝1：1(V/V)混合液洗两次,最后用乙醇：二氯甲烷＝1：1(V/V)混合液重结晶,得浅黄
1
色固体,产率86％。图1为制备产物NM‑CHO的核磁共振氢谱图。由图1可得出以下信息：H 
NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ:9.72(s,1H,CHO)，7.75(d,J＝8.84,2H,ArH),6.93(d,J＝8.93,2H,
ArH),3.81(m,8H,CH2CH2Cl)；

[0095] 步骤S2：将NM‑CHO(2mmol)、9,10‑二氨基菲(2mmol)和对甲苯磺酸(0.2mmol)加入到DMF(14mL)中，加热到130℃反应6小时，反应完毕后将反应液加入到70mL冰水中，冷却后
离心，固体再加30mL水重悬并离心，去上清(重复两次)，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到化
合物PIP‑NM。流动相为二氯甲烷：甲醇＝40：1(V/V)。产率86％。图2至图4是产物的高分辨率
1
质谱、核磁共振氢谱图和碳谱图。由图2至图4可得出以下信息：H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:
13.22(s,1H,NH),8.87(d,J＝8.66Hz,2H,ArH),8.58(d,J＝7.02Hz,2H,ArH),8.18(d,J＝
8.94Hz,2H,ArH),7.74(t,J＝8.00Hz,2H,ArH),7.64(m,2H,ArH),7.00(d,J＝8.90Hz,2H,
13
ArH),3.86(m,8H,CH2CH2Cl)；C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:150.36,147.72,128.15,127.76,
127.42,125.33,124.30,122.29,119.36,112.34,52.41,41.64.HRMS(ESI)calcd for 
+
C25H22Cl2N3[M+H]434.1191,found 434.1193；反应方程式如下：

[0096]

[0097] 在实施例1的基础上，步骤2采用不同的反应温度，其它条件不变。所得结果如表1所示。

[0098] 表1步骤2采用不同的反应温度中反应，对产品收率的影响

[0099] a实施例编号 反应温度/℃ 产物收率/％
实施例2 110 45
实施例3 115 58
实施例4 120 82
实施例5 125 85
实施例6 135 83

[0100] a:分离产率，下同。

[0101] 在实施例1的基础上，步骤2采用不同酸催化，其它条件不变。所得结果如表2所示。

[0102] 表2步骤2采用不同酸催化对产品收率的影响

[0103] 实施例编号 催化剂 产物收率/％实施例7 乙酸 78
实施例8 丙酸 81

[0104] 在实施例1的基础上，采用不同的反应时间，其它条件不变。所得结果如表3所示。

[0105] 表3步骤2采用不同反应时间对产物收率的影响

[0106] 实施例编号 反应时间/小时 产物收率/％实施例9 4 80
实施例10 8 85
实施例11 10 86

[0107] 在实施例2的基础上，步骤2采用乙酸为溶剂，其它条件不变。所得结果如表4所示。

[0108] 表4步骤2采用乙酸为溶剂对产物收率的影响

[0109]实施例编号 溶剂 产物收率/％
实施例12 乙酸 31

[0110] 由上述结果得知，温度的对反应产率的影响较大，随着温度的上升，产率逐步上升，其中由115℃至120℃对应的产率变化较大(从58％至82％)。120℃至135℃对应的产率
基本变化不大，产率在82％～86之间。酸催化剂对产率的变化不明显，相对而言，对甲苯磺
酸催化效果稍微好一些。反应时间对反应产率的影响也不明显，反应4小时和反应10小时的
产率只相差6％。溶剂对产率的变化较为明显，以乙酸为溶剂时，产率只有31％，明显低于以
DMF为溶剂的产率(86％)。总体而言，在较优条件下，通过9,10‑二氨基菲的邻位二氨基与醛
的缩合制备产物，大体上都具有较高的产率。

[0111] 实施例13

[0112] 一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，名称为双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑菲并[9,10‑d]咪唑‑2‑基)苯胺(PIP‑NM)，具有如式(Ⅰ)所示分子结构：

[0113]

[0114] 上述PIP‑NM的制备方法，包括如下步骤：

[0115] 步骤S1：同实施例1的步骤1。

[0116] 步骤S2：将NM‑CHO(2mmol)、菲醌(2mmol)和乙酸铵(40mmol)加入到DMF(14mL)中，加热到130℃反应6小时，反应完毕后将反应液加入到75mL冰水中，冷却后离心，固体再加
30mL水重悬并离心，去上清(重复两次)，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到化合物PIP‑NM。流
动相为二氯甲烷：甲醇＝40：1(V/V)。产率49％；反应方程式如下：

[0117]

[0118] 在实施例13的基础上，步骤2采用不同的反应温度，其它条件不变。所得结果如表5所示。

[0119] 表5步骤2不同的反应温度对产品收率的影响

[0120]实施例编号 反应温度/℃ 产物收率/％
实施例14 110 38
实施例15 115 44
实施例16 120 43
实施例17 125 49
实施例18 135 48

[0121] 在实施例14的基础上，步骤2采用乙酸为溶剂，其它条件不变。所得结果如表6所示。

[0122] 表6步骤2以乙酸为溶剂对产品收率的影响

[0123]实施例编号 溶剂 产物收率/％
实施例19 乙酸 29

[0124] 由以上结果可知，温度的变化对产率有一定的影响，但不是特别明显。随着温度上升，产率也逐渐上升。110℃对应的产率为38％，温度上升到130度时，产率为49％，提高了
11％的产率。溶剂对产率影响较为明显，以乙酸为溶剂，产率仅有29％，而以DMF为溶剂，产
率为49％。总体而言，在较优条件下，用菲醌、乙酸铵和醛进行缩合反应制备产物，产率要与
比9,10‑二氨基菲与醛缩合的产率低一些。

[0125] 实施例20

[0126] 一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，名称为双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]邻菲罗啉‑2‑基)苯胺(PLIP‑NM)，具有如式(Ⅱ)所示分子结构：

[0127]

[0128] 上述PIP‑NM的制备方法，包括如下步骤：

[0129]

[0130] 步骤S1：同实施例1的步骤S1。

[0131] 步骤S2：将4‑[双(β‑氯乙基)氨基]苯甲醛(2mmol)、5,6‑二氨基‑1,10‑邻菲罗啉(2mmol)和乙酸(0.2mmol)加入到DMF(14mL)中，加热到130℃反应6小时，反应完毕后将反应
液加入到70mL冰水中，冷却后离心，固体再加30mL水重悬并离心，去上清(重复两次)，通过
硅胶柱色谱分离提纯，得到化合物PIP‑NM。流动相为二氯甲烷：甲醇＝40：1(V/V)。产率
85％。图5至图7是产物的高分辨率质谱、核磁共振氢谱图和碳谱图。由图5至图7可得出以下
1
信息：H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:13.68(s,1H,NH),9.01(dd,J＝1.60,4.26Hz,2H,ArH),
8.97(d,J＝8.83Hz,2H,ArH),8.14(d,J＝8.80Hz,2H,ArH),7.85(m,2H,ArH),6.94(d,J＝
13
8.85,2H,ArH),3.83(m,8H,CH2CH2Cl)；C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:151.96,148.04,147.59,
142.68,130.67,128.30,123.88,118.69,112.29,52.33,41.57.HRMS(ESI)calcd for 
+
C23H20Cl2N5[M+H]436.1096,found 436.1098。

[0132] 在实施例20的基础上，步骤2采用不同的反应温度，其它条件不变。所得结果如表7所示。

[0133] 表7步骤2采用不同的反应温度，对产品收率的影响

[0134]

[0135]

[0136] 在实施例20的基础上，步骤2采用不同酸催化，其它条件不变。所得结果如表8所示。

[0137] 表8步骤2采用不同酸催化对产品收率的影响

[0138]实施例编号 催化剂 产物收率/％
实施例26 乙酸 81
实施例27 丙酸 80

[0139] 在实施例20的基础上，采用不同的反应时间，其它条件不变。所得结果如表9所示。

[0140] 表9步骤2采用反应时间对产物收率的影响

[0141]实施例编号 反应时间/小时 产物收率/％
实施例28 4 85
实施例29 8 87
实施例30 10 84

[0142] 在实施例21的基础上，步骤2采用乙酸为溶剂，其它条件不变。所得结果如表10所示。

[0143] 表10步骤2采用乙酸为溶剂，反应的产物收率

[0144] 实施例编号 溶剂 产物收率/％实施例31 乙酸 31

[0145] 由上述结果得知，温度的对反应产率的影响较大，随着温度的上升，产率逐步上升，其中由110℃至115℃对应的产率变化较大(从52％至81％)。115℃至135℃对应的产率
基本变化不大，产率在81％～85％之间。酸催化剂对产率的变化不明显，但相对而言，乙酸
和丙酸的催化效果，稍微比对甲苯磺酸催化效果差一些。反应时间对反应产率的影响也不
明显，当反应达到4小时，产率已经达到85％，再加长反应时间，产率并无明显增加。以乙酸
为溶剂，产率仅有31％，明显低于以DMF为溶剂的产率(85％)。总体而言，通过9,10‑二氨基
菲的邻位二氨基与醛的缩合制备产物，大体上都具有较高的产率。

[0146] 实施例32

[0147] 一种含氮芥的咪唑并杂环衍生物，名称为双(β‑氯乙基)‑4‑(1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]邻菲罗啉‑2‑基)苯胺(PLIP‑NM)，具有如式(Ⅱ)所示分子结构：

[0148]

[0149] 上述PIP‑NM的制备方法，包括如下步骤：

[0150] 步骤S1：同实施例1步骤S1。

[0151] 步骤S2：NM‑CHO(2mmol)、1,10‑邻二氮杂菲‑5,6‑二酮(2mmol)和乙酸铵(40mmol)加入到DMF(14mL)中，加热反应6小时，反应完毕后将反应液加入到75mL冰水中，冷却后离
心，固体再加30mL水重悬并离心，去上清(重复两次)，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到化合
物PLIP‑NM。流动相为二氯甲烷：甲醇＝40：1(V/V)。产率50％；反应方程式如下：

[0152]

[0153] 在实施例32的基础上，步骤2采用不同的反应温度，其它条件不变。所得结果如表11所示。

[0154] 表11步骤2不同的反应温度对产品收率的影响

[0155]实施例编号 反应温度/℃ 产物收率/％
实施例33 110 39
实施例34 115 41
实施例35 120 43
实施例36 125 51
实施例37 135 49

[0156] 在实施例14的基础上，步骤2采用乙酸为溶剂，其它条件不变。所得结果如表12所示。

[0157] 表12步骤2以乙酸为溶剂对产品收率的影响

[0158]实施例编号 溶剂 产物收率/％
实施例38 乙酸 26

[0159] 由以上结果可知，温度的变化对产率有一定的影响，但不是特别明显。随着温度上升，产率也逐渐上升。变化相对较大的是120℃至125℃，由43％变成51％。提高了8％的产
率。再升高温度，产率并无明显提高。溶剂对产率影响较为明显，以乙酸为溶剂，产率仅有
26％，而以DMF为溶剂，产率为50％。总体而言，在较优条件下，用菲醌、乙酸铵和醛进行缩合
反应制备产物，产率要与比9,10‑二氨基菲与醛缩合的产率低一些。

[0160] 性能测试

[0161] 1、体外抗增殖活性

[0162] 用于测定细胞活性的一种高灵敏度比色检测法。待肿瘤细胞(MDA‑MB‑231、A549、3
786‑O和HepG2.2.15)处于对数生长期时，在96孔培养皿中种入约2×10 个细胞，待24小时
细胞贴壁后，每孔加入100μM含10％FBS的培养基稀释的不同浓度的药物，再次放入37℃培
养箱。待细胞加药培养72小时后，弃去96孔板内的培养基，每孔加入100μL CCK8试剂，继续
培养箱内孵育2小时。用酶标仪读取每孔OD450数值，以计算不同浓度药物处理后细胞的活
性改变。

[0163] 实施例20步骤2制备产物PLIP‑NM分别对MDA‑MB‑231细胞毒性实验结果见图8；A549细胞毒性实验结果见图9；786‑O细胞毒性实验结果见图10；HepG2.2.15细胞毒性实验
结果见图11。从图8‑11中可以看出，无论是PIP‑NM还是PLIP‑NM，随着化合物浓度的增加，其
对MDA‑MB‑231、A549、786‑O和HepG2.2.15这四种肿瘤细胞的抗增殖能力不断增加,均表现
出很好的抗增殖活性。其中，PIP‑NM对MDA‑MB‑231细胞的抗增殖活性稍弱，半抑制浓度
(IC50)值大于32μM，对A549、786‑O和HepG2.2.15细胞的IC50值分别为5.5μM、5.2μM和11.2μ
M，作用明显。PLIP‑NM对MDA‑MB‑231、A549和HepG2.2.15细胞的IC50分别为2.4μM、2.2μM和
9.9μM、对786‑O细胞的IC50半抑制率则远小于0.5μM，体现了该两个化合物很好的抗增殖活
性，并且PLIP‑NM比PIP‑NM的活性更强。

[0164] 2、细胞划痕实验

[0165] 模拟体外细胞伤口愈合的实验模型，用于检测贴壁生长肿瘤细胞(MDA‑MB‑231)的5
迁移及对划痕区修复能力。待肿瘤细胞处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10 个
细胞，待24小时细胞贴壁且融合度达70％‑80％后，用微量枪头在细胞生长的中央区域垂直
划线，用PBS清洗2次后重新添加细胞培养基，加入终浓度为5μM和10μM的化合物PLIP‑NM，孵
育48小时。使细胞继续生长至实验设定的时间。弃掉培养基，并加入Hoechst染料37℃孵育
染色20min，用PBS清洗2次后，在倒置荧光显微镜下拍摄划痕区细胞的迁移情况(图12A)。结
果如图12，从图12可以看出，经过48小时的爬行，MDA‑MB‑231细胞不加药组表现出较强的伤
口愈合能力，而加药组则明显抑制细胞的迁移和爬行，并随着浓度增加，划痕区愈合的能力
显著被抑制，表明化合物PLIP‑NM能有效抑制细胞的伤口愈合。

[0166] 3、Transwell细胞迁移

[0167] 验证经典的肿瘤细胞迁移作用，具有重复性强，容易量化的优点。待肿瘤细胞处于5
对数生长期时，以约5×10个细胞/皿的密度种入到6孔培养皿，待贴壁且融合度达70％‑
80％后，更换含有10％FBS的培养基，加入不同浓度的MDA‑MB‑231，孵育48小时后，吸弃培养
基，PBS清洗1次，用0.25％胰酶消化，以及PBS清洗1次，用不含血清的培养基重悬细胞。用细
胞计数板读取细胞悬液浓度，将5万个细胞种入孔径8μm的Transwell小室的上室，用无血清
培养基补齐体积至300μL。Transwell小室的下室加入10％FBS的培养基1mL，放入24孔板中
培养。24小时后取出Transwell小室，用甲醇固定15min，PBS清洗1次，结晶紫染色10min后，
再用PBS清洗1次，用棉签擦拭未穿过小室的细胞，在倒置显微镜下拍摄并计数已迁移的细
胞数目，如图13，从图13中可以看出，随着化合物PLIP‑NM浓度的增加(从5到10μM)，转移到
Transwell板上室下表面的细胞明显逐渐减少，当浓度为5μM时，转移的细胞只能不加药组
的大约一半。即约有一半的细胞的迁移被抑制了；10μM时，只有极少数的细胞迁移到
Transwell板上室下表面。这说明化合物PLIP‑NM可通过降低肿瘤细胞的迁移能力来发挥抗
肿瘤作用。

[0168] 4、细胞侵袭实验

[0169] 取Transwell小室，加入50ul 10％的基质胶至小室上层铺平，放入细胞培养箱中凝固24小时。取对数生长期的MDA‑MB‑231细胞，用PBS洗涤，用0.25％胰酶消化，以及PBS清
6
洗1次，接着用无血清培养基将细胞悬浮，调密度为10/mL。在24孔板下室加入1mL含10％的
FBS培养基，将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液300μL加入上室，放入培养箱中培
养24小时。24小时后取出Transwell小室，用甲醇固定15min，PBS清洗1次，结晶紫染色10min
后，再用PBS清洗1次，用棉签擦拭未穿过小室的细胞，在倒置显微镜下拍摄并计数已迁移的
细胞数目，结果见图13，从图13中可以看出，当PLIP‑NM浓度为5μM时，侵袭的细胞数是不加
药组的大约一半，亦即约有一半的细胞被抑制了；当PLIP‑NM浓度为10μM时，只有极少数的
细胞发生了侵袭，侵袭的细胞数不到对照组的1/10，这说明化合物PLIP‑NM有效降低肿瘤细
胞的侵袭能力来发挥抗肿瘤作用。

[0170] 5、克隆形成实验

[0171] 将处于对数生长期细胞传代之后种于六孔板中。待细胞贴壁后加入5μM和10μM的PLIP‑NM孵育48小时，并设置不加药组。弃去培养基，用PBS洗去多余的培养基，用胰酶消化
细胞，将各组细胞以800个/孔种于6孔板中，加入培养基孵育10‑14天。弃去培养基，用PBS洗
2次洗去多余的培养基，用甲醇室温固定30分钟，PBS洗去多余甲醇，再用结晶紫染液(1mM)
染色10分钟，PBS洗去多余染液，拍照，结果见图14，从图14可以看出，当浓度为5μM时，PLIP‑
NM处理的细胞克隆数为270，而化合物PLIP‑NM处理的细胞克隆数则大大减少，只有个别少
数的细胞可见。说明化合物PLIP‑NM对MDA‑MB‑231细胞具有较强的抗增殖作用。

[0172] 6、细胞周期实验

[0173] 采用流式细胞术研究了化合物PLIP‑NM诱导MDA‑MB‑231细胞的细胞周期阻滞情况，结果见图15可知，G1期的比例随着加药浓度的增加而增加。具体结果显示，不加药时，
G2/M期的比例占18.14％，当加入PLIP‑NM 5μM或10μM时，G2/M期的比例明显下降。说明化合
物PLIP‑NM可诱导MDA‑MB‑231细胞周期阻滞。

[0174] 7、细胞凋亡实验

[0175] 采用Annexin V FITC和PI双染色法测定化合物PLIP‑NM对MDA‑MB‑231细胞的凋亡效应。如图16，可知，0μM时，早期凋亡和晚期凋亡只占2.67％和2.73％。5μM时，早期凋亡和
晚期凋亡分别上升到9.54％和6.68％。当加药浓度为8μM时，早期凋亡和晚期凋亡进一步上
升到12.94％和11.19％。表明化合物PLIP‑NM通过诱导MDA‑MB‑231细胞进入早期和晚期凋
亡而抑制肿瘤生长。

[0176] 8、Western blot

[0177] Western blot又称蛋白质印迹法，通过半定量的方法检测细胞内蛋白含量的变5
化。待肿瘤细胞(A549)处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×10 个细胞，待细胞贴
壁且融合度达70‑80％后，更换含有10％FBS的培养基，加入一定浓度的药物L1，作用48小时
后，弃去培养基，用PBS清洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100ul，冰上裂解细胞
15min后。经高速离心15min去除不溶物，通过BCA法绘制标准品曲线，测定每个样品的蛋白
浓度并配平。加入含有SDS的缓冲液，100℃煮沸10min，使蛋白充分变性。在10％‑12％的
SDS‑PAGE胶中加入30ug蛋白/孔，经过100V 120min电泳后用湿式电转100V60min将蛋白转
至PVDF膜上。用5％BSA室温孵育PVDF膜，封闭1小时。加入一抗稀释液孵育过夜。用0.1％
TBST清洗3次后加入二抗稀释液孵育2小时，0.1％TBST清洗3次后，用ECL法在BIORAD凝胶成
像系统上检测每个泳道蛋白的表达，结果如图17，由图17可以看出，随着药物浓度的上升，
Cyclin A1、Cyclin B1、Cyclin E1和CDK1等蛋白表达量明显下降，进一步表明了PLIP‑NM诱
导了MDA‑MB‑231发生细胞周期阻滞。

[0178] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本
发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求
的保护范围之内。