螺环吲哚酮-吡咯烷碳酸酯化合物和其组合物、制备方法及用途转让专利
申请号 : CN202110644135.1
文献号 : CN113387957B
文献日 : 2022-08-09
发明人 : 肖飞 , 任红军 , 翁亚丽 , 苏斐 , 吴萌
申请人 : 江苏亚尧生物科技有限公司
摘要 :
本申请涉及螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其组合物、制备方法以及其具有抗肿瘤活性而作为抗癌药物的用途。所述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯类化合物结构式如下，其具有优异的肿瘤抑制活性，水溶解性好，毒性低，可用于静脉注射剂型。
权利要求 :
1.如下通式I所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐:在通式I中：
Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自H和卤素；
R1选自H、C1‑C5烷基和C1‑C5烷氧基；
R2选自H和C1‑C5烷基；
R3选自C1‑C10烷基和C2‑C10烯基；
R4选自C1‑C5烷基、苯基、卤素取代的C1‑C6烷基；
n为1至80的整数。
2.根据权利要求1所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，R3选自C1‑C6烷基和C2‑C6烯基。
3.根据权利要求2所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，所述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物具有如下通式II所示的结构：其中，Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R4和n的定义如权利要求1所述。
4.根据权利要求3所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自H、F和Cl。
5.根据权利要求4所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，R1选自H、C1‑C3烷基和C1‑C3烷氧基；R2选自氢；和/或R4选自C1‑C5烷基、苯基、卤素取代的C1‑C6烷基。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至60的整数。
7.根据权利要求6所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至50的整数。
8.根据权利要求7所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至40的整数。
9.根据权利要求8所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至30的整数。
10.根据权利要求9所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至20的整数。
11.根据权利要求10所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至10的整数。
12.根据权利要求11所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为1至5的整数。
13.根据权利要求12所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，n为或1至4的整数。
14.根据权利要求1所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，其特征是，所述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物选自如下化合物：外消旋2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯外消旋2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯
2,5,8,11,14‑五氧代十六烷‑16‑基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰基‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯Chiral‑2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯Chiral‑2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯
15.一种抗肿瘤药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1至14中任一项所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐和可药用辅料。
16.根据权利要求15所述的抗肿瘤药物组合物，其特征是，所述组合物为注射剂、片剂或胶囊剂。
17.权利要求1至14中任一项所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备治疗癌症药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤、骨髓瘤和骨肉瘤。
19.一种权利要求1至14所述的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物的制备方法，包括：如下通式III所示的螺环吲哚酮类化合物与如下通式IV所示的化合物，在碱存在下进行亲核取代反应，得到所述螺环吲哚酮聚乙二醇碳酸酯类化合物，其中，Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R3、R4和n的定义如权利要求1至14中所述。
说明书 :
螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物和其组合物、制备方法及
用途
技术领域
[0001] 本申请属于药物领域，涉及螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物和其组合物、制备方法及其制备抗癌药物的用途。
背景技术
[0002] 癌症威胁着人类的健康和生命。近年来，抗癌药物的研究已经转向特异性的分子靶向治疗药物的研制。
[0003] 肿瘤抑制蛋白p53在防止肿瘤发展中很关键。在约50％的人类癌症中编码p53蛋白的基因发生突变或缺失，导致转录活性和肿瘤抑制蛋白的功能失活。在其余50％的情况中，p53与人鼠双微体2(MDM2)蛋白之间的直接作用在抑制野生型p53功能中起主要作用。用小分子干预MDM2‑p53之间的相互作用，已经被认为是一种新的癌症治疗策略。
[0004] 自2005年，王少萌等报道了一系列的螺‑吲哚酮类似物作为MDM2‑p53相互作用的抑制剂，在这一系列化合物中的一个化合物(SAR405838/MI‑77301)目前进入临床开发中(参见US7759383B2,US8222288B2,US8680132B2,US20130030173A1,WO2012065022A2以及WO2012155066A2)。瑞士罗氏制药公司也报道了一系列的螺‑吲哚酮类似物(参见
WO2011067185,WO2011134925以及WO2012022707)和一系列的吡咯烷类似物(参见
WO2013178570，WO2014206866以及WO2015000945)，其中吡咯烷类似物中的RG7388进入临床开发中。这些化合物被证实溶解性受到限制，从而在体内和临床研究中稳定制剂的开发会面临重大挑战。
WO2011067185,WO2011134925以及WO2012022707)和一系列的吡咯烷类似物(参见
WO2013178570，WO2014206866以及WO2015000945)，其中吡咯烷类似物中的RG7388进入临床开发中。这些化合物被证实溶解性受到限制，从而在体内和临床研究中稳定制剂的开发会面临重大挑战。
[0005] 现有化合物由于水溶性不好，目前只能用于口服制剂，由于具有严重胃肠道效应，生物利用度不高，体内稳定性不足，对野生型p53肿瘤缺少选择性，影响临床肿瘤的治疗效果；另一方面，MDM2蛋白水平负反馈性表达上调，是限制第一代(例如nutlin‑3)和第二代(例如RG‑7388)MDM2抑制剂长期药效学活性的一个重要原因。
[0006] 因此，需要开发水溶解性好、毒性低、稳定性更高的、对野生型p53肿瘤具有高度选择性的，更好的长期体内活性的，可用于静脉注射剂型且活性更高的螺环‑吲哚酮类似物作为MDM2‑p53相互作用的抑制剂。
发明内容
[0007] 发明概述
[0008] 本申请的目的在于提供一种螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，上述物质至少具有以下之一的优点：水溶解性好、毒性低、可用于注射剂型、对野生型p53肿瘤具有高度选择性、具有抗肠道酶的水解作用的优异稳定性。本申请化合物还具备以下优点：具有MDM2拮抗、下调双重功能，具有更优的长期活性和体内活性。
[0009] 本申请的另一目的在于提供上述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物的制备方法。
[0010] 本申请的还一目的在于提供一种抗肿瘤药物组合物。
[0011] 本申请的再一目的在于提供上述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备治疗癌症药物中的用途。
[0012] 本申请的又一目的在于提供一种治疗癌症的方法。
[0013] 根据本申请的一个方面，本申请提供如下通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐：
[0014]
[0015] 在通式(I)中：
[0016] Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自H和卤素；
[0017] R1选自H、C1‑C5烷基和C1‑C5烷氧基；
[0018] R2选自H和C1‑C5烷基；
[0019] R3选自C1‑C10烷基(如C1‑C6烷基)和C2‑C10烯基(如C2‑C6烯基)；
[0020] R4选自C1‑C5烷基、芳基(如苯基)、卤素(如氟)取代的烷基(如C1‑C6烷基)；
[0021] n为1至80，例如1至60的整数，1至50的整数、1至10的整数、1至5的整数、1至4的整数。
[0022] 根据本申请的另一个方面，本申请提供的上述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物的制备方法包括：如下通式(III)所示的螺环吲哚酮化合物与如下通式(IV)所示的化合物，在碱存在下进行亲核取代反应，得到如式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯类化合物，[0023]
[0024] 其中，Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R3、R4和n的定义如上所述。
[0025] 根据本申请的又一个方面，本申请提供的抗肿瘤药物组合物包含治疗有效量的上述通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐和一种或多种可药用辅料。
[0026] 根据本申请的再一个方面，本申请提供通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备治疗癌症的药物中的用途。
[0027] 根据本申请的另一个方面，本申请提供一种治疗癌症的方法，其包括向癌症患者给予治疗有效量的通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐。本申请的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐具有优异的肿瘤抑制活性，水溶解性好，毒性低，尤其适于制备成静脉注射剂型。
[0028] 发明详述
[0029] 本申请的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐，在优选的实施方案中，所述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物为如下通式(II)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物：
[0030]
[0031] 其中，Y1、Y2、Y3、Y4、R1和n的定义如上所述。
[0032] 在一些实施方案中，
[0033] Y1、Y2、Y3和Y4各自独立地选自H、F和Cl；
[0034] R1选自C1‑C5烷氧基，例如为甲氧基或乙氧基，尤其是甲氧基；
[0035] n优选为1至60的整数，例如可以为1至50的整数、2至50的整数、1至10的整数、1至5的整数、1至4的整数。
[0036] 根据本申请的通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物可以表现出互变异构现象或结构同分异构现象。这表明本申请包括这些化合物的任意互变异构形式或结构同分异构形式，或者它们的混合物，并且不限于以上结构式所呈现的任一种互变异构形式或结构同分异构形式。
[0037] 根据本申请的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物可药用盐，是指该化合物与合适的无毒有机酸或无机酸形成的酸加成盐，或者与合适的无毒有机碱或无机碱形成的碱加成盐。
[0038] 本申请提供的抗肿瘤药物组合物包含治疗有效量的上述通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐和可药用辅料。本申请的抗肿瘤药物组合物根据需要可以制成注射液、片剂、胶囊剂及其他剂型。根据所述抗肿瘤药物组合物要制备的剂型，所述可药用辅料可以适当地从常规辅料中选择。例如，当要制备成注射冻干品时，所述可药用辅料可以包括赋形剂和稀释剂等。
[0039] 本申请提供通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备治疗癌症药物中的用途。
[0040] 本申请提供了一种治疗癌症的方法，向癌症患者给予治疗有效量的通式(I)所示的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物、其立体异构体或其可药用盐。
[0041] 本申请所述的癌症包括但不限于乳腺癌、肾癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、卵巢癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤、骨髓瘤和骨肉瘤等。
[0042] 本申请的化合物可以通过任意常规适宜的方式给药，包括口服给药、静脉注射、局部注射。本申请治疗有效量的化合物是指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长患者的存活时间的化合物的量。
[0043] 本申请的化合物的治疗有效量或剂量可在宽的范围内变化且可按本领域已知的方式来确定。上述剂量将根据每种特定情况下的个体需要来调整，包括所给药的具体化合物、给药途径、所治疗的病症及所治疗的患者。通常，当口服或胃肠外给药于体重为约70kg的成人时，约10mg至约10,000mg且优选为约200mg至约1,000mg的每日剂量应该是合适的，在需要时也可超过所述上限。每日剂量可按单一剂量或分份剂量来给药，或对于胃肠外给药，每日剂量可按连续输注形式来给药。
[0044] 本申请提供的螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物的制备方法包括：如下通式(III)所示的螺环吲哚酮化合物与如下通式(IV)所示的化合物，在碱存在下进行亲核取代反应，得到所述螺环吲哚酮‑吡咯烷碳酸酯化合物，
[0045]
[0046] 其中，Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R3、R4和n的定义如上所述。
[0047] 其中通式(III)所示的螺环吲哚酮化合物，可以参照WO2011/067185A1和WO2011/134925A1中描述的方法制备。
[0048] 通式(IV)所示的化合物，作为举例，例如，可以按照如下相应反应来制备：
[0049]
[0050] 术语定义
[0051] 除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。
[0052] 化学术语
[0053] 本文单独或组合使用的术语“烷基”是指任选取代的直链或任选取代的支链的脂肪族烃类。本文定义的基团，如“烷基”出现数字范围时，例如“C1‑C10烷基”，是指可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子或10个碳原子构成的烷基。本文的烷基实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、2‑甲基‑l‑丙基、2‑甲基‑2‑丙基、2‑甲基‑1‑丁基、3‑甲基‑l‑丁基、2‑甲基‑3‑丁基、2,2‑二甲基‑1‑丙基、2‑甲基‑1‑戊基、3‑甲基‑1‑戊基、4‑甲基‑l‑戊基、2‑甲基‑2‑戊基、3‑甲基‑2‑戊基、4‑甲基‑2‑戊基、2,2‑二甲基‑l‑丁基、3,3‑二甲基‑1‑丁基、2‑乙基‑1‑丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基和己基，以及更长的烷基基团，如庚基和辛基等。
[0054] 本文单独或组合使用的术语“烷氧基”是指烷基醚基(O‑烷基)，烷基的定义同上。烷氧基的非限定性实施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。
[0055] 本文单独或组合使用的术语“烯基”是指任选取代的直链或任选取代的支链的一价烃基，其具有一个或多个C＝C双键。所述烯基具有但不限于2‑约10个碳原子，例如，具有2‑约10个碳原子，或具有2‑约8个碳原子，2‑约6个碳原子，2‑约4个碳原子。这些基团中的双键可以为顺式或反式构象，并应被理解为包含所述两种异构体。实施例包括但不限于乙烯基(CH＝CH2)、1‑丙烯基(CH2CH＝CH2)、异丙烯基(C(CH3)＝CH2)、丁烯基和1,3‑丁二烯基等。本文定义的烯基出现数字范围时，例如“C2‑C6烯基”或“C2‑6烯基”是指可由2个碳原子、
3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子构成的烯基。
3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子构成的烯基。
[0056] 本文单独或组合使用的术语“卤素取代”是指任选被取代的基团(如烷基)的其中一个或多个氢原子被替换成氟、氯、溴、碘原子或其组合。
[0057] 本文单独或组合使用的术语“芳基”是指任选取代的芳香烃基，其具有6‑约20个，如6‑12个或6‑10个成环碳原子。其可以是稠合芳环或非稠合芳环。稠合芳环包含2‑4个芳环稠合的环，其它独立环可以为脂环、杂环、芳环、芳香杂环或其任意组合。本文中的芳基包括单环、双环、三环或更多环的芳基。单环芳基的非限定性实施例包括6至约12个、6至约10个或6至约8个成环碳原子的单环芳基，例如苯基；稠合环芳基包括双环、三环或更多环的芳基，如萘基、菲基、蒽基、薁基；非稠合的双芳基包括联苯基。
[0058] 本文单独或组合使用的“卤素”选自氟、氯、溴和碘。
[0059] 本文所用术语“可药用盐”是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。可药用盐是指把母体化合物中的碱性基团或酸性基团转换成盐的形式。例如碱性基团例如胺(氨)基的无机或有机酸盐类，酸性基团例如羧基与金属离子形成盐。本申请的可药用盐还包括用有机酸/无机酸形成的酸式盐，以及用有机碱/无机碱形成的碱式盐。另外，当通式化合物的碱性官能团是吡啶或咪唑(但不限制于吡啶或咪唑)，酸性官能团是羧酸(但不限制于羧酸)时就会形成两性离子(内盐)，内盐也包括在本申请中的盐内。
[0060] 本文的“立体异构体”包括所有立体异构体，如对映异构体和非对映异构体。本申请的含有不对称取代碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。本文所述化合物可具有一个或多个立体异构中心，且各个异构中心可以以R或S构型或其组合的形式存在。
[0061] 本申请化合物还包括互变异构体形式。互变异构体形式来源于一个单键与相邻的双键交换并一起伴随一个质子的迁移。
[0062] 药学术语
[0063] 某些药学术语本文所用的术语“患者”、“受试者”是指患有疾病、病症或病况等的个体，包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实施例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，非人的灵长类动物(例如黑猩猩和其它猿类和猴)；家畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一些实施方式中，所述哺乳动物为人。
[0064] 本文所用的术语“治疗”和其它类似的同义词包括缓解、减轻或改善疾病或病症症状，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，使疾病或病症好转，缓解由疾病或病症导致的症状，或者中止疾病或病症的症状，预防其它症状，改善或预防导致症状的潜在代谢原因，此外，该术语包含预防的目的。该术语还包括获得治疗效果和/或预防效果。所述治疗效果是指治愈或改善所治疗的潜在疾病。此外，对与潜在疾病相关的一种或多种生理症状的治愈或改善也是治疗效果，例如尽管患者可能仍然受到潜在疾病的影响，但观察到患者情况改善。就预防效果而言，可向具有患特定疾病风险的患者施用所述组合物，或者即便尚未做出疾病诊断，但向出现该疾病的一个或多个生理症状的患者施用所述组合物。
[0065] 本文所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种活性物质(如本申请的化合物)的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开化合物的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。
[0066] 本文所用术语“给予”、“施用”、“给药”等是指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、外用和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本文所述化合物和方法的施用技术。
[0067] 本文所用术语“可药用辅料”是指不影响本申请化合物的生物活性或性质的物质，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用。所述可药用辅料包括但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。
附图说明
[0068] 图1是实施例11制备的化合物的1H NMR谱图；
[0069] 图2是实施例11制备的化合物的13C NMR谱图；
[0070] 图3是实施例11制备的化合物的高分辨质谱谱图；
[0071] 图4显示本申请化合物较稳定，具有抗水解作用；
[0072] 图5示出本申请化合物对p53野生型肿瘤细胞中p53蛋白水平的影响；
[0073] 图6示出本申请化合物对p53突变型肿瘤细胞中的p53蛋白表达水平的影响；
[0074] 图7示出本申请化合物对多种p53野生型肿瘤细胞增殖活性的影响；
[0075] 图8示出本申请化合物对p53突变型肿瘤细胞增殖活性的影响。
[0076] 图9示出本申请化合物体内抑制肿瘤生长的活性。
具体实施方式
[0077] 下面通过实施例具体地说明本申请，然而本申请的范围不局限于这些实施例。
[0078] 实施例1：中间体4‑氨基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯的合成
[0079]
[0080] 在0℃下向3‑甲氧基苯甲酸甲酯(83.0g，500mmol)在H2SO4(70wt％，200ml)的溶液中滴加HNO3(65wt％，40ml)，所得到的混合物搅拌过夜，然后倒入冰水中。过滤这样得到的混合物，所得固体饼块用水洗涤(3×300ml)，得到84.4g黄色固体4‑硝基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯，产率80％。
[0081] 4‑硝基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(84.4g,400mmol)在乙醇(1500ml)中的溶液在Pd/炭(10％Pd，5.35g)催化剂存在下在H2气氛下搅拌5小时，然后该反应液通过 硅藻土过滤除去催化剂，溶剂在真空下挥发掉，得到灰白色固体，该灰白色固体用甲醇重结晶，得到
4‑氨基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(70.95g,392mmol)，产率98％。
4‑氨基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(70.95g,392mmol)，产率98％。
[0082] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.55(dd,J＝8.2Hz,1.4Hz,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,1H),6.65(d,J＝8.0Hz,1H),4.22(s,2H),3.90(s,3H),3.86(s,3H)；
[0083] MS：C9H12NO3([M+H]+)计算值:182，实测值:182。
[0084] 实施例2：中间体4‑(2‑((叔‑丁氧羰基)氨基)乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯的合成
[0085]
[0086] 2‑((叔‑丁氧羰基)氨基)乙酸(8.75g,50mmol)、Et3N(60mmol)在二氯甲烷(DCM)(150ml)和乙酰氯(60mmol)中的溶液在室温下在N2气氛下搅拌1小时，然后将4‑氨基‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(9.05g,50mmol)在乙醇(100ml)中的溶液加入进去，所得混合物搅拌过夜。然后，向反应液中加入200ml水，用DCM萃取该反应混合物(2×150ml)，合并有机层，并用水洗涤，用Na2SO4干燥，而后真空除去溶剂，所得残余物利用硅胶柱层析法进行纯化，得到
12.0g白色固体目标化合物，产率70％。
12.0g白色固体目标化合物，产率70％。
[0087] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.59(s,1H),8.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(s,1H),5.30(s,1H),3.96(d,J＝5.2Hz,2H),3.91(s,3H),3.89(s,3H),1.48(s,
9H)；
9H)；
[0088] MS：C16H23N2O6([M+H]+)计算值:339，实测值:339.2。
[0089] 实施例3：中间体4‑(2‑氨基乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯盐酸盐的合成
[0090]
[0091] 4‑(2‑((叔‑丁氧羰基)氨基)乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(11.83g，35mmol)和浓盐酸(7.0ml)在乙酸乙酯(100ml)中的溶液在室温下搅拌过夜，然后过滤该反应液，所得滤饼用乙酸乙酯(2×50ml)洗涤，而后干燥，得到白色固体4‑(2‑氨基乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯盐酸盐6.562g，产率69％。
[0092] 1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.03(s,1H),8.49(s,3H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝1.2Hz,1H),3.90(s,5H),3.83(s,3H)；
[0093] MS：C11H15N2O4([M‑HCl+H]+)计算值:239，实测值:239。
[0094] 实施例4：中间体(E)‑4‑(2‑((3,3‑二甲基亚丁基)氨基)乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯的合成
[0095]
[0096] 在室温下向4‑(2‑氨基乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯盐酸盐(6.56g,24mmol)在MTBE(甲基叔丁基醚)(100ml)中的悬浮液加入三乙胺(5ml)，在搅拌1小时后，滴加3,3‑二甲基正丁醛(2.64g,26.4mmol)，得到的混合物在室温下搅拌10小时。然后，将该反应混合液过滤，以除去三乙胺盐酸盐，并用MTBE洗涤该固体滤饼(3×30ml)，合并的有机相在真空下蒸发掉有机溶剂，得到粘稠油状物，不经纯化直接用于下一步。
[0097] 实施例5：中间体(E)‑6‑氯‑3‑(3‑氯‑2‑氟苯亚甲基)二氢吲哚‑2‑酮的合成[0098]
[0099] 在哌啶(1ml)存在下，6‑氯二氢吲哚‑2‑酮(8.35g,50mmol)和3‑氯‑2‑氟苯甲醛(8.295g,52.5mmol)在回流下搅拌6小时，然后过滤反应悬浮液，收集得到的固体用甲醇洗涤，并进行干燥，得到黄色固体(E)‑6‑氯‑3‑(3‑氯‑2‑氟苯亚甲基)吲哚‑2‑酮产物(14.63g,47.5mmol)，产率95％。
[0100] 1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.85(s,1H),7.70(q,J＝7.3Hz 2H),7.54(s,1H),7.36(t,J＝8Hz 1H),7.16(d,J＝8Hz 1H),6.92‑6.86(m,2H)；
[0101] MS：C15H9Cl2FNO([M+H]+)计算值:308，实测值:308.0。
[0102] 实施例6：中间体外消旋‑4‑((2'S,3'R,4'S,5'R)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氧代螺[二氢吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑5'‑甲酰胺基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯的合成[0103]
[0104] 在1,8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯(7ml)存在下，(E)‑4‑(2‑((3,3‑二甲基亚丁基)氨基)乙酰氨基)‑3‑甲氧基苯甲酸甲酯(24mmol)和(E)‑6‑氯‑3‑(3‑氯‑2‑氟苯亚甲基)二氢吲哚‑2‑酮(24mmol)在60ml甲苯(toluene)中的溶液搅拌过夜，然后加入100ml水，所得到的混合物用乙酸乙酯萃取(2×150ml)，合并有机层，并用水洗涤该有机层，再用Na2SO4干燥，真空下除去溶剂，所得到的残余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到13.9g黄色固体的目标化合物，产率92％。
[0105] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.65(s,1H),8.49(d,J＝8Hz 1H),7.94(s,1H),7.66(dd,J＝8.6Hz J＝1Hz 1H),7.57(s,1H),7.51(t,J＝6.8Hz 1H),7.28(s,1H),7.16(t,J＝
7.4Hz 1H),7.07(dd,J＝8.2Hz J＝1.4Hz 1H),6.92(t,J＝8Hz 1H),6.73(d,J＝1.2Hz
1H),4.69(t,J＝8.8Hz 1H),4.44(d,J＝9.2Hz 1H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.65(t,J＝
10.4Hz 1H),3.29(t,J＝10.8Hz1H),1.38‑1.28(m,1H),0.96(s,9H),0.92(s,1H)(参见图
1)；
7.4Hz 1H),7.07(dd,J＝8.2Hz J＝1.4Hz 1H),6.92(t,J＝8Hz 1H),6.73(d,J＝1.2Hz
1H),4.69(t,J＝8.8Hz 1H),4.44(d,J＝9.2Hz 1H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.65(t,J＝
10.4Hz 1H),3.29(t,J＝10.8Hz1H),1.38‑1.28(m,1H),0.96(s,9H),0.92(s,1H)(参见图
1)；
[0106] MS：C32H33Cl2FN3O5([M+H]+)计算值:628，实测值:628.2。
[0107] 实施例7：中间体1‑氯乙基(2‑(2‑羟基乙氧基)乙基)碳酸酯的合成
[0108]
[0109] 2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙烷‑1‑醇(6.0g,50mmol)和1‑氯乙基氯甲酸酯(1‑chloroethyl carbonochloridate)(7.455g,52.5mmol)的溶液在Et3N(4.04g,52.5mmol)存在下，在室温下搅拌6小时；然后向其中加入200ml水，用DCM萃取该反应混合物(2×150ml)，合并有机层，并用水洗涤，再用Na2SO4干燥，真空下除去溶剂，所得到的残余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到8.475g油状目标化合物，产率75％。
[0110] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.41(q,J＝5.7Hz 1H),4.37‑4.32(m,2H),3.73(t,J＝4.8Hz,2H),3.66‑3.62(m,2H),3.56‑3.52(m,2H),3.37(s,3H),1.81(d,J＝6.4Hz,3H)。
[0111] 实施例8：如下结构式化合物(4‑((2'S,3'R,4'S,5'R)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氧代螺[二氢吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑5'‑甲酰胺基)‑3‑甲氧基苯甲酸‑(R)‑N,N‑二甲基‑1‑苯基‑1‑乙胺盐，R‑amine salts)的合成
[0112]
[0113] 将外消旋‑4‑((2'S,3'R,4'S,5'R)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氧代螺[二氢吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑5'‑甲酰胺基)‑3‑甲氧基苯甲酸(4.0g,6.5mmol，参照实施例8合成第一步)与(R)‑N,N‑二甲基‑1‑苯基‑1‑乙胺(1.12克，7.49mmol，(R)‑N,N‑dimethyl‑1‑phenylethan‑1‑amine)的混合物分散在乙酸乙酯中加热至60摄氏度并在该温度下搅拌2个小时，然后冷却至常温并搅拌过夜。析出的固体过滤并用冷的乙酸乙酯洗涤，干燥后得到R‑amine盐4‑((2'S,3'R,4'S,5'R)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氧代螺[二氢吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑5'‑甲酰胺基)‑3‑甲氧基苯甲酸‑(R)‑N,N‑二甲基‑1‑苯基‑1‑乙胺盐(2.0克)，为白色固体。
[0114] 1H NMR(d6‑DMSO，400MHz):δ10.75(s,1H),10.47(s,1H),8.38(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.61(t,J＝7.0Hz,1H),7.55‑7.58(m,2H),7.37(t,J＝7.4Hz,1H),
7.25‑7.33(m,4H),7.22(t,J＝6.8Hz,1H),7.17(t,J＝8.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),
6.67(s,1H),4.67(t,J＝7.6Hz,1H),4.47(d,J＝9.6Hz,1H),3.90(s,3H),3.65‑3.90(m,
1H),3.20‑3.40(m,2H),2.08(s,6H),1.29‑1.32(m,1H),1.26(d,J＝6.8Hz,3H),0.91(s,
9H),0.76(d,J＝14Hz,1H)(参见图3)。
7.25‑7.33(m,4H),7.22(t,J＝6.8Hz,1H),7.17(t,J＝8.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),
6.67(s,1H),4.67(t,J＝7.6Hz,1H),4.47(d,J＝9.6Hz,1H),3.90(s,3H),3.65‑3.90(m,
1H),3.20‑3.40(m,2H),2.08(s,6H),1.29‑1.32(m,1H),1.26(d,J＝6.8Hz,3H),0.91(s,
9H),0.76(d,J＝14Hz,1H)(参见图3)。
[0115] 实施例9：如下结构式化合物(2′S，3′R，4′S，5′R)‑6‑氯‑4′‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2′‑(2,2‑二甲基丙基)‑2‑氧代‑1,2‑二氢螺环‑[吲哚‑3,3′‑吡咯烷]‑5′‑羧酸(4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)胺的合成
[0116]
[0117] R‑amine盐4‑((2'S,3'R,4'S,5'R)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氧代螺[二氢吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑5'‑甲酰胺基)‑3‑甲氧基苯甲酸‑(R)‑N,N‑二甲基‑1‑苯基‑1‑乙胺盐(1.37g，2.0mmol)和CDI(648mg，4.0mmol)在THF(15mL)中在室温下搅拌1.5小时，加入氨水(1.0mL)继续搅拌30分钟。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩。所得悬浮液用正庚烷稀释并过滤，滤饼用正庚烷洗涤并干燥得到酰胺目标产物(1.10g,产率90％)，该产物为白色固体。
[0118] 实施例10：如下结构式化合物2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯的合成
[0119]
[0120] (2′S，3′R，4′S，5′R)‑6‑氯‑4′‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2′‑(2,2‑二甲基丙基)‑2‑氧代‑1,2‑二氢螺环‑[吲哚‑3,3′‑吡咯烷]‑5′‑羧酸(4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)酰胺(612mg,
1.0mmol)溶于DMF(100mL)，随后加入无水KCO3(4.0mmol)并滴加1‑氯乙基(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基)碳酸酯(904mg，4.0mmol)常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物(644mg,产
1
率：85％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.59(s,1H)，8.47(d,J＝8.4Hz,
1H),7.80(d,J＝1.6Hz,1H),7.55(d,J＝1.3Hz,1H),7.48(t,J＝6.8Hz,1H),7.28‑7.36(m,
2H),7.19‑7.26(m,2H),7.04(t,J＝8.0Hz),6.05‑6.55(bs,1H),5.30‑5.80(bs,1H),4.70(t,J＝9.62Hz,1H),4.40‑4.54(m,3H),3.94(s,3H),3.83(t,J＝4.7Hz,2H),3.62‑3.74(m,
3H),3.60(t,J＝4.6Hz,2H),1.24‑1.35(m,1H),0.96(s,9H)；HRMS(ESI‑TOF):m/z
+ +
calculated for C37H41Cl2FN4NaO8[M+Na]:781.2183,found:781.2190.
1.0mmol)溶于DMF(100mL)，随后加入无水KCO3(4.0mmol)并滴加1‑氯乙基(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基)碳酸酯(904mg，4.0mmol)常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物(644mg,产
1
率：85％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.59(s,1H)，8.47(d,J＝8.4Hz,
1H),7.80(d,J＝1.6Hz,1H),7.55(d,J＝1.3Hz,1H),7.48(t,J＝6.8Hz,1H),7.28‑7.36(m,
2H),7.19‑7.26(m,2H),7.04(t,J＝8.0Hz),6.05‑6.55(bs,1H),5.30‑5.80(bs,1H),4.70(t,J＝9.62Hz,1H),4.40‑4.54(m,3H),3.94(s,3H),3.83(t,J＝4.7Hz,2H),3.62‑3.74(m,
3H),3.60(t,J＝4.6Hz,2H),1.24‑1.35(m,1H),0.96(s,9H)；HRMS(ESI‑TOF):m/z
+ +
calculated for C37H41Cl2FN4NaO8[M+Na]:781.2183,found:781.2190.
[0121] 实施例11：如下结构式化合物2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑
2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯的合成
2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯的合成
[0122]
[0123] (2′S，3′R，4′S，5′R)‑6‑氯‑4′‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2′‑(2,2‑二甲基丙基)‑2‑氧代‑1,2‑二氢螺环‑[吲哚‑3,3′‑吡咯烷]‑5′‑羧酸(4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)酰胺(612mg,
1.0mmol)溶于DMF(100mL)，随后加入无水KCO3(4.0mmol)并滴加2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷‑1‑醇(1.08g,4.0mmol)，常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物(642mg,产
1
率：80％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.6(s,1H),8.45(d,J＝8.0Hz,
1H),7.8(s,1H),7.55(s,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.35(t,J＝8.0Hz,2H),7.20‑7.40(m,
2H),7.04(t,J＝8.0Hz,1H),6.1‑6.6(bs,1H),5.4‑5.8(bs,1H),4.69(t,J＝10,1H),4.40‑
4.55(m,3H),3.04(s,3H),3.83(t,J＝4,2H),3.69‑3.77(m,4H),3.62‑3.69(m,4H),3.50‑
13
3.58(m,2H),3.36(s,3H),3.18‑3.30(m,1H),1.24‑1.36(m,1H),0.95(s,9H)；C NMR
(CDCl3，100MHz):174.41,171.63,168.82,157.69,155.21,149.52,148.46,140.10,
134.91,130.57,130.01,128.73,127.35,125.51,124.81(Jc‑F＝4.3Hz),123.62,123.36,
121.40(d,J＝19Hz),119.95,118.22,116.15,109.98,72.01,70.83,70.81,70.68,68.61,
68.06,66.60,66.57,65.51,59.12,55.76,50.96,42.79,30.45,29.89；HRMS(ESI‑TOF):m/z + +
calculated for C39H45Cl2FN4NaO9[M+Na]:825.2445,found:825.2456.
1.0mmol)溶于DMF(100mL)，随后加入无水KCO3(4.0mmol)并滴加2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷‑1‑醇(1.08g,4.0mmol)，常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物(642mg,产
1
率：80％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.6(s,1H),8.45(d,J＝8.0Hz,
1H),7.8(s,1H),7.55(s,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.35(t,J＝8.0Hz,2H),7.20‑7.40(m,
2H),7.04(t,J＝8.0Hz,1H),6.1‑6.6(bs,1H),5.4‑5.8(bs,1H),4.69(t,J＝10,1H),4.40‑
4.55(m,3H),3.04(s,3H),3.83(t,J＝4,2H),3.69‑3.77(m,4H),3.62‑3.69(m,4H),3.50‑
13
3.58(m,2H),3.36(s,3H),3.18‑3.30(m,1H),1.24‑1.36(m,1H),0.95(s,9H)；C NMR
(CDCl3，100MHz):174.41,171.63,168.82,157.69,155.21,149.52,148.46,140.10,
134.91,130.57,130.01,128.73,127.35,125.51,124.81(Jc‑F＝4.3Hz),123.62,123.36,
121.40(d,J＝19Hz),119.95,118.22,116.15,109.98,72.01,70.83,70.81,70.68,68.61,
68.06,66.60,66.57,65.51,59.12,55.76,50.96,42.79,30.45,29.89；HRMS(ESI‑TOF):m/z + +
calculated for C39H45Cl2FN4NaO9[M+Na]:825.2445,found:825.2456.
[0124] 实施例12：如下结构式化合物2,5,8,11,14‑五氧代十六烷‑16‑基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰基‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯的合成
[0125]
[0126] (2′S，3′R，4′S，5′R)‑6‑氯‑4′‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2′‑(2,2‑二甲基丙基)‑2‑氧代‑1,2‑二氢螺环‑[吲哚‑3,3′‑吡咯烷]‑5′‑羧酸(4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)酰胺(306mg,
0.5mmol)溶于DMF(50mL)，随后加入无水KCO3(2.0mmol)并滴加1‑氯乙基(2,5,8,11,14‑五氧代十六烷‑16‑基)碳酸酯(0.72g,2.0mmol)，常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物
1
(352mg,产率：79％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.56(s,1H),8.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝1.7Hz,1H),7.54(d,J＝1.3Hz,1H),7.49(t,J＝6.8Hz,1H),7.20‑
7.40(m,4H),7.00‑7.15(m,1H),6.30‑6.60(m,1H),5.19(bs,1H),4.71(t,J＝9.4Hz,1H),
4.40‑4.60(m,2H),4.25‑2.34(m,1H),3.93(s,3H),3.83(t,J＝4.6Hz,2H),3.78(s,1H),
3.60‑3.75(m,16H),3.50‑3.58(m,2H),3.35‑3.40(m,4H),1.20‑1.37(m,1H),0.86‑1.08(m,+
10H)；HRMS(ESI‑TOF):m/z calculated for C43H53Cl2FN4NaO11[M+Na]:913.2970,found:
913.2975.
0.5mmol)溶于DMF(50mL)，随后加入无水KCO3(2.0mmol)并滴加1‑氯乙基(2,5,8,11,14‑五氧代十六烷‑16‑基)碳酸酯(0.72g,2.0mmol)，常温搅拌过夜。反应完成后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取。分离有机相，依次用盐水、1M的稀盐酸和水洗涤，然后浓缩过柱得目标产物
1
(352mg,产率：79％)，该产物为白色固体。H NMR(CDCl3，400MHz):10.56(s,1H),8.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝1.7Hz,1H),7.54(d,J＝1.3Hz,1H),7.49(t,J＝6.8Hz,1H),7.20‑
7.40(m,4H),7.00‑7.15(m,1H),6.30‑6.60(m,1H),5.19(bs,1H),4.71(t,J＝9.4Hz,1H),
4.40‑4.60(m,2H),4.25‑2.34(m,1H),3.93(s,3H),3.83(t,J＝4.6Hz,2H),3.78(s,1H),
3.60‑3.75(m,16H),3.50‑3.58(m,2H),3.35‑3.40(m,4H),1.20‑1.37(m,1H),0.86‑1.08(m,+
10H)；HRMS(ESI‑TOF):m/z calculated for C43H53Cl2FN4NaO11[M+Na]:913.2970,found:
913.2975.
[0127] 试验性实施例
[0128] 实施例13本申请化合物水溶性的改善作用
[0129] 实验目的
[0130] 考察本申请化合物通过聚乙二醇碳酸酯结构对螺环吲哚酮化合物的水溶性的改善作用。
[0131] 实验方法
[0132] 精密称取30.00mg rac‑SIP(rac‑spiroindolinone pyrrolidinecarboxamide，Org.Process Res.Dev.2013；17(2):247‑256)对照品，置于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，制备成3.00mg/ml的rac‑SIP母液，低温避光保存备用。
[0133]
[0134] 色谱条件：Iinertsil ODS‑3色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈‑20％磷酸溶液(40∶60，V/V)；流速为1ml/min；检测波长为286nm；进样量为20μl；温度为室温。在此色谱条件下，取适当浓度的rac‑SIP对照品溶液进样测定，rac‑SIP峰的保留时间为4.5min，其杂质对主峰测定无干扰。
[0135] 精密量取rac‑SIP对照品母液于10ml的容量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀即得浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μg/ml的系列标准溶液。按照前述色谱条件检测，记录2
峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)作图进行回归，得回归方程(Y＝89.12X+0.2189(r ＝
0.9996)，根据此方程计算样品浓度。
峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)作图进行回归，得回归方程(Y＝89.12X+0.2189(r ＝
0.9996)，根据此方程计算样品浓度。
[0136] 将过量的rac‑SIP，2‑PEG‑rac‑SIP(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯)(见实施例10),3‑PEG‑rac‑SIP(2‑(2‑(2‑甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基(2'S，3R，4'S，5'R)‑5'‑((4‑氨甲酰‑2‑甲氧基苯基)氨甲酰基)‑6‑氯‑4'‑(3‑氯‑2‑氟苯基)‑2'‑新戊基‑2‑氢螺环[吲哚‑3,3'‑吡咯烷]‑1'‑碳酸酯)(见实施例11)分别置具塞试管中，加入适量的水中，超声至不再溶解，放入振荡器(100r/min)中，(25±1)℃振摇24h，待溶解平衡后，取出各化合物的饱和溶液，置于离心机，10 000r/min离心10min，精密吸取上清液，用乙腈定量稀释后进样测定，由rac‑SIP标准曲线近似计算不同衍生物在水中溶解度。
[0137] 实验结果
[0138] 溶解度试验结果表明，rac‑SIP在水中的溶解度极低(<0.1mg/ml)，几乎不溶解；而2‑PEG‑rac‑SIP(即实施例10的化合物)溶解度>0.4mg/ml，3‑PEG‑rac‑SIP(即实施例11的化合物)溶解度>3mg/ml，可以得出结论：随着PEG(即‑CH2‑CH2‑O‑)长度增加，溶解性也变得更好。
[0139] 实施例14本申请化合物具有较稳定的抗水解作用
[0140] 本申请化合物作为聚乙二醇碳酸酯化合物，其在体内代谢的稳定性是发挥生物活性的关键基础，为了研究本申请化合物的肠道代谢情况，本研究以3‑PEG‑rac‑SIP(实施例11的化合物)为例，利用人肠微粒体模拟化合物的肠代谢过程。具体操作步骤如下：孵育液总体积为200μL,以5mmol/LK2HPO4缓冲液(pH 7.4)为基质配制,其中含有终质量浓度为
0.2g/L(蛋白含量)的人肠微粒体及10μmol/L 3‑PEG‑rac‑SIP。在37℃水浴中预孵育5min后加入同样经预孵育5min的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)溶液(终浓度为
1mmol/L)启动反应,在反应终点加入含有200μg/L内标的乙腈溶液200μL混合以终止反应。
将终止后的孵育样品震荡2min,在4℃、14 000r·min‑1离心10min,LC‑MS法定量检测3‑PEG‑rac‑SIP的剩余量。校正组为不加NADPH的微粒体反应组。试验结果显示，将3‑PEG‑rac‑SIP与人肠微粒体共孵育2h后，图4显示体系中仍有超过75％的原体药物，表明本申请化合物3‑PEG‑rac‑SIP较稳定，具有抗各种肠道酶的水解作用。
0.2g/L(蛋白含量)的人肠微粒体及10μmol/L 3‑PEG‑rac‑SIP。在37℃水浴中预孵育5min后加入同样经预孵育5min的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)溶液(终浓度为
1mmol/L)启动反应,在反应终点加入含有200μg/L内标的乙腈溶液200μL混合以终止反应。
将终止后的孵育样品震荡2min,在4℃、14 000r·min‑1离心10min,LC‑MS法定量检测3‑PEG‑rac‑SIP的剩余量。校正组为不加NADPH的微粒体反应组。试验结果显示，将3‑PEG‑rac‑SIP与人肠微粒体共孵育2h后，图4显示体系中仍有超过75％的原体药物，表明本申请化合物3‑PEG‑rac‑SIP较稳定，具有抗各种肠道酶的水解作用。
[0141] 实施例15本申请化合物可上调p53野生型肿瘤细胞中p53蛋白水平。
[0142] 作为设计中的MDM2‑p53相互作用拮抗剂，理论上rac‑SIP、3‑PEG‑rac‑SIP可以通过拮抗MDM2功能，从而上调细胞中p53蛋白表达水平。本申请选择了p53基因野生型的前列腺癌细胞系LNCaP细胞，在蛋白水平验证了该类化合物对LNCaP细胞中p53蛋白表达水平的5
影响。具体操作步骤如下：将2.0×10 个/mL的LNCaP细胞悬液，按照每孔2ml接种于6孔板中。所用培养基为含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基；细胞在37摄氏度二氧化碳恒温培养箱培养。细胞培养48小时后加药，溶剂组加入4μL DMSO，其他组根据每孔的设定相应加入4μL不同终浓度的化合物。继续培养24小时后将培养基吸出，每孔加入60μL的RIPA裂解液，将裂解液转移至1.5ml EP管中冰上裂解30分钟，每管加入15μL的5X蛋白上样缓冲液(loading buffer)，100摄氏度金属浴煮30分钟。SDS‑PAGE凝胶电泳分离，Western Bloting检测p53与MDM2的表达量。图5A为rac‑SIP在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。图5B为3‑PEG‑rac‑SIP在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。图5C为对照药品RG‑7388在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。
影响。具体操作步骤如下：将2.0×10 个/mL的LNCaP细胞悬液，按照每孔2ml接种于6孔板中。所用培养基为含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基；细胞在37摄氏度二氧化碳恒温培养箱培养。细胞培养48小时后加药，溶剂组加入4μL DMSO，其他组根据每孔的设定相应加入4μL不同终浓度的化合物。继续培养24小时后将培养基吸出，每孔加入60μL的RIPA裂解液，将裂解液转移至1.5ml EP管中冰上裂解30分钟，每管加入15μL的5X蛋白上样缓冲液(loading buffer)，100摄氏度金属浴煮30分钟。SDS‑PAGE凝胶电泳分离，Western Bloting检测p53与MDM2的表达量。图5A为rac‑SIP在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。图5B为3‑PEG‑rac‑SIP在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。图5C为对照药品RG‑7388在蛋白水平对LNCaP细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。
[0143] 试验结果显示，在所选取的浓度区间范围内，该类化合物均可以剂量依赖性的上调LNCaP细胞中p53蛋白的表达水平，与对照药物RG‑7388相比，具有同等效力。在本试验中，经过给药24h后，该类化合物在低剂量下可以升高MDM2蛋白水平，随着给药浓度升高，MDM2蛋白水平出现下降，而对照药物RG‑7388处理下，MDM2蛋白水平随着给药浓度的升高而不断增加，表明本申请化合物对下调MDM2的潜力优于RG‑7388。MDM2蛋白水平负反馈性表达上调，是限制第一代(例如nutlin‑3)和第二代(例如RG‑7388)MDM2抑制剂长期药效学活性的原因之一，本申请化合物对MDM2蛋白的下调作用使得其具有MDM2拮抗、下调双重功能，因此能够克服传统MDM2抑制剂的不足之处，使得其可能具有更优的长期活性和体内活性。
[0144] 实施例16本申请化合物对p53突变型肿瘤细胞中的p53蛋白表达水平无影响。
[0145] 实施例15已经证实本申请化合物可以激活p53基因野生型肿瘤细胞系中p53蛋白水平，为了检测该类化合物对于激活p53的选择性，本申请接下来在p53基因突变型的肿瘤细胞系DU145细胞中检测了化合物3‑PEG‑rac‑SIP对于突变型p53蛋白影响情况。采用与实施例15中相同的操作方法，本实验利用Western blot方法检测了不同浓度的3‑PEG‑rac‑SIP对DU145细胞中p53蛋白和MDM2蛋白水平的影响。图6为3‑PEG‑rac‑SIP在蛋白水平对DU145细胞内源性p53蛋白与MDM2蛋白水平的影响。
[0146] 试验结果显示，在所选取的浓度区间范围内，3‑PEG‑rac‑SIP对DU145细胞中的p53蛋白水平几乎没有影响，即3‑PEG‑rac‑SIP无法激活突变型p53，表明该类化合物对野生型p53肿瘤细胞具有高度的选择性，从而避免产生非特异性毒性，并有助于临床治疗中选择该类化合物的目标患者，从而实现对肿瘤患者的精准治疗。
[0147] 实施例17本申请化合物可抑制多种p53野生型肿瘤细胞的增殖活性。
[0148] 将约0.5‑1.0×104个/mL的细胞悬液，按照每孔200μL接种于96孔板中。铺板24小时后，每孔加入DMSO或不同浓度的测试药物1μL，继续培养72小时。每孔加入20μL MTT试剂，继续在二氧化碳恒温培养箱中孵育4h，最后将培养基吸出，每孔加入100μL异丙醇，在96孔板震荡器上震荡混匀10分钟，用Enspire 2300多功能酶标仪在570nM波长下测定其吸光度值。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，数据以DMSO组的值为参比进行了百分化处理。图7为本申请化合物对p53野生型肿瘤细胞的增殖抑制IC50。
[0149] 本实验的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。异丙醇能溶解细胞中的甲瓒，用多功能酶标仪在570波长处测定甲瓒的光吸收值，可间接反映活细胞数量。
实验结果显示，化合物rac‑SIP、2‑PEG‑rac‑SIP(实施例10化合物)、3‑PEG‑rac‑SIP(实施例
11化合物)和5‑PEG‑rac‑SIP(实施例12化合物)对各种p53野生型肿瘤细胞系(检测细胞包含前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病)均具有较强的增殖抑制活性，体外活性检测结果表明该类化合物可作为潜在的肿瘤治疗药物。
实验结果显示，化合物rac‑SIP、2‑PEG‑rac‑SIP(实施例10化合物)、3‑PEG‑rac‑SIP(实施例
11化合物)和5‑PEG‑rac‑SIP(实施例12化合物)对各种p53野生型肿瘤细胞系(检测细胞包含前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病)均具有较强的增殖抑制活性，体外活性检测结果表明该类化合物可作为潜在的肿瘤治疗药物。
[0150] 实施例18本申请化合物抑制p53突变型肿瘤细胞的增殖活性较弱。
[0151] 根据前述内容，DU145细胞是一种p53野生型的肿瘤细胞系，而另一种前列腺癌细胞系PC‑3则是p53基因缺失的肿瘤细胞系。采用与实施例17中相同的操作方法，本实验利用MTT法检测了不同浓度的化合物对DU145细胞和PC‑3细胞增殖的影响情况。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，数据以DMSO组的值为参比进行了百分化处理。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图8)。图8为本申请化合物对p53突变型
和p53缺失型肿瘤细胞DU145和PC‑3细胞的增殖影响情况。
和p53缺失型肿瘤细胞DU145和PC‑3细胞的增殖影响情况。
[0152] 实验结果显示，rac‑SIP和3‑PEG‑rac‑SIP与对照药品RG‑7388抑制DU145和PC‑3细胞增殖的IC50全部高于10μM，与对p53野生型肿瘤细胞系的增殖抑制IC50相比，本申请化合物对p53突变或缺失的肿瘤细胞增殖抑制活性较弱。进一步说明本申请化合物是通过激活p53来发挥肿瘤抑制活性。结合实施例17中的实验结果，我们可以得出结论，本申请化合物是野生型p53高度选择性的肿瘤抑制剂，更适用于p53基因没有突变的肿瘤患者的治疗。
[0153] 实施例19本申请化合物可在体内抑制肺癌裸鼠异种移植肿瘤生长。
[0154] 在实施例17中，本申请化合物3‑PEG‑rac‑SIP表现出了对于多种p53野生型肿瘤细胞系的体外增殖抑制活性，为了评价本申请化合物对于p53野生型肿瘤的体内抑制活性，我们选择了表达野生型p53蛋白的NCI‑H460人肺癌细胞系，构建了肺癌裸鼠异种移植模型，用以评价本申请化合物的体内抑瘤活性。具体操作如下：收集培养的人肺癌细胞NCI‑H460细7
胞悬液，浓度为1*10 个/ml，以每只0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100‑150mm3时将动物随机分组，每组8只。同时，各组裸鼠开始给药，其中3‑PEG‑rac‑SIP 30mg/kg组每日腹腔注射200微升药物溶液，空白对照组每日腹腔注射200微升溶剂，每隔1日使用测量瘤径的方法，动态观察3‑PEG‑rac‑SIP的抗肿瘤效应，每隔1日测量小鼠体重。连续给药1个月，实验结束后，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。
胞悬液，浓度为1*10 个/ml，以每只0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100‑150mm3时将动物随机分组，每组8只。同时，各组裸鼠开始给药，其中3‑PEG‑rac‑SIP 30mg/kg组每日腹腔注射200微升药物溶液，空白对照组每日腹腔注射200微升溶剂，每隔1日使用测量瘤径的方法，动态观察3‑PEG‑rac‑SIP的抗肿瘤效应，每隔1日测量小鼠体重。连续给药1个月，实验结束后，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。
[0155] 图9中的实验结果显示，相比于空白对照组，每日给药30mg/kg 3‑PEG‑rac‑SIP可以显著抑制NCI‑H460肿瘤的生长增殖，在连续给药30天后，抑瘤率为73.3％。此外，每日给药30mg/kg 3‑PEG‑rac‑SIP对于小鼠体重几乎没有影响，表明本申请化合物3‑PEG‑rac‑SIP体内毒性小，具有应用于临床治疗肿瘤患者的潜力。