单克隆抗体32C7及其制备方法和用途转让专利
申请号 : CN202110940792.0
文献号 : CN113388030B
文献日 : 2021-11-23
发明人 : 朱永群 , 邓凯
申请人 : 上海浙江大学高等研究院
摘要 :
权利要求 :
1.单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,其含有重链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6;和轻链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12,所述单克隆抗体32C7或其抗原结合片段能够特异性结合刺突蛋白的表位。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,其能够特异性结合刺突蛋白的表位,其中,所述表位选自刺突蛋白的第345、346、347、348、349、351、
352、354、440、441、442、443、444、445、448、450、451、452、466、499、509位的氨基酸残基,或者所述表位选自刺突蛋白的第T345、R346、F347、S349、N440、L441、K444、N450、Y351和Y451,以抑制或阻断所述刺突蛋白与受体的结合。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,其表现出对刺突蛋白的受体结构域小于120 nM的Kd。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体具有SEQ ID NO:14所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:17所示的轻链可变区氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,其重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO.:2、4、6所示的抗原互补决定区且与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80%的同一性;和其轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO.:8、10、12所示的抗原互补决定区且与SEQ ID NO:17所示序列具有至少80%的同一性。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段,其特征在于,其中所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv‑Fc片段或单链抗体ScAb。
7.一种用于制备治疗或者预防新型冠状病毒感染的组合物,其包含根据权利要求1‑6任一项所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段。
8.一种核酸分子,其特征在于,其编码根据权利要求1‑6任一项所述的单克隆抗体32C7或其抗原结合片段。
9.一种载体,其特征在于,其包含权利要求8所述的核酸分子。
10.一种细胞系,其特征在于,其能够产生根据权利要求1‑6任一项所述的单克隆抗体
32C7或其抗原结合片段。
11.一种单克隆抗体32C7或其抗原结合片段的制备方法,其特征在于,所述方法包括培养根据权利要求10所述的细胞系,从而产生所述单克隆抗体。
12.根据权利要求1‑6任一项所述的抗体32C7或其抗原结合片段在制备用于治疗或者预防新型冠状病毒感染的药物或试剂中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其特征在于,所述的新型冠状病毒包括原始株Original病毒株及其突变病毒株,所述突变病毒株包括B.1.351、B.1.1.7、P1、B.1.617.2。
说明书 :
单克隆抗体32C7及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
细胞。因此,以刺突蛋白RBD结构域为靶点的抗体在对抗当前的大流行中尤为重要。
SARS‑CoV‑2分离株,包括D614G变异体,而无抗体依赖性增强效应,其阻断受体结合域与血
管紧张素转换酶2(ACE2)受体的相互作用区域。此外,在三种动物模型(雪貂、仓鼠和恒河
猴)中评估了CT‑P59的治疗效果,其能够降低病毒滴度。
病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原。
发明内容
原结合片段具有广泛的应用前景。具体如下。
442、443、444、445、448、450、451、452、466、499、509位的氨基酸残基的表位,或者所述表位
选自刺突蛋白的第T345、R346、F347、S349、N440、L441、K444、N450、Y351和Y451,以抑制或阻
断所述刺突蛋白与受体的结合。
ID NO:6;和
段、单链可变片段scFv、scFv‑Fc片段或单链抗体ScAb。
克隆抗体,其中所述细胞包含根据本发明第五方面所述的载体。
的用途,优选地,所述的新型冠状病毒包括但不限于原始株Original病毒株,英国突变病毒
株B.1.1.7,南非突变病毒株B.1.351和B.1.617.2(印度Delta德尔塔毒株)。
或试剂。
显著的抑制效果,而且对突变病毒株同样具有很好地中和抑制效果,这表明,相对于现有的
代表性抗体来说,本发明的抗体具有优异的效果和应用前景。此外,动物模型实验进一步证
明,本发明的抗体能够大大降低SARS‑CoV‑2的病毒滴度,而且相关炎症因子明显减少,炎性
浸润情况明显得到改善。本发明人进一步对抗体和RBD结合的结构进行了表征,惊奇地发
现,本发明的抗体避开了目前新冠病毒突变株的突变位点,使得其对于多种突变株都有很
好的抑制效果。
附图说明
依次为120、60、30、15和7.5,单位为nM;图1的B部分显示了抗体32C7可以剂量依赖的抑制多
种亚型的SARS‑CoV‑2突变株的感染。
症因子的表达量;图2的C部分是小鼠肺部病理变化。
病毒S蛋白结合的抗原表位。
具体实施方式
更详细的描述。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或
条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版
社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得
的常规产品。
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时,以本说明书的内容为准。
述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限
可独立地包括或排除在范围内。当与数值相连使用时,术语“约”、“大约地”或“大约”旨在包
括数值的集合或范围。例如,“约X”包括为X的±20%、±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±
0.2%或±0.1%的数值范围,其中X为数值。在一个实施方案中,术语“约”指的是比特定值多
或少5%的数值范围。在另一个实施方案中,术语“约”指的是比特定值多或少2%的数值范围。
在另一个实施方案中,术语“约”指的是比特定值多或少1%的数值范围。
白。因此,术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、
“冠状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用,是指本
文的抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白(例如,2019‑nCoV S蛋白、SARS‑CoV S蛋
白),由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒S蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
群组成且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。本发明的抗体特异性结合的
表位优选为选自刺突蛋白的第345、346、347、348、349、351、352、354、440、441、442、443、
444、445、448、450、451、452、466、499、509位的氨基酸残基。优选地,其特异性结合刺突蛋白
的T345、R346、F347、S349、Y351、N450、Y451、N440、L441和K444中的至少一种表位。
应”意指抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应且不与其他多肽反应或以低得多
的亲和力(Kd)结合。本发明的抗体表现出对刺突蛋白的受体结构域小于120 nM的Kd。优选
地,其具有对刺突蛋白的受体结构域小于80 nM的Kd,例如70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、
20nM、10nM,甚至小于8nM,例如7nM,甚至小于5nM的Kd。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合
抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、scFvs。优选地,本发明的抗体
为单克隆抗体或其抗原结合片段。
链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区包含框架区(FR)和互补决
定区(CDR)。四个FR是相对保守的,而CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)包含高变区。抗体结构单
元已知一般包含四聚体。每个四聚体由两个相同多肽链对构成,每对具有一条轻链和一条
重链。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可
变区。每条链羧基端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。FR和CDR从NH2端至COOH端
如下排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用
的结合结构域。此外,所述恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。抗体恒定
区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖
于抗体的细胞毒性(ADCC)或补体介导毒性(CDC)。通常,抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE及
IgD,其彼此间因存在于分子中的重链的性质而不同。
CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化会产生两个相同的“Fab”片段或抗原结合片段(每个具有单
个抗原结合位点)和一个残余的“Fc”片段(其名称反映了它的容易结晶的能力)。抗体的胃
蛋白酶处理会产生F(ab’)2片段,其具有两个抗原结合位点且其保留它的交联抗原的能力。
两个结构域的折叠导致六个高变环(三个环各自来自H和L链)的形成,它们促进用于抗原结
合的氨基酸残基并给所述抗体赋予抗原结合特异性。但是,即使单个可变区(或仅包含三个
对抗原特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力,尽管以较低亲和力。“单链
Fv”(“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽
还可以包含在VH和VL结构域之间的多肽接头,其使sFv能够形成期望的结构用于抗原结合。
体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗
原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或
重组工程细胞培养获得,不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,
是从均一的抗体群中获得的,但这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
的”核酸、肽和蛋白因而包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语也包括通过在宿
主细胞中的重组表达而制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸和/或多肽。
轻链的V区中三个高度趋异段(被称为“高变区”)被插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧
翼段之间。因此,术语“FR”指的是在免疫球蛋白高变区之间和相邻的天然发现的氨基酸序
列。在抗体分子中,轻链的三个高变区与重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置
而形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补,且重链及轻链各自的
三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
可以解离常数(Kd)表达,其中较小的Kd代表较高的亲和力。“亲和力”是指分子(例如抗体)
的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另
有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互
作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(Kd)来表
述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括现有技术已知以及本文中所描述的
那些。
结构域与该表位结合时,比它结合到随机的、不相关的表位更容易,其被称为“特异性结合”
该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如,
可以认为抗体“A”比抗体“B”对特定表位具有更高的特异性,或者可以认为抗体“A”以比结
合相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
的方法得到,并都包括在本发明的范围内。本领域技术人员利用用于生产变体多肽的重组
方法和/或合成化学技术可以修改多肽的氨基酸序列。例如,可以使用氨基酸置换得到具有
进一步提高的亲和力的抗体。可选地,可以使用核苷酸序列的密码子优化来提高在用于生
产抗体的表达系统中的翻译效率。这样的变体抗体序列与在本发明中列举的序列具有80%
或更高的(即,85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)序列同一性。相对于在本发
明中列举的序列,计算所述序列同一性。或进行最佳比对时,如通过程序GAP或使用默认值
间隙权重的BESTFIT。
置总数×100),其中需考虑产生两序列的最优比对需要引入的缺口数和每个缺口的长度。
可以使用数学算法完成序列的比较和两序列间百分比同一性的测定。可以使用E.Meyers和
W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11‑17(1988))测定两氨基酸序列间的百分比同
一性。此外,可以使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444‑453(1970))测定两
氨基酸序列间的百分比同一性。
其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或其修饰,且
经过修饰的抗体保留本发明抗新型冠状病毒抗体的期望的功能特性。
保守氨基酸取代而不同。本发明的抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的
保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。
组为丝氨酸及苏氨酸;具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺;具有芳香族侧
链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和
组氨酸;以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组
为:缬氨酸‑亮氨酸‑异亮氨酸、苯丙氨酸‑酪氨酸、赖氨酸‑精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸‑
天门冬酸和天冬酰胺‑谷氨酰胺。因此,可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本
发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
期保守氨基酸取代。保守取代是氨基酸家族中发生的那些,其与他们的侧链相关。遗传编码
的氨基酸通常被分为以下家族:(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性氨基酸为赖氨
酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨
酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝
氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、
组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、
甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其他族包括(i)丝氨酸及
苏氨酸,其为脂肪族‑羟基家族;(ii)天冬酰胺及谷氨酰胺,其为含酰胺家族;(iii)丙氨酸、
缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸,其为脂肪族家族;和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸,其为芳香
族家族。例如,合理预期以异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸分离取代、以谷氨酸对天冬氨酸分离
取代、以丝氨酸对苏氨酸分离取代或以结构相关的氨基酸类似取代氨基酸将不会对所得分
子的结合或特性具有重大影响,特别是如果取代不涉及框架位置中的氨基酸。氨基酸改变
是否导致功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的特异性活性进行确定。测定方法不特别
限定,可通过本领域已知方法进行测定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过
本领域技术人员容易地制备。优选片段或类似物的氨基‑和羧基‑端发生在功能域边界附
近。结构域和功能域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或私人序列数据库比
较来鉴定。优选地,使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或预测的蛋白质构形域(其发生
在已知结构和/或功能的其他蛋白质中)。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是
已知的。
此类似物的物化或功能特性。类似物可以包括除了天然发生的肽序列以外的序列的各种突
变蛋白。例如,单一或多氨基酸取代(优选地保守氨基酸取代)可在天然发生的序列中进行
(优选地在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。保守氨基酸取代不应实质上改变
亲代序列的结构特征(例如:取代氨基酸不应当趋于破坏亲代序列中发生的螺旋,或中断表
征亲代序列的其他类型的二级结构)。
介导的诱变来导入突变。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加
或缺失,但是优选为取代。此外,CDR区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五
个。
处理、CsCl分带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术纯化除
去其它细胞组分或其它污染物,例如其它细胞核酸或蛋白质时,核酸是“分离的”。本发明的
核酸可以是例如DNA或RNA,而且可以含有或不含内含子序列。在优选的实施方案中,核酸是
cDNA分子。
少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列
的核酸。优选地,所述编码序列由SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11所示的序列组成。
抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中,将编码VL或VH的DNA片段可操作地连
接至编码另一蛋白质,诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在
用于本文时旨在表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在
同一读码框中(in‑frame)。
域已知的。
本领域已知的。
75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少
98%、或至少99%或更大的序列同一性。这样的连续序列可以编码CDR序列,或可以编码完
整可变区。如本领域已知的,可变区序列可以与任何适当的恒定区序列融合。如本领域技术
人员所理解,通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等,可以适当地调节这些
值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应同一性。
发明的碱基序列进行偏好性改造。密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。
员所理解,许多载体可供用在抗体的重组生产中。载体组分通常包括但不限于以下的一种
或多种:信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
程改造的合适的限制位点使得任何VH或VL序列可容易地插入并表达。所得的嵌合抗体可结
合到任何强启动子,包括逆转录病毒LTR,例如,SV‑40早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒LTR和莫
洛尼氏鼠白血病病毒LTR。同样地,可使用天然Ig启动子等。
疱疹病毒载体诸如:单纯疱疹I病毒(HSV)载体。具体载体的选择将取决于靶细胞和所处理
的条件。导入可通过标准技术例如,感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例
如,裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE聚葡糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染、细胞显微注射和病
毒载体。
虫细胞、哺乳动物细胞等。将用于本发明抗体生产的、用上述表达或克隆载体转化的宿主细
胞在适当修饰的常规营养物培养基中培养,用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望
序列的基因。使用本领域普通技术人员已知的纯化技术,可以纯化从所述细胞制备的抗体。
(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物受试者。优选地,所述受试者是人类。
从在其中使用所述术语的上下文显而易见,受试者和患者表示易于被冠状病毒感染的受试
者或患者和/或被冠状病毒感染的受试者或患者。
的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果,包括症状的缓解、疾病
程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和
以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延
长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人,以及那些容易患有病症或
紊乱的人,或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
合部分与其他物质偶联而成,所述其他物质包括细胞毒素、药物、放射性毒素。
春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素
D、1‑去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素,及其类
似物或同系物。
美法仑、卡莫司汀和洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺
式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔
比星)、抗生素类(例如放线菌素D)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂
剂(例如长春新碱和长春碱)、duocarmycin、加利车霉素、美登素和auristatin,及其衍生
物。
在某些实施方案在,其能够治疗或者预防新冠病毒感染引起的呼吸系统损伤。将抗体制剂,
优选地为具有对其标靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体,施用至受试者并且通常因其
与靶标结合而将具有效果。抗体的施用可以降低、拮抗、中和、消除或抑制或干扰靶标与其
天然结合的内源性配体的结合。
吸收延迟剂、等等生理学相容的载体。本发明的药物还可以以联合疗法施用,即联合其它治
疗剂及其药剂。此类治疗剂包括任何抗感染活性剂、小分子药物,包括但不限于瑞德西韦、
利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。
该量的相应受试者相比,引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量,或者
使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的
量。通常,本文中的有效量根据各种因素而变化,所述因素例如给定的药物或化合物、药学
制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等,但仍然可以由本领域技术人员
常规地确定。本发明的化合物的有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法
容易地确定。
Original病毒株、B.1.351、B.1.1.7、P1、B.1.617.2等突变病毒株。更具体地,所述突变病毒
株具有选自下述的突变:B.1.1.7 (N501Y); B.1.351 (K417N,E484K,N501Y); P1 (K417T,
E484K,N501Y); B.1.617.2 (L452R,T478K)。
体轻链基因;
序而获得,并通过IMGT网站(http://www.imgt.org)分析得出重链基因及轻链基因对应的
可变区序列。抗体32C7具有SEQ ID NO:13所示的重链可变区核酸序列,SEQ ID NO:14所示
的重链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:15所示的重链恒定区氨基酸序列;SEQ ID NO:16
所示的轻链可变区核酸序列,SEQ ID NO:17所示的轻链可变区氨基酸序列以及SEQ ID NO:
18所示的轻链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO:5所示的CDR3区域核苷酸序列,SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。抗体32C7具有
如SEQ ID NO:7所示的轻链CDR1区域核苷酸序列,SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;SEQ ID
NO:9所示的CDR2区域核苷酸序列,SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;SEQ ID NO:11所示的
CDR3区域核苷酸序列,SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
合,亲和常数达到1.00×10。其解离常数为1.09×10 ,通过分析和计算二者之间的平衡解
‑8
离常数为1.09×10 。说明单克隆抗体32C7和新冠病毒的RBD结构域之间具有很高的亲和
力,并且解离的十分缓慢。
基200 μL。
果,其IC50分别为4.588 ng/mL,和127.6 ng/mL。对于新型冠状病毒南非突变株501Y.V2,中
和抗体32C7仍然具有一定的中和效果,其IC50为1.42 μg/mL。然而目前已经公布的代表性的
抗体CC12.1和REGN10987针对于D614G突变株的IC50分别是22 ng/mL和19.4 ng/mL,他们对
于南非突变株中和效果很微弱。CV07‑270的IC50是82.3 ng/mL。
~
移液枪采用滴鼻方式感染4×10 PFU 的 SARS‑CoV‑2病毒液。
90%。同时,如图2中B所示,抗体32C7处理后肺部相关炎症因子的表达也明显减少。如图2中C
所示,肺部的验证浸润情况也得到改善。综上所述,抗体32C7在SARS‑CoV‑2转基因小鼠模型
上仍然具有优秀的保护效果,明显地抗病毒能力。
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基中培养,温度为37℃。当细胞密度达到2×10个/ mL时,在PEI:DNA质量比为3:1,每升培
养1mg DNA的情况下,用25‑kDa线性聚乙烯亚胺将S‑2P和S‑6P质粒瞬时转染HEK293F细胞。
收集细胞培养上清,10000×g离心30分钟。使用HisPurTM钴树脂和StrepTactin树脂纯化分
泌的S‑2P和S‑6P蛋白。采用Superose 6 10/300色谱柱,在含有20 mM HEPES pH 7.2、150
mM NaCl和10%海藻糖的缓冲液中进行纯化。木瓜蛋白酶在含20 mM HEPES pH 7.2、150 mM
NaCl、5 mM EDTA和5 mM l ‑半胱氨酸的缓冲液中,37℃消化40 min后获得抗体32C7的Fab
区。所得Fab用脱盐柱纯化l ‑半胱氨酸,然后用HiTrap Q柱进一步纯化。收集纯化的Fabs,
浓缩至0.6 mg/mL。
栅格。使用Mark IV Vitrobot在100%湿度和16℃下印迹网格3 s,然后通过浸入式冷冻将栅
格浸入液体乙烷中。S‑6P‑32C7 Fab复合物的显微照片记录在300 kV的FEI Titan Krios电
子显微镜上。在K3 Summit直接电子探测器上,以标称放大81,000倍的超分辨率模式,离焦
范围为1.2至1.3mm,共记录了3740个动态过程。探测器采用狭缝宽度为20ev的GIF量子能量
滤波器。显微照片的剂量分成32帧,总电子曝光约50个电子每Å。
的抗原表位类似。其抗原表位包含S蛋白的345,346,347,348,349,351,352,354,440,441,
442,443,444,445,448,450,451,452,466,499,509位的氨基酸残基(结果如图3中B所示)。
32C7与新冠病毒RBD结构域有21个相互作用的氨基酸残基,并且都避开了目前新冠病毒突
变株的突变位点,使得其对于多种突变株都有很好的抑制效果。
32C7能对上述新冠病毒突变株都具有很好的中和效果。
调整或变化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。