一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法

摘要

本发明提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离：步骤1‑1，把SD小鼠的后背剪开并将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将神经节冲洗、剪碎；步骤1‑3，加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹匀得到悬浮液；步骤2，迷走神经元的培养：步骤2‑1，使用70μm过滤器对悬浮液进行过滤，步骤2‑2，用贴壁培养基将滤液稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，步骤2‑3，放入培养箱中培养，并用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，得到培养好的迷走神经元细胞。

权利要求

1.一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤1‑1，把肥胖培养的SPF级Sprague‑Dawlcy小鼠的后背剪开，并借助解剖显微镜，用镊子将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将剥离的所述神经节用Hanks盐平衡溶液进行冲洗，并将清洗后的所述神经节剪碎得到剪碎的组织；

步骤1‑3，向剪碎的所述组织加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹打均匀得到悬浮液；以及步骤2，迷走神经元的培养步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤2‑1，使用70μm过滤器对所述悬浮液进行过滤，得到滤液，步骤2‑2，用贴壁培养基将所述滤液进行稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，轻轻混匀细胞，使细胞均匀铺在培养皿中，步骤2‑3，将所述培养皿放入培养箱中培养，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，每两天更换新鲜的生长培养基，得到培养好的迷走神经元细胞，其中，所述生长培养基为加入了B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的Neurobasal培养基，所述生长培养基中，所述B27添加剂、所述N2添加剂、所述生长因子EGF以及所述生长因子FGF的质量比为2:1:1:1，所述生长培养基中的所述N2添加剂的浓度为1ug/100ml。

2.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑1中，所述Sprague‑Dawlcy小鼠是取自新出生30～40天、体重30～40g的，并且雌雄不限。

3.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，剪碎的所述组织与所述消化液的质量体积为(0.2g～1g)：2ml。

4.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，所述消化液为质量体积浓度为0.25％的胰蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，所述消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶和I型胶原酶，所述胰蛋白酶的质量体积浓度为0.25％，所述I型胶原酶的质量体积浓度为0.2％。

6.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤1‑3中，进行所述消化的时间为40min～80min，进行所述吹打的过程包括：分别使用大、中、小三种不同口径的巴斯德管，先用大口径巴斯德管轻柔吹打所述组织，待所述组织变得柔软，更换中口径的巴斯德管轻柔吹打4～5次，使所述组织分成小块组织，更换小口径巴斯德管继续吹打，得到所述悬浮液。

7.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，步骤2‑3中，所述培养箱内的温度为37℃，CO2体积含量为5％。

8.根据权利要求1所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，所述贴壁培养基为加入了胎牛血清的DMEM培养基。

9.根据权利要求8所述的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，其特征在于：其中，所述贴壁培养基中所述胎牛血清的体积分数为10％。

说明书

一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法。

背景技术

[0002] 迷走神经在大脑和外周器官之间提供双向信息传递，并通过介导肠脑交流在能量代谢调控中发挥重要作用。其中，70％的迷走神经纤维来自胞体，并位于结状神经节(nodose ganglion,NG)的迷走神经传入神经元(vagal afferent neurons,VANs)，其神经末梢与肠道形成以下三种连接：平滑肌内神经节内板状末梢和肌内阵列、粘膜内轴突末梢、与肠道内分泌细胞形成快速兴奋性突触。VANs既能直接感受肠道牵拉、收缩等机械刺激，还通过受体对GM(XX)产物、肠道激素以及神经递质等化学信号做出反应，是能量代谢和糖脂代谢调控的主要神经机制。

[0003] 不同营养状态下的迷走神经传入神经元的神经化学表型是可塑的，参与维持机体能量平衡的重要机制，在代谢稳态的调控以及肥胖的发生中都发挥重要作用。因此，培养肥胖小鼠的迷走神经元细胞是研究VANs功能的基础。然而现有技术中，有关迷走神经元原代培养的报道较少，没有比较合适的方法对迷走神经元进行原代培养，这极大地制约了对VANs功能地进一步研究。

发明内容

[0004] 本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法。

[0005] 本发明提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤1‑1，把肥胖培养的SPF级Sprague‑Dawlcy小鼠的后背剪开，并借助解剖显微镜，用镊子将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将剥离的神经节用Hanks盐平衡溶液进行冲洗，并将清洗后的神经节剪碎得到剪碎的组织；步骤1‑3，向剪碎的组织加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹打均匀得到悬浮液；以及步骤2，迷走神经元的培养步骤，该步骤包括以下子步骤，步骤2‑1，使用70μm过滤器对悬浮液进行过滤，得到滤液，步骤2‑2，用贴壁培养基将滤液进行稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，轻轻混匀细胞，使细胞均匀铺在培养皿中，步骤2‑3，将培养皿放入培养箱中培养，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，每两天更换新鲜的生长培养基，得到培养好的迷走神经元细胞。

[0006] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1‑1中，Sprague‑Dawlcy小鼠是取自新出生30～40天、体重30～40g的，并且雌雄不限。

[0007] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1‑3中，剪碎的组织与消化液的质量体积为(0.2g～1g)：2ml。

[0008] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1‑3中，消化液为质量体积浓度为0.25％的胰蛋白酶。

[0009] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1‑3中，消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶和I型胶原酶，胰蛋白酶的质量体积浓度为0.25％，I型胶原酶的质量体积浓度为0.2％。

[0010] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1‑3中，进行消化的时间为40min～80min，进行吹打的过程包括：分别使用大、中、小三种不同口径的巴斯德管，先用大口径巴斯德管轻柔吹打组织，待组织变得柔软，更换中口径的巴斯德管轻柔吹打4～5次，使组织分成小块组织，更换小口径巴斯德管继续吹打，得到悬浮液。

[0011] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2‑3中，培养箱内的温度为37℃，CO2体积含量为5％。

[0012] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，贴壁培养基为加入了胎牛血清的DMEM培养基，生长培养基为加入了B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的Neurobasal培养基。

[0013] 在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，贴壁培养基中胎牛血清的体积分数为10％，生长培养基中，B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的质量比为2:1:1:1，生长培养基中的N2添加剂的浓度为1ug/100ml。

[0014] 发明的作用与效果

[0015] 根据本发明所涉及的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，因为该方法包括经节的消化分离步骤和迷走神经元的培养步骤，消化分离步骤为先将小鼠的后背剪开并剥离神经节，然后对神经节进行清洗、剪碎，再加入消化液后置于37℃的摇床中低速旋转进行消化，离心后加入培养基吹匀，得到悬浮液；迷走神经元的培养步骤包括先进行70μm级的过滤然后将滤液稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，并置于培养箱中培养，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，每两天更换新鲜的生长培养基，即可得到培养好的迷走神经元细胞。所以，通过本发明的方法可以简单、可操作性强、重复性好地对袖状胃切除小鼠的迷走神经的原代细胞培，为进一步研究VANs介导的信号通路在肠脑交流中的作用奠定基础。

附图说明

[0016] 图1是本发明的实施例中两组消化液处理后的迷走神经元培养过程中的倒置显微镜照片；

[0017] 图2是本发明的实施例中两组消化液处理后的迷走神经元培养过程中随着培养天数的变化细胞数量的变化图；

[0018] 图3是本发明的实施例中的原代细胞培养方法得到的迷走神经元MAP2荧光染色照片；

[0019] 图4是本发明的实施例中原代细胞培养方法得到的迷走神经元MAP2阳性细胞比例图。

具体实施方式

[0020] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法作具体阐述。

[0021] <实施例>

[0022] 本实施例提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法以及迷走神经元的鉴定方法。

[0023] 本实施所使用的材料包括：

[0024] (a)实验动物

[0025] 选取6只肥胖培养的SPF级Sprague‑Dawlcy(SD)小鼠，新出生30‑40天，体重30‑40g，雌雄不限，由海军军医大学动物实验中心提供。

[0026] (b)试剂

[0027] 消化培养：Hanks盐平衡溶液(HBSS)、胰蛋白酶、I型胶原酶(美国Worthington公司)、Neurobasal培养基、B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF、生长因子FGF、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素‑链霉素、GlutaMAX培养基。

[0028] 染色鉴定：4％多聚甲醛、兔抗小鼠MAP2单克隆抗体(美国CST抗体)、Alexa Fluor488荧光二抗、PBS、固定液(5％Normal Goat Serum,0.25％TritonX‑100in PBS)、封片剂(美国Vector labs公司)、指甲油、载玻片、盖玻片。

[0029] (c)仪器设备

[0030] 解剖显微镜(购自卡尔蔡司股份有限公司)、镊子、剪刀、玻璃瓶、细胞培养培养箱(37℃,5％CO2)、生物安全柜、Milli‑Q Biocel型超纯水系统(Millipore,USA)、DK‑600型恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、倒置显微镜(日本Olympus公司)、confocal共聚焦荧光显微镜(莱卡中国有限公司)。

[0031] 本实施例中的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法包括以下步骤：

[0032] 步骤1，神经节的消化分离步骤。

[0033] 其中，步骤1包括以下子步骤：

[0034] 步骤1‑1，把肥胖培养的SPF级SD小鼠的后背剪开，并借助解剖显微镜，用镊子小心翼翼地将神经节细胞剥离。

[0035] 步骤1‑2，将剥离的神经节先放置在保存液中(保存液中含有青霉素‑链霉素、GlutaMAX培养基)转移到生物安全柜中，先用Hanks盐平衡溶液冲洗冲洗两遍，然后用灭菌的剪刀将神经节剪碎，将剪碎的组织转入15ml离心管。

[0036] 步骤1‑3，向剪碎的组织加入消化液，消化时分成两组：一组采用质量体积浓度为0.25％胰蛋白酶作为消化液，并且向0.5g克的组织中加入0.25％胰蛋白酶2ml；另外一组采用的消化液为质量体积浓度0.25％的胰蛋白酶和质量体积浓度0.2％的I型胶原酶(两种酶的体积比为1:1)，并且向0.5g克的组织中加入0.25％胰蛋白酶1ml以及0.2％的I型胶原酶
1ml。然后在37℃的摇床中低速旋转60分钟进行消化，再在2000r/min离心15min，弃去消化液后加入贴壁培养基，吹打均匀得到悬浮液。

[0037] 其中，贴壁培养基加入了胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并且贴壁培养基中胎牛血清的体积分数为10％。该贴壁培养基的成分可以DMEM培养基+10％FBS。

[0038] 进行吹打的过程包括：分别使用大、中、小三种不同口径的巴斯德管(例如，可以使用酒精灯将巴斯德管烧至不同口径)，先用大口径巴斯德管轻柔吹打组织，待组织变得柔软，更换中等口径的巴斯德管轻柔吹打4～5次，使组织分成小块组织，更换小口径巴斯德管继续吹打，得到悬浮液。注意：操作过程中动作一定要轻柔再轻柔，避免产生气泡。

[0039] 步骤2，迷走神经元的培养步骤。

[0040] 其中，步骤2包括以下子步骤：

[0041] 步骤2‑1，使用70μm过滤器对上述悬浮液进行过滤，将组织结块过滤掉，得到滤液。

[0042] 步骤2‑2，先取10μL滤液稀释10倍，使用细胞计数器测出细胞的浓度，然后将剩余的滤液用贴壁培养基(DMEM培养基+10％FBS)进行稀释后接种到6孔板中(10万个细胞/孔)，轻轻混匀细胞，使细胞均匀铺在培养皿中。

[0043] 步骤2‑3，将培养皿放入培养箱中培养，培养箱内的温度为37℃，CO2体积含量为5％，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，每两天更换新鲜的生长培养基，得到培养好的迷走神经元细胞。培养期间，每天使用倒置显微镜观察细胞的生长情况，结果如图1和图2所示。

[0044] 其中，生长培养基为加入了B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的Neurobasal培养基，并且生长培养基中，B27添加剂、N2添加剂、生长因子EGF以及生长因子FGF的的质量比为2:1:1:1，生长培养基中的N2添加剂的浓度为1ug/100ml。该生长培养基的成分可以记作记作Neurobasal+B27+N2+EGF+FGF。

[0045] 图1是本发明的实施例中两组消化液处理后的迷走神经元培养过程中的倒置显微镜照片；图2是本发明的实施例中两组消化液处理后的迷走神经元培养过程中随着培养天数的变化细胞数量的变化图。

[0046] 如图1所示，倒置显微下观察发现，小鼠迷走神经元细胞原代细胞贴壁较慢，起始密度约20％，细胞多呈圆形或椭圆形；待细胞培养4天后，细胞数量明显增多，具有典型的神经元形态；后可见部分细胞呈贴壁现象，更换培养液后继续培养，细胞培养至10天时神经元胞体成熟饱满，多成梭状、锥状，胞浆丰富许多分支相互连接，形成密集交错的神经纤维网络。同时，比较两种不同的消化处理方式发现：胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方式优于胰蛋白酶单一消化方式。前者消化得到的细胞产量以及后续的细胞存活率都明显高于后者(P＝0.012)(见图1和图2)。

[0047] 为了进一步验证上述原代细胞培养方法所培养得到的迷走神经元细胞的性能，本实施例还对其进行了鉴定。本实施例中的迷走神经元的鉴定方法包括以下步骤：

[0048] 步骤一，将上述培养好的迷走神经元细胞消化后铺到24孔板中的盖玻片上，等细胞贴壁长满后，使用PBS清洗玻片细胞2‑3次(保持轻柔，避免破坏神经细胞结构)。

[0049] 步骤二，向清洗后的玻片细胞加入200μL 37℃预热的4％可溶性聚四氟乙烯(PFA)进行固定，快速轻柔保证细胞的完整，固定15min。

[0050] 步骤三，PBS清洗固定液，清洗3次，每次10min。加0.25％Triton X‑100孵育15min，然后PBS洗3次，每次10min，加入配置好的兔抗小鼠MAP2单克隆抗体(1:500，即500ul的溶液中加入1ul的抗体)放置于4℃，孵育24h。第二天，用PBS洗3次，每次10min。然后加AlexaFluor488荧光二抗(1：1000，即1000ul的溶液中加入1ul的抗体)室温孵育1h。PBS洗3次，每次10min。

[0051] 步骤四，取载玻片滴加封片剂，然后将上述盖玻片取出，倒置在载玻片上，进行封片。使用激光共聚焦显微镜进行观察，观察结果如图3和图4所示。

[0052] 图3是本发明的实施例中的原代细胞培养方法得到的迷走神经元MAP2荧光染色照片；图4是本发明的实施例中原代细胞培养方法得到的迷走神经元MAP2阳性细胞比例图。

[0053] 为进一步确认所获得的细胞为迷走神经元的纯度，取培养的原代细胞进行免疫荧光染色鉴定，观察神经元特异性蛋白MAP2的表达情况。激光共聚焦荧光显微镜下采集图像，MAP2阳性表达呈绿色，DAPI染的细胞核呈蓝色。实验结果显示：绝大部分细胞质及突起在荧光显微镜下呈绿色，即为MAP2阳性表达(见图3)。以随机5个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，计算本实验分离的细胞中MAP2神经元阳性率。发现：用胰蛋白酶与I型胶原酶联合消化法培养的迷走神经元纯度(95.0±1.98％),优于胰蛋白酶单一消化法的纯度(84.8±1.3％)(见图4)。以上，以随机5个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经计算本实验分离的脑细胞中MAP2神经元阳性率为(97.01+0.23％)，说明通过胰蛋白酶与胶原酶联合消化法此培养方法获得了纯度较高的迷走神经元细胞。。

[0054] 上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。