高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA转让专利
申请号 : CN202110677296.0
文献号 : CN113388595B
文献日 : 2022-07-15
发明人 : 黄淑云
申请人 : 武汉翌圣生物科技有限公司
摘要 :
本发明提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液，腐殖酸，靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。
权利要求 :
1.一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。
2.权利要求1所述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1所述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶在STR检测中的应用。
说明书 :
高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA
技术领域
[0001] 本发明专利涉及一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] STR（Short Tandem Repeat 短串联重复序列）是一种广泛存在于人类基因组中的分子遗传标记，是由2～6个碱基组成核心单位串联重复而形成的DNA序列。核心序列重复数目的变化，使其在群体中呈现多态性；同时在同一家系中又以孟德尔方式遗传，具有高度的遗传保守性；而且检测方法相对简单。因此该遗传标记物在法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等领域广泛应用。
[0003] Taq DNA聚合酶是第一个从水生嗜热杆菌中分离出来的耐热性DNA聚合酶。因为Taq DNA聚合酶具有极好的热稳定性，能够耐受PCR热变性过程，不需要每个循环额外添加新的聚合酶；因此该酶后面被广泛应用于各种PCR技术。它具有5'‑3'聚合活性，5'‑3'外切活性，无3'‑5'外切活性；同时具备在PCR产物3'末端加A的特性。STR常用的检测手段是PCR扩增之后跑毛细管电泳；毛细管电泳分辨率高可以区分1bp的产物。一般的Taq DNA聚合酶在跑毛细管电泳时会呈现一个碱基差异的分裂峰，一个加A一个不加A产物；这是由于Taq DNA聚合酶对于产物加A不完全导致的；这种有时候会影响对结果的判读。为了解决此问题，一般会在扩增结束之后增加60℃/72℃的延伸时间，确保产物的完全加A；但是这种方法会增加扩增时间。
[0004] STR作为法庭医学常用的检测手段之一，其常见的样本是血液或者血卡，为了缩短检测时间，会直接进行血液样本或者血卡的直扩而不对样本进行提取；这需要PCR所用的Taq DNA聚合酶拥有耐受血液的能力。另一方面从犯罪现场收集的DNA样本很多与泥土，沙石，腐烂树叶等混合在一起，提取的时候会有相对应抑制物的残留；抑制剂会阻碍目的片段的扩增导致扩增结果出现STR等位基因的丢失或者直接导致所有基因座扩增失败。因此这也要求用于STR的Taq DNA聚合酶具备一定的耐抑制能力。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，不但加A效率高，对血液和抑制剂的耐受能力也强。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007] 一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。其中D188K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第188位的天冬氨酸突变为赖氨酸； T506R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第506位的苏氨酸突变为精氨酸；T710R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第710位的苏氨酸突变为精氨酸；A744K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第744位的丙氨酸突变为赖氨酸。
[0008] 上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009] 上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶在STR检测中的应用。
[0010] 本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液、腐殖酸、靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。
附图说明
[0011] 图1是本发明实施例1扩增产物的毛细管电泳结果。其中左边4个为野生型Taq酶的扩增结果，ATGC分别代表扩增引物5端碱基分别为ATGC；右边为本发明突变型Taq酶B‑Taq扩增5末端碱基为ATGC的引物的扩增结果。
[0012] 图2是本发明实施例2 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1‑5分别为血液百分比0，2.5%，5%，8%，10%的模板的扩增结果。
[0013] 图3是本发明实施例2中，全血百分比为0%的1ng/ulg DNA的模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
[0014] 图4是本发明实施例2中，全血百分比为10%的血液模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
[0015] 图5是图5是本发明实施例3中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1‑5分别是体系中加入0，5，10，15，20ng/ul 腐殖酸的扩增结果。
[0016] 图6是本发明实施例4中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1‑5分别是体系中加入0，5，10，20，30mM靛蓝的扩增结果。
具体实施方式
[0017] 实施例1 5'端ATGC加A测试
[0018] 合成引物序列如下
[0019] 基因座名称 引物序列（5'‑3'）5T‑F TCACTCATTAGGCACCGGG
5T‑R TCAACGACAGGAGCACGAT
5A‑F ACCAGACACCCATCAACAGT
5A‑R ATCGTTGGCAACCAGCATCG
5C‑F CTCACTCATTAGGCACCGGG
5C‑R CTCAACGACAGGAGCACGAT
5G‑F GACCAGACACCCATCAACAGT
5G‑R GATCGTTGGCAACCAGCATCG
5T‑R TCAACGACAGGAGCACGAT
5A‑F ACCAGACACCCATCAACAGT
5A‑R ATCGTTGGCAACCAGCATCG
5C‑F CTCACTCATTAGGCACCGGG
5C‑R CTCAACGACAGGAGCACGAT
5G‑F GACCAGACACCCATCAACAGT
5G‑R GATCGTTGGCAACCAGCATCG
[0020] 以PET28a载体质粒为模板，利用PCR对目的序列进行扩增，扩增分4个反应，分别以5A‑F 5A‑R, 5T‑F 5T‑R, 5G‑F 5G‑R, 5C‑F 5C‑R4对引物进行扩增。同时对比本发明的突变型Taq DNA聚合酶（B‑Taq）与野生型Taq酶的加A情况。5'末端为G/C时，B‑Taq对比野生型Taq酶，无双峰情况，加A完全。说明该突变型Taq酶的加A效率优于野生型Taq酶。
[0021] 表1：PCR检测体系示例
[0022] 组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
Primer‑F 10μM 0.5
Primer‑R 10μM 0.5
质粒模板 1ng/μl 1
B‑Taq/Canaces 5U/ul 0.5
ddH2O ‑ 17
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
Primer‑F 10μM 0.5
Primer‑R 10μM 0.5
质粒模板 1ng/μl 1
B‑Taq/Canaces 5U/ul 0.5
ddH2O ‑ 17
[0023] 表2：PCR循环过程示例
[0024]
[0025] 将PCR反应产物跑毛细管电泳，示例性结果显示在图1。从图1可以看出：野生型Taq酶和突变型Taq酶B‑Taq在扩增5'末端为A，G的引物时，加A情况一致，但是扩增引物末端为T，C的引物时，野生型Taq酶的产物表现为明显的双峰，加A不完全；而突变型Taq酶的产物是单一峰，加A完全。这表明，本发明的突变型Taq酶比野生型Taq酶有更好的加A能力。
[0026] 实施例2 血液样本耐受性测试
[0027] 以新鲜采集的人血样本为模板，测试Taq DNA聚合酶的扩增20重STR位点的能力。为了测定B‑Taq的血液耐受情况，每个反应中全血投入量不同，以25ul反应为例子，分别投入0(模板为1ng/ul gDNA 1ul),0.625ul,1.25ul,2ul,2.5ul;其全血百分比分别为0，2.5%,
5%,8%,10%.本发明采用20重STR 引物，简称STR 20重引物。
5%,8%,10%.本发明采用20重STR 引物，简称STR 20重引物。
[0028] 合成STR 20重引物序列
[0029]
[0030] 表3：PCR体系
[0031]组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
全血模板 ‑ 0(1ng/ulgDNA 1uL),0.625,1.25,2,2.5
B‑Taq 5U/ul 0.5
ddH2O ‑ 18.5，17.875，17.25，16.5，16
Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
全血模板 ‑ 0(1ng/ulgDNA 1uL),0.625,1.25,2,2.5
B‑Taq 5U/ul 0.5
ddH2O ‑ 18.5，17.875，17.25，16.5，16
[0032] 表4：PCR循环过程示例
[0033]
[0034] 将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图2。从图2可以看出：不同血液百分比的模板，扩增结果一致，都没有条带丢失，表明本发明的突变型Taq酶可以耐受10%的血液。
[0035] 同时选取全血百分比分别为0和10%的PCR产物进行毛细管电泳，结果显示在图3和图4。从图3和图4可以看出：本发明的突变型Taq酶在进行血液模板的20重Y‑STR扩增时，血液投入量高达10%依然能正常扩增，不存在点位丢失情况。
[0036] 实施例3 抑制剂腐殖酸耐受度测试
[0037] 在存在不同浓度腐殖酸的情况下，在PCR反应中以1ng/ul gDNA为模板，测试B‑Taq扩增STR 20重引物的能力。为了测定B‑Taq的腐殖酸耐受情况，每个反应中腐殖酸投入量不同，以25ul反应为例子，250ng/ul腐殖酸分别投入0，0.5，1，1.5，2ul；其腐殖酸终浓度为0，5，10，15，20ng/ul。
[0038] 表5： PCR体系
[0039]组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B‑Taq 5U/ul 0.5
腐殖酸 250ng/ul 0，0.5，1，1.5，2
ddH2O ‑ 17.5，17，16.5，16，15.5
Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B‑Taq 5U/ul 0.5
腐殖酸 250ng/ul 0，0.5，1，1.5，2
ddH2O ‑ 17.5，17，16.5，16，15.5
[0040] 表6：PCR循环过程示例
[0041]
[0042] 将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图5。从图5可以看出：本发明突变型Taq酶可以完全耐受10ng/ul的腐殖酸，部分耐受20ng/ul的腐殖酸。
[0043] 实施例4 抑制剂靛蓝耐受度测试
[0044] 在存在不同浓度靛蓝的情况下，在PCR反应中以1ng/ul gDNA为模板，测试B‑Taq扩增STR 20重引物的能力。为了测定B‑Taq的腐殖酸耐受情况，每个反应中靛蓝投入量不同，以25ul反应为例子，100mM靛蓝分别投入0，1.25，2.5，5，7.5ul；其腐殖酸终浓度为0，5，10，20，30mM。
[0045] 表7： PCR体系
[0046] 组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）Tris‑HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B‑Taq 5U/ul 0.5
靛蓝 100mM 0，1.25，2.5，5，7.5
ddH2O ‑ 17.5，16.25，15，12.5，10
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B‑Taq 5U/ul 0.5
靛蓝 100mM 0，1.25，2.5，5，7.5
ddH2O ‑ 17.5，16.25，15，12.5，10
[0047] 表8：PCR循环过程示例
[0048]
[0049] 将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图6。从图6可以看出：本发明突变型Taq酶可以完全耐受10mM的靛蓝，部分耐受20mM的靛蓝，30mM的靛蓝对体系抑制严重，基本不耐受。