还原酶LX05基因,含有该基因的基因工程菌及其应用转让专利
申请号 : CN202110851734.0
文献号 : CN113388627B
文献日 : 2022-04-22
发明人 : 王能强
申请人 : 湖南科技大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种还原酶LX05基因,其特征在于,所述还原酶LX05基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,所述基因全长为756 bp,G+C 含量为70.94%,编码251个氨基酸,其氨基酸序列为:SEQ ID NO.2。
2.权利要求1所述的还原酶LX05基因所编码的还原酶蛋白质,其特征在于,所述还原酶蛋白质的氨基酸序列为:SEQ ID NO.2。
3.一种含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌为基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑LX05,所述基因工程菌的重组表达载体为pET‑28a(+),与载体连接的酶切位点为NcoⅠ和HindⅢ,重组表达菌株的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌,其特征在于,所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3) 的构建方法为:含有权利要求1所述的还原酶LX05基因的pET‑28a(+) 重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3) 获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3),再将所获得的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3) 转接到含50 μg/mL卡那霉素的平板,37℃培养16h 后,挑取单菌落转化子,经测序验证基因序列无误后,保存。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌,其特征在于,所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑LX05,按如下方法培养获得:取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑LX05加入到装有50mL L‑B培养基的250mL摇瓶中,37℃、150‑250rpm,培养8‑12 h;然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L‑B培养基的500mL摇瓶中,37℃、150‑250rpm,培养1‑2h后,无菌条件下往摇瓶中添加终浓度为0‑0.7 mmol/L的诱导剂IPTG,17‑37℃、150‑250rpm,继续培养6‑
20h,将培养液离心,获得基因工程菌湿菌体。
6.权利要求1所述的还原酶LX05基因、权利要求2所述的还原酶蛋白质或权利要求3所述的基因工程菌的应用,其特征在于,所述的还原酶LX05基因、还原酶蛋白质或基因工程菌用于制备手性化合物,所述的手性化合物为(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,以[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物,以还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或权利要求5所述的方法获得的基因工程菌湿菌体+
为酶源,于体积分数为0‑75%的异丙醇、0‑5 mmol/L的NAD、0‑3 mmol/L的MgCl2、20‑400 g/L的湿菌体、100‑3000 mmol/L的底物[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为6.2‑8.0的缓冲液或蒸馏水构成的反应体系中,在25‑35℃条件下进行反应,反应结束后,向反应液加入乙酸乙酯或正己烷萃取10‑30min,然后离心收集上层的乙酸乙酯萃取液,萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析,用内标法定量。
说明书 :
还原酶LX05基因,含有该基因的基因工程菌及其应用
技术领域
背景技术
途径。还原酶是一类以NAD(P)H为辅酶、在酶学分类上属于短链脱氢酶/还原酶类的氧化还
原酶,因其具有高化学选择性、高区域选择性和立体选择性,被认为是一类极具潜力的用于
不对称催化还原反应的生物催化剂。然而,大多数已知的还原酶在催化制备手性化合物时
存在催化活性较低、反应效率低下、底物初始浓度不高、热稳定性差、适用底物种类有限、有
机溶剂耐受性差、水相溶解度低等问题,这些问题的存在严重制约着当前生物催化在工业
上广泛应用,这些存在的问题可以通过选择高效、合适的还原酶催化剂来克服。因此,寻找
具有优良特性的新型还原酶催化剂已成为必要,而且开发出新型、高效的还原酶催化剂还
可以丰富微生物还原酶库,为生物催化制备功能手性化合物提供新酶源,为手性药物中间
体的制备提供高效、绿色的生物催化剂。
甲基)苯基] 乙醇的方法有化学法合成、酶法拆分和生物催化的不对称还原等,基于还原酶
或其全细胞为生物催化剂的不对称还原法具有立体选择性高、反应条件温和,副产物少和
产率高等优点,越来越备受研究者关注。近年来,一些具有不对称还原制备(R)‑[3,5‑二(三
氟甲基)苯基] 乙醇的还原酶或含还原酶的微生物细胞已被报道,如Leifsonia xyli,
Lactobacillus kefir、 Penicillium expansum、Microbacterium oxydans、Trichoderma
asperellum ZJPH0801、 Chryseobacterium sp.CA49、Burkholderia cenocepacia和固定
化的酮还原酶等。然而,这些还原酶或微生物在催化过程中大多数的底物浓度不高、产物浓
度低和反应时间较长,不适合用于工业化生产(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇。
发明内容
外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题,本发明提供一种催化活性高、对映选择性强、底物耐
受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的还原酶LX05基因,含有还原酶LX05基因的基因工
程菌,以及还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质,或含有还原酶LX05基因的基因工程菌在
催化还原制备手性化合物中的应用。特别地,将该酶用于(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙
醇的制备中,不仅催化活性高、底物耐受性好、产物浓度高、催化反应时间短,而且实现了高
浓度(768g/L) 底物的转化。
序列为:SEQ ID NO.2。
TCGTCAAGGAGATCGTCGCGGCCGGGGG CACGGCCGAGGCCTTCGTGGGCGACGTCGCCGACCCCGAGGTCGCGG
AAGCCGCGGT GGCCGCCGCTGTGGAGCTCGCCCCGCTGCGCATCGCCGTCAACAACGCCGGCATCGG CGGTGCC
GCCGCACCGGTCGGCGAGTACCCGATCGACAGCTGGCGCAAGGTCATCGA CGTCAACCTCAACGCCGTCTTCTAC
GGCATGCGGGCGCAGATCGACGCGATCGCCGGC AACGGCGGCGGCGCGATCGTCAACATGGCCTCGATCCTCGGC
TCGGTGGGCATCGCCG GCTACTCGGCGTACGTCACCTCCAAGCACGCCCTGCTCGGCCTCACCAAGAACGCCG C
CCTCGAGTACGCGGCGAAGAACGTTCGCGTCACCGCGGTCGGCCCCGGCTTCATCTC CACGCCGCTTCTCGAGTC
CAACCTCGACGCCGATACGCAGCAGGCCCTGGCCGACAA GCACGCCGCCGGCCGCCTCGGCACCCCGGAGGAGGT
CGCCGCGCTGGTCGCGTTCCT CGCCTCCGACGCCGCGAGCTTCATCACCGGCAGCTACCACCTCGTCGACGGCGG
CTAC ACCGCCCAGTAA
ASILGSVGIAGYSAYVTSKHALLGLTKNAALEYAAKN VRVTAVGPGFISTPLLESNLDADTQQALADKHAAGRLG
TPEEVAALVAFLASDAASFITGS YHLVDGGYTAQ
(DE3)。
(DE3),再将所获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)转接到含50μg/mL卡那霉素的平板,37
℃培养16h 后,挑取单菌落转化子,经测序验证基因序列无误后,保存。
性化合物优选(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇。
250mL摇瓶中,37℃、150‑250rpm,培养8‑12h;然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L‑B培
养基的500mL摇瓶中,37℃、150‑250rpm,培养1‑2h(优选1.5h)后,无菌条件下往摇瓶中添加
终浓度为0‑0.7mmol/L(优选0.6mmol/L)的诱导剂IPTG,17‑37℃(优选29℃)、150‑250rpm,
继续培养6‑20h(优选14h),将培养液离心,获得基因工程菌湿菌体。
[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物,以还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质或上述方法
获得的基因工程菌湿菌体为酶源,于体积分数为0‑75%(优选25‑69%)的异丙醇、0‑5mmol/
+
L(优选2‑3.9 mmol/L)的NAD、0‑3mmol/L(优选0.5‑1.5mmol/L)的MgCl2、20‑400g/L(优选
100‑300g/L) 的湿菌体、100‑3000mmol/L的底物[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为6.2‑
8.0的缓冲液或蒸馏水构成的反应体系中,在25‑35℃条件下进行反应,反应结束后,向反应
液加入乙酸乙酯或正己烷萃取10‑30min,然后离心收集上层的乙酸乙酯萃取液,萃取液中
的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析,用内标法定量。
及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题,提供了一种新型的还原酶LX05基因,含有该
基因的工程菌;及还原酶LX05基因编码的还原酶蛋白质,或含有还原酶LX05基因的基因工
程菌可不对称还原制备手性化合物,从而在研究生物法制备NK‑1受体拮抗剂类药物关键手
性中间体 (R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇方面提供了有益的参考;采用该含新型还原
酶LX05基因的基因工程菌不对称还原[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮制备光学纯(R)‑[3,5‑
二(三氟甲基)苯基]乙醇具有立体选择性好、催化活性高和产物光学纯度高等特性,并实现
了高浓度底物(768g/L) 的转化。本发明筛选和设计获得了一种新型的还原酶LX05基因,通
过采用含该新型还原酶 LX05基因的基因工程菌经上述培养方法获得的湿菌体为催化剂,
+
于体积分数为69%的异丙醇、3.9mmol/L的NAD、1.0mmol/L的MgCl2、300g/L的湿菌体、3mol/
L(质量浓度为768g/L) 的底物[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH为7.4的缓冲液或蒸馏水
构成的反应体系中,在32℃、 150rpm条件下反应15h,目的产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯
基]乙醇的产率达到94.1%,e.e.达到 99.9%。
附图说明
具体实施方式
酶保守序列分析,对获得的5个还原酶基因进行设计得到5个新型还原酶(LX01,LX02、LX03,
LX04和LX05)基因,并分别在其5’和3’端添加NcoⅠ和HindⅢ酶切位点,然后送于苏州金唯智
生物科技有限公司进行基因全合成和构建其基因工程菌。对构建获得的5个工程菌进行不
对称还原[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮(底物浓度为100mmol/L)的功能验证,结果表明,还
原酶LX01,LX02,LX03和LX04均没有不对称还原[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮的还原活性,
其产物产率为0,但还原酶LX05具有不对称还原[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)‑[3,
5‑ 二(三氟甲基)苯基]乙醇的性能,产物的产率为20.4%,e.e.值为99.8%。
37℃、 150rpm,培养12h;然后取1mL培养液转接至装有100mL新鲜L‑B培养基的500mL摇瓶
中,37 ℃、150rpm,培养1.5h后,无菌条件下往摇瓶中添加终浓度为0.6mmol/L的诱导剂
IPTG,29 ℃、150rpm,继续培养14h,将培养液离心,所得沉淀用磷酸缓冲液洗涤,获得湿菌
体,即为酶源。
为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱条件:日本岛津GC‑2014气相色
谱仪;美国瓦里安CP‑Chirasil‑Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气
为高纯氮气,流量为2mL/min;进样量1μL,分流比为15:1;检测器和进样口温度均为250℃;
色谱柱温度80‑150℃;升温速度8℃/min;检测器为FID。各物质的出峰时间约为:[3,5‑ 二
(三氟甲基)苯基]乙酮4.569min,十二烷8.315min,(S)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇
9.308min,(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇9.631min。根据气相色谱检测谱图,用相对校
正因子法计算出反应液中产物的浓度、产率和e.e.值。
基)苯基]乙酮作为底物,再加入不同种类的辅助底物如甲醇、乙醇、异丙醇、甘油、葡萄糖、
乳糖、蔗糖、乙二醇和1,4‑丁二醇(固体终浓度为50g/L,液体浓度为10%),置于30℃、
150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产
物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表1所示。
甲基)苯基]乙酮作为底物,再加入不同浓度(体积分数)的异丙醇(v/v)(如0、2.5、5、 7.5、
10、12.5、15、20、25、30%),置于30℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2
的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.
值见表2所示。由表2可知,当异丙醇浓度为25%(v/v)时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯
基]乙醇的产率最高,为99.9%,且e.e.值为99.8%。
助底物,再加入终浓度200mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,然后置于不同
的温度(25、28、30、32、35℃)下、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法
计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e. 值见
表3所示。由表3可知,当温度为32℃时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最
高,为61.1%,且e.e.值为99.8%。
辅助底物,再加入终浓度200mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,置于32℃、
150rpm 的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。
产物 (R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表4所示。由表4可知,当缓冲液
pH值为7.4时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高,为61.1%,且e.e.值为
99.8%。
助底物,加入终浓度200mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,再分别加入终浓
度为1mmol/L的硫酸锰、硫酸锌、硫酸亚铁、EDTA二钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙。置于
32℃、150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.
值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表5所示。由表5可知,当反应
体系中添加了1mmol/L的氯化镁时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高,为
68.3%,且e.e.值为99.9%。
助底物,加入终浓度200mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,再分别加入不同
浓度(0、0.5、1、1.5、2.0和3.0mmol/L)的氯化镁。置于32℃、150rpm的摇床中反应 12h。反应
结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯
基]乙醇的产率和e.e.值见表6所示。由表6可知,当反应体系中添加了1mmol/L的氯化镁时,
产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高,为68.3%,且e.e.值为99.9%。
助底物,加入终浓度300mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,加入终浓度为
+
1mmol/L的氯化镁,再分别加入不同浓度(0、0.5、1、2、3和4mmol/L)的NAD 。置于 32℃、
150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和 e.e.值。
产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表7所示。由表7可知,当反应体
+
系中添加了3mmol/L的NAD 时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率最高,为
66.1%,且e.e.值为99.9%。
+
助底物,加入终浓度为1mmol/L的氯化镁和终浓度为3.0mmol/L的NAD 。再加入不同浓度
(100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、2000、2500、 3000mmol/L)的
[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物,置于32℃、150rpm的摇床中反应 12h。反应结束
后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙
醇的浓度、产率和e.e.值见表8所示。由表8可知,当[3,5‑二(三氟甲基)苯基] 乙酮浓度为
3000mmol/L时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高,为943.7 mmol/L,此时
产率为31.5%,e.e.值为99.9%。
+
和终浓度为3.0mmol/L的NAD ,加入终浓度3000mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙酮作
为底物,再加入不同浓度(20、40、100、150、200、250、300、400g/L)的湿菌体,置于32℃、
150rpm的摇床中反应12h。反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产
物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表9所示。由表9可知,当湿菌体浓
度为300g/L时,产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率为56.6%,e.e.值为99.9%。
+
苯基]乙酮作为底物,再按照表10添加不同浓度的异丙醇、湿菌体浓度和NAD ,置于 32℃、
+
150rpm的摇床中反应12h,以考察异丙醇、湿菌体浓度和NAD 这三个因素之间交互的影响。
反应结束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二 (三氟甲
基)苯基]乙醇的产率和e.e.值见表10所示,并对结果进行分析和预测获得最佳的异丙醇、
+
湿菌体和NAD浓度分别为69%(v/v)、300g/L和3.9mmol/L。此条件下预测的产物 (R)‑[3,
5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率为84.3%。
苯基]乙酮作为底物,加入300g/L的湿菌体、终浓度为69%(v/v)的异丙醇和终浓度为3.9
+
mmol/L的NAD ,置于32℃、150rpm的摇床中反应12h,反应结束后,按照实施例2的方法计算
出产物的产率和e.e.值,以验证响应面法获得的最优条件下的产物的产率和e.e. 值。结果
表明,在此条件下产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和e.e.值分别为88.1%,
稍高于预期的产率,基本与预期的产率数值相符。
+
异丙醇和终浓度为3.9mmol/L的NAD,加入终浓度3000mmol/L的[3,5‑二(三氟甲基) 苯基]
乙酮作为底物,置于32℃、150rpm的摇床中反应不同的时间(3、6、9、12、15和 18h),反应结
束后,按照实施例2的方法计算出产物的产率和e.e.值。产物(R)‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]
乙醇的产率和e.e.值见表11所示。由表11可知,反应时间为15h时,产物 (R)‑[3,5‑二(三氟
甲基)苯基]乙醇的产率为94.1%,e.e.值为99.9%