一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法

摘要

本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法。该方法可以在一个色谱条件下同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质，各色谱峰的分离度均较好，检测限、定量限也均符合药物的定性和定量分析要求，灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，可用于富马酸伏诺拉生中生产过程中对杂质的监控，有利于控制、提高富马酸伏诺拉生的质量；同时操作简单，检测时间短，非常适用于大规模产业化生产中对原料药的质量监控。

权利要求

1.一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，其中，所述3种杂质为吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯；

所述高效液相色谱条件为：

采用反相C18色谱柱Sepax HP‑C18 4.6 mm×250 mm，5 μm，在260 nm检测波长，25 45~℃柱温，0.8 1.2ml/min流速条件下，以0.02 0.05mol/L磷酸氢二钾作为流动相A，以乙腈作~ ~为流动相B，在梯度洗脱条件下进行检测；

所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调节pH值为3.0 6.0；

~

所述梯度洗脱为0 4min，流动相A：98 98%；4 10min，流动相A：98 40%；10 20min，流动~ ~ ~ ~ ~相A：40 40%；20 20.1min，流动相A：40 98%；20.1 25min，流动相A：98 98%；

~ ~ ~ ~ ~

所述富马酸伏诺拉生测定时，供试品溶液用2 5%乙腈溶液配制。

~

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述富马酸伏诺拉生测定时，供试品溶液用5%乙腈溶液配制。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中富马酸伏诺拉生浓度为0.5 4 mg/ml。

~

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调节pH值为

6.0。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件中，进样量为50~

100 μm。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法中吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯的定量限为0.001 0.002%，检测限为0.0004 0.0007%；吡啶‑3‑磺酸定量限~ ~为0.008 0.010%，检测限为0.004 0.005%。

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说明书

一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析检测技术领域。更具体地，涉及一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法。

背景技术

[0002] 富马酸伏诺拉生(1‑[5‑(2‑氟苯基)‑1‑(吡啶‑3‑基磺酰基)‑1H‑吡咯‑3‑基]‑N‑甲基甲胺单富马酸盐)是一种新型的质子泵抑制剂，主要用于治疗酸相关胃肠道疾病，如胃溃疡、胃食管反流症等。吡啶‑3‑磺酰氯是合成富马酸伏诺拉生的关键起始物料，也是一种强氧化剂，化学性质活泼，易水解生成吡啶‑3‑磺酸，同时，吡啶‑3‑磺酰氯还会与合成工艺中用到的甲醇、乙醇溶剂反应，生成潜在基因毒性杂质吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯；另一方面，富马酸伏诺拉生本身也可降解得到吡啶‑3‑磺酸。

[0003]

[0004] 富马酸伏诺拉生制备过程中存在的吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯副产物杂质会被带入到成品中，无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效，甚至存在遗传毒性，直接引起DNA损伤，导致DNA突变，从而引发癌症，存在安全隐患。因此，迫切需要提供一种检测富马酸伏诺拉生中杂质的分析方法。但是，吡啶‑3‑磺酸沸点在330℃以上，超过绝大多数气相色谱柱的温度范围，因此不适合用气相色谱法(CG)来测定；并且，磺酸酯的反应活性较高，利用GC检测时磺酸酯会在进样口高温分解或者样品中的磺酸与醇类溶剂瞬间反应生成磺酸酯。而采用HPLC法测定时，样品中残留的磺酸易与测试中常用到的醇类溶剂发生反应，生成待测的磺酸酯，造成假阳性结果，影响测定结果的准确性；并且磺酸酯类杂质极性大，在色谱柱中保留弱，能容易被洗脱下来而导致杂质之间无法有效分离。如乐志艳等(乐志艳,肖敏,方潇颖.HPLC法测定富马酸沃诺拉赞原料药中吡啶‑3‑磺酸的含量[J].今日药学,2019,v.29(01):23‑26.)公开了一种HPLC法测定富马酸沃诺拉赞原料药中吡啶‑3‑磺酸的含量，在选定的色谱条件下，吡啶‑3‑磺酸与相邻色谱峰分离良好，峰面积呈现良好的线性关系，精密度良好，灵敏度高，准确度好，但是该方法仅能检测吡啶‑3‑磺酸，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯没有响应值，无法同时检测。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术无法用CG或HPLC同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质方法的缺陷和不足，提供一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法。

[0006] 本发明的目的是提供一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法。

[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0008] 一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，

[0009] 其中，所述吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯的结构如下所示：

[0010]

[0011] 其中，高效液相色谱条件为：

[0012] 采用十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱，在260nm检测波长，25～45℃柱温，0.8～1.2ml/min流速条件下，以0.02～0.05mol/L磷酸氢二钾溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，在梯度洗脱条件下进行检测。

[0013] 进一步地，所述梯度洗脱为0～4min，流动相A：98～98％；4～10min，流动相A：98～40％；10～20min，流动相A：40～40％；20～20.1min，流动相A：40～98％；20.1～25min，流动相A：98～98％。

[0014] 优选地，所述反相C18色谱柱为Sepax HP‑C18 4.6mm×250mm，5μm。

[0015] 优选地，所述富马酸伏诺拉生测定时，供试品溶液用2～5％乙腈溶液配制。

[0016] 更优选地，所述富马酸伏诺拉生测定时，供试品溶液用5％乙腈溶液配制。

[0017] 进一步地，所述供试品溶液中富马酸伏诺拉生浓度为0.5～4mg/ml。

[0018] 优选地，所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调节pH值为3.0～6.0。

[0019] 更优选地，所述磷酸氢二钾溶液用磷酸调节pH值为6.0。

[0020] 优选地，所述柱温为25～30℃；更优选地，所述柱温为30℃。

[0021] 优选地，所述流速为0.8～1.0ml/min；更优选地，所述流速为1.0ml/min。

[0022] 优选地，所述流动相A为0.05mol/L磷酸氢二钾溶液。

[0023] 更进一步地，所述高效液相色谱条件中，进样量为50～100μm。

[0024] 进一步地，所述检测方法中吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯的定量限为0.001～0.002％，检测限为0.0004～0.0007％；吡啶‑3‑磺酸定量限为0.08～0.10％，检测限为0.004～0.005％。

[0025] 更进一步地，所述检测方法中，供试品溶液的制备方法为：取富马酸伏诺拉生适量，用2～5％乙腈溶液溶解并稀释制成每1ml约含富马酸伏诺拉生0.5～4mg的溶液，作为供试品溶液。

[0026] 进一步地，所述检测方法中，对照品溶液的制备方法为：取吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸对照品适量，用2～5％乙腈溶液制成每1ml中含吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸分别为0.014～0.112μg、0.014～0.112μg、0.375～3μg的溶液。

[0027] 本发明具有以下有益效果：

[0028] 本发明检测方法，可以在一个色谱条件下同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质，各色谱峰的分离度均较好，检测限、定量限也均符合药物的定性和定量分析要求，灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，可用于富马酸伏诺拉生中生产过程中对杂质的监控，有利于控制、提高富马酸伏诺拉生的质量；同时操作简单，检测时间段，非常适用于大规模产业化生产中对原料药的质量监控。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1中加标供试品溶液检测色谱图。

[0030] 图2为本发明实施例1中加标供试品溶液检测色谱图局部放大图。

[0031] 图3为本发明对比例1中加标供试品溶液检测色谱图。

[0032] 图4为本发明对比例3中对照品溶液检测色谱图中的吡啶‑3‑磺酸色谱峰截图。

[0033] 图5为本发明对比例4中不同流动相色谱图。

[0034] 图6为本发明应用例2中随机抽检的供试品溶液测定的色谱图。

具体实施方式

[0035] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0036] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0037] 实施例1一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0038] (1)液相色谱条件

[0039] 流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0)

[0040] 流动相B：乙腈

[0041] 洗脱梯度参见表1。

[0042] 表1梯度洗脱条件

[0043]

[0044]

[0045] 检测波长为260nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样量50μl；

[0046] 色谱柱：Sepax HP‑C18 4.6mm×250mm，5μm。

[0047] (2)供试品及对照品制备

[0048] 供试品溶液：取富马酸伏诺拉生适量，用5％乙腈溶液溶解并稀释制成每1ml约含富马酸伏诺拉生2mg的溶液，作为供试品溶液。

[0049] 加标供试品溶液：取吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸对照品对照品适量，用5％乙腈溶液制成每1ml中约含吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸分别为1.5μg、1.5μg、15μg的溶液，作为对照品储备液；取富马酸伏诺拉生适量，加适量5％乙腈溶液使溶解，精密加入对照品储备液适量，用5％乙腈溶液稀释制成每1ml中约含吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸分别为0.056μg、0.056μg、1.5μg、约含富马酸伏诺拉生2mg的溶液，作为加标供试品溶液。

[0050] 对照品溶液制备：取吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸对照品适量，用5％乙腈溶液制成每1ml中含吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸分别为0.056μg、0.056μg、1.5μg的溶液，作为对照品溶液。

[0051] (3)加标供试品溶液和对照品检测及结果

[0052] 取5％乙腈溶液、加标供试品溶液和对照品溶液在(1)液相色谱条件下进样检测，检测结果参见表2～3和图1。

[0053] 表2加标供试品溶液分离度结果表

[0054]名称 保留时间/min 分离度
富马酸 2.913 ‑
吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.441 3.12
吡啶‑3‑磺酸乙酯 4.083 3.85
吡啶‑3‑磺酸 5.562 5.29

[0055] 表3对照品溶液结果表

[0056] 名称 保留时间/min 分离度吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.305 ‑
吡啶‑3‑磺酸乙酯 3.960 4.81
吡啶‑3‑磺酸 5.930 5.68

[0057] 结果表明，表明空白溶剂(5％乙腈溶液)不干扰吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸的测定；加标供试品与对照品溶液中，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸与相邻峰分离度均符合要求。

[0058] (4)检测限和检测限测定

[0059] 取(2)中的对照品溶液逐级稀释，考察杂质的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果参见表4～5。

[0060] 表4定量限检测结果

[0061]杂质 峰面积 S/N 定量限/％
吡啶‑3‑磺酸甲酯 956 15 0.001
吡啶‑3‑磺酸乙酯 1518 22 0.001
吡啶‑3‑磺酸 6944 42 0.010

[0062] 表5检测限检测结果

[0063] 杂质 峰面积 S/N 检测限/％吡啶‑3‑磺酸甲酯 448 5 0.0004
吡啶‑3‑磺酸乙酯 835 10 0.0004
吡啶‑3‑磺酸 3129 15 0.0051

[0064] 由表可见，本发明检测方法对吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸具有较低的检测限和定量限，检测灵敏度高。

[0065] 实施例2一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0066] 实施例2检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0)替换为0.02mol/L磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0)，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表6。

[0067] 表6加标供试品溶液分离度结果

[0068] 名称 保留时间/min 分离度富马酸 2.951 ‑
吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.436 3.03
吡啶‑3‑磺酸乙酯 4.076 3.78
吡啶‑3‑磺酸 5.536 5.29

[0069] 由表可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸与相邻峰分离度均符合要求。

[0070] 实施例3一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0071] 实施例3检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0)替换为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表7。

[0072] 表7加标供试品溶液分离度结果

[0073]名称 保留时间/min 分离度
富马酸 3.058 ‑
吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.438 3.10
吡啶‑3‑磺酸乙酯 4.081 3.86
吡啶‑3‑磺酸 5.548 5.27

[0074] 由表可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸与相邻峰分离度均符合要求。

[0075] 实施例4一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0076] 实施例4检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流速改为0.8ml/min，柱温改为45℃，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表8。

[0077] 表8加标供试品溶液分离度结果

[0078]

[0079]

[0080] 由表可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸与相邻峰分离度均符合要求。

[0081] 实施例5一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0082] 实施例5检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流速改为1.2ml/min，柱温改为25℃，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表9。

[0083] 表9加标供试品溶液分离度结果

[0084]名称 保留时间/min 分离度
富马酸 2.774 ‑
吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.036 2.76
吡啶‑3‑磺酸乙酯 3.809 3.53
吡啶‑3‑磺酸 5.593 5.84

[0085] 由表可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸与相邻峰分离度均符合要求。

[0086] 实施例6一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0087] 实施例6检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(2)对照品溶液的浓度根据供试品浓度调整为0.5mg/ml，其余参数参考实施例1。定量限和检测限结果参见表10～11。

[0088] 表10定量限检测结果

[0089]杂质 峰面积 S/N 定量限/％
吡啶‑3‑磺酸甲酯 357 12 0.002
吡啶‑3‑磺酸乙酯 436 15 0.002
吡啶‑3‑磺酸 1309 21 0.008

[0090] 表11检测限检测结果

[0091] 杂质 峰面积 S/N 检测限/％吡啶‑3‑磺酸甲酯 184 3 0.0008
吡啶‑3‑磺酸乙酯 176 4 0.0007
吡啶‑3‑磺酸 651 7 0.004

[0092] 由表可见，本发明检测方法对吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸具有较低的检测限和定量限，检测灵敏度高。

[0093] 实施例7一种同时测定富马酸伏诺拉生中吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯3种杂质的检测方法

[0094] 实施例7检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(2)中的流5％乙腈溶液替换为2％乙腈溶液，其余参数参考实施例1。对照品溶液检测结果参见表12。

[0095] 表12对照品溶液分离度结果

[0096]名称 保留时间/min 峰面积
吡啶‑3‑磺酸甲酯 3.221 3440
吡啶‑3‑磺酸乙酯 3.883 3789
吡啶‑3‑磺酸 5.648 68560

[0097] 结果表明，空白溶剂(2％乙腈溶液)不干扰吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸的测定，且吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸具有较强的响应值。

[0098] 对比例1一种测定富马酸伏诺拉生中杂质的检测方法

[0099] 对比例1检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的色谱柱改为Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表13和图2。

[0100] 表13加标供试品溶液分离度结果

[0101] 名称 保留时间/min 分离度富马酸 2.252 ‑
吡啶‑3‑磺酸甲酯 2.507 未基线分离
吡啶‑3‑磺酸乙酯 2.943 ‑
吡啶‑3‑磺酸 4.636 10.45

[0102] 由表和图可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯与富马酸峰未完全分离，分离度不符合要求，吡啶‑3‑磺酸乙酯也无法计算得到分离度。

[0103] 对比例2一种测定富马酸伏诺拉生中杂质的检测方法

[0104] 对比例2检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(2)中的流5％乙腈溶液分别替换为10％、20％、25％乙腈溶液，其余参数参考实施例1。

[0105] 结果显示，用分别10％、20％、25％乙腈溶液替换5％乙腈溶液后，吡啶‑3‑磺酸乙酯保留时间3.840min作用分别有峰面积为300、786、852的干扰峰。

[0106] 对比例3一种测定富马酸伏诺拉生中杂质的检测方法

[0107] 对比例3检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(2)中的流5％乙腈溶液分别替换为50％甲醇溶液、50％乙腈溶液，以5％乙腈溶液作为对比，其余参数参考实施例1。对照品溶液检测结果参见表14和图3。

[0108] 表14对照品溶液检测结果

[0109]配样溶剂 吡啶‑3‑磺酸检测峰面积
50％乙腈 2007
50％甲醇 3548
实施例1的配样溶剂5％乙腈 72894

[0110] 由表和图可见，用50％甲醇溶液、50％乙腈溶液配置对照品溶液，其吡啶‑3‑磺酸的检测峰面积响应值非常低，不满足检测要求。

[0111] 对比例4一种测定富马酸伏诺拉生中杂质的检测方法

[0112] 对比例4检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流动相改为：

[0113] 流动相A：0.022mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至2.5)‑乙腈(90：10)[0114] 流动相B：0.022mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至2.5)‑乙腈(30：70)[0115] 其余参数参考实施例1，其中，对照品溶液中的吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸分别按照浓度单独配制并检测，检测结果参见图5。

[0116] 由图可见，检测方法中的吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯均在1.9min出峰(在仪器死体积内)，方法初始比例有机相比例过高，不适宜。

[0117] 对比例5一种测定富马酸伏诺拉生中杂质的检测方法

[0118] 对比例5检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流动相A改为：0.1％甲酸溶液，其余参数参考实施例1，对照品溶液检测结果参见表15。

[0119] 表15对照品溶液检测结果

[0120] 名称 保留时间/min吡啶‑3‑磺酸甲酯 0.907
吡啶‑3‑磺酸乙酯 0.977
吡啶‑3‑磺酸 1.120

[0121] 由表可见，检测方法中的吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯均在1min出峰，无法分离。

[0122] 应用例1方法学考察

[0123] (1)线性和范围试验

[0124] 分别精密量取实施例1(2)对照品储备液适量，分别制备吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯浓度为0.01～0.1μg/ml、吡啶‑3‑磺酸浓度为0.3～3μg/ml的对照品溶液；照实施例1(1)液相色谱条件，进样检测。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数，结果参见表16～18。

[0125] 表16吡啶‑3‑磺酸甲酯线性结果

[0126]

[0127] 表17吡啶‑3‑磺酸乙酯线性结果

[0128]

[0129]

[0130] 表18吡啶‑3‑磺酸线性结果

[0131]

[0132] 由表可知，吡啶‑3‑磺酸甲酯在0.0115μg/ml～0.1145μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为0.9998，Y轴截距在100％浓度响值之比为2.9％；吡啶‑3‑磺酸乙酯在0.0117μg/ml～0.1167μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为0.9984，Y轴截距在100％浓度响值之比为0.9％；吡啶‑3‑磺酸在0.3067μg/ml～3.0668μg/ml之间，峰面积与浓度呈良好线性关系，其中r为1.0000，Y轴截距在100％浓度响值之比为0.3％。

[0133] (2)精密度试验

[0134] 按照实施例1条件，取对照品溶液连续进样6次，计算吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸各峰面积及RSD，结果参见表19。

[0135] 表19对照品进样精密度结果

[0136]

[0137]

[0138] 由表可见，本发明检测方法检测的对照品溶液主峰峰面积RSD均小于10.0％，精密度良好。

[0139] (3)准确度试验

[0140] 按照实施例1步骤(2)中加标供试品溶液的配制方法，配制6份限度浓度(吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸浓度分别为0.056μg/ml、0.056μg/ml、1.5μg/ml)的加标供试品溶液，照实施例1步骤(1)中液相色谱条件，进样检测。按外标法以峰面积计算吡啶‑3‑磺酸、吡啶‑3‑磺酸甲酯和吡啶‑3‑磺酸乙酯含量，结果参见表20～21。

[0141] 表20吡啶‑3‑磺酸甲酯、乙酯回收率结果

[0142]

[0143] 表21吡啶‑3‑磺酸回收率结果

[0144]

[0145]

[0146] 由表可见，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯平均回收率为83％，单个回收率在75％～90％之间，RSD为6.4％；吡啶‑3‑磺酸平均回收率为100％，单个回收率在99％～
101％之间，RSD为0.4％；均小于20.0％，准确度高。

[0147] (4)溶液稳定性试验

[0148] 按照实施例1步骤(2)中配制方法配制对照品溶液，并将对照品溶液分别于室温放置0h、4h、8h、12h后，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定并计算各时间点各杂质峰面积与0小时峰面积相比的相对变化率，结果参见表22。

[0149] 表22对照品溶液稳定性结果

[0150]

[0151] 由表可见，与0h相比，对照品溶液放置8小时后，吡啶‑3‑磺酸甲酯、吡啶‑3‑磺酸乙酯、吡啶‑3‑磺酸峰面积变化率均小于5％，对照品溶液室温放置8小时内稳定。

[0152] 应用例2供试品溶液测定

[0153] 应用例2采用实施例1的实验方法和条件，对随机抽检的供试品溶液进行测定，测定结果参见图6。

[0154] 由图可见，该供试品中存在吡啶‑3‑磺酸乙酯和吡啶‑3‑磺酸杂质，并且均被本发明方法检测出；其中，吡啶‑3‑磺酸乙酯含量较吡啶‑3‑磺酸更低，但是在本发明方法中仍有响应值，可以被检测得到，并且分离度均较好。

[0155] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。