一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法

摘要

本发明属于分析化学技术领域，提供了一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法。本发明中，采用硫代葡萄糖苷类化合物共有的二级质谱碎片，达到高效定性的目的；在这些二级质谱碎片中，基于m/z为96.0的碎片构建一套母离子(precursor ion)模式扫描定性方法，既能够保证检测灵敏度，又能提高定性准确率，减少假阳性检测结果；基于m/z为96.0的碎片为定量离子，利用硫代葡萄糖苷类化合物标准品，构建一套多反应监测(MRM)模式扫描定量方法，完成样品中所有硫代葡萄糖苷类化合物定量分析，破解因某些标准品获取困难导致的无法定量分析的难题，高效完成样品中该类化合物单独定量及总量测定。

权利要求

1.一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法，包括以下步骤：待测样品和提取剂混合，依次进行提取和固液分离，得到上清液作为待测溶液；

利用第一超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定性分析；

利用第二超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定量分析，得到所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积；

将所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积代入硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线中，得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的含量；

所述第一超高液相色谱与质谱分析的参数包括第一超高液相色谱参数和第一质谱参数：所述第一超高液相色谱参数包括：色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100 mm×2.1 mm，3.5 μm 100Å；

色谱柱温度为40℃；

流动相A相为乙腈，流动相B相为5mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.3 mL/min；进样体积为3 μL；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱为：

0 1 min，90%A；

~

1 9 min，90% 65%A；

~ ~

所述第一质谱参数包括：

扫描模式为母离子扫描，负离子模式；

电喷雾电压为‑4.5 kV，离子源温度为450℃，子离子为96.0 Da，母离子扫描范围为

300.0 800.0 Da，扫描速率为200 Da/s，气帘气40.00 psi，喷雾气45 psi，辅助加热气45 ~psi；

所述第二超高液相色谱与质谱分析的参数包括第二超高液相色谱参数和第二质谱参数：所述第二超高液相色谱参数包括：色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100 mm×2.1 mm，3.5 μm 100Å；

色谱柱温度为40℃；

流动相A相为乙腈，流动相B相为5 mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.3 mL/min；进样体积为3 μL；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱包括：

0 1 min，90%A；

~

1 9 min，90% 65%A；

~ ~

所述第二质谱参数包括：

扫描模式：MRM；

电喷雾电压为‑4.5 kV，离子源温度为450℃，扫描速率为200 Da/s，气帘气40.00 psi，喷雾气45 psi，辅助加热气45 psi；

所述硫代葡萄糖苷类化合物标准品包括3‑丁烯基硫苷标准品、4‑羟基苄基硫苷标准品或黑芥子硫苷标准品；

基于m/z为96.0的碎片构建一套母离子模式扫描定性方法；

基于m/z为96.0的碎片为定量离子，利用硫代葡萄糖苷类化合物标准品，构建一套多反应监测模式扫描定量方法。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品的粒径为250 830 μm。

~

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品通过以下步骤制备得到：将待测原料依次进行冷冻干燥和粉碎，得到所述待测样品。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待测原料包括花椰菜或绿花菜叶。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为‑40 ‑60℃，时~间为12 48 h。

~

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取剂为体积浓度为60 90%的甲~醇水溶液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品和提取剂的用量比为（0.1 0.5）g：（5 50）mL。

~ ~

8.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述提取包括依次进行浸提和超声辅助提取；所述浸提的温度为60 90℃，时间为20 60 min。

~ ~

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述超声辅助提取的温度为30 60℃，~频率为30 50 kHz，时间为10 min。

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说明书

一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法。

背景技术

[0002] 硫代葡萄糖苷(glucosinolates，GLS)简称硫苷，是十字花科蔬菜中重要的次生代谢产物，目前已发现的硫苷有100余种，不同品种蔬菜中的硫苷种类及含量有明显差异。根据硫苷中侧链R基团的不同，可把硫苷分为3类，分别为脂肪类、芳香类和吲哚类硫苷。当含有硫苷的蔬菜被食用或机械破碎时，会释放内源性的芥子酶(myrosinase)，其将硫苷中的β‑硫苷键酶解，从而生成异硫氰酸酯(isothiocyanates)。研究表明，异硫氰酸酯具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病等作用。其中，4‑甲基亚砜基丁基硫苷(glucoraphanin)的酶解产物萝卜硫素(sulforaphane)是迄今为止发现的最强的Phase II酶诱导剂，能使致癌基因失去作用。

[0003] 目前文献报道的对花椰菜中硫苷测定方法主要有以下几种：(1)近红外反射谱法(NIRS)，主要是通过已知标品建立红外分析模型，对比样品数据，快速测定硫苷含量；近红外反射谱法可以无损检测，采样量少，但是需要大量标品去建立可信模型。(2)荧光检测法，主要原理为硫苷在芥子酶的作用下降解得到葡萄糖，其在葡萄糖氧化酶作用下得到葡萄糖酸，再与试剂反应生成荧光活性物质；荧光检测法检测步骤繁多，会导致检测结果误差增大。(3)胶束电动毛细管电泳法(HPCED)，主要是利用硫苷分子所带电荷不同，加入表面活性剂，在硼酸盐缓冲体系中分离硫苷；胶束电动毛细管电泳法干扰因素少，成本低，但是分离时间长。(4)气相测谱法(GC)，即将硫苷酶解得到异硫氰酸盐，再用气相色谱测定；气相色谱法无法检测出受热易分解的硫苷。(5)采用高效液相色谱(HPLC)联合紫外检测器(UV)或者二极管阵列(DAD)测定硫苷，以及利用柱前衍生化(pre‑column derivatization)对异硫氰酸酯进行衍生化修饰，再利用高效液相色谱(HPLC)进行测定；(6)采用高效液相色谱(HPLC)联合质谱(MS)方法测定硫苷及异硫氰酸酯；高效液相色谱因可同时测定各种硫苷的含量，重现性与精密度尚可，在实际应用中比较普遍，但是该方法的检测限及其灵敏度较差，在硫苷含量较低的花椰菜品种上存在方法应用的局限性。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法。本发明提供的检测方法检测限低、灵敏度高。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法，包括以下步骤：

[0007] 待测样品和提取剂混合，依次进行提取和固液分离，得到上清液作为待测溶液；

[0008] 利用第一超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定性分析；

[0009] 利用第二超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定量分析，得到所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积；

[0010] 将所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积代入硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线中，得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的含量；

[0011] 所述第一超高液相色谱与质谱分析的参数包括第一超高液相色谱参数和第一质谱参数：

[0012] 所述第一超高液相色谱参数包括：

[0013] 色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm

[0014] 色谱柱温度为30～50℃；

[0015] 流动相A相为乙腈，流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；进样体积为3～6μL；

[0016] 洗脱方式为梯度洗脱；

[0017] 所述梯度洗脱为：

[0018] 0～1min，90％A；

[0019] 1～9min，90％～65％A；

[0020] 所述第一质谱参数包括：

[0021] 扫描模式为母离子扫描，负离子模式；

[0022] 电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，子离子为96.0Da，母离子扫描范围为300.0～800.0Da，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi；

[0023] 所述第二超高液相色谱与质谱分析的参数包括第二超高液相色谱参数和第二质谱参数：

[0024] 所述第二超高液相色谱参数包括：

[0025] 色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm

[0026] 色谱柱温度为30～50℃；

[0027] 流动相A相为乙腈，流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；进样体积为3～6μL；

[0028] 洗脱方式为梯度洗脱；

[0029] 所述梯度洗脱包括：

[0030] 0～1min，90％A；

[0031] 1～9min，90％～65％A；

[0032] 所述第二质谱参数包括：

[0033] 扫描模式：MRM；

[0034] 电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0035] 优选地，所述待测样品的粒径为250～830μm。

[0036] 优选地，所述待测样品通过以下步骤制备得到：

[0037] 将待测原料依次进行冷冻干燥和粉碎，得到所述待测样品。

[0038] 优选地，所述待测原料包括花椰菜或绿花菜叶。

[0039] 优选地，所述冷冻干燥的温度为‑40～‑60℃，时间为12～48h。

[0040] 优选地，所述提取剂为体积浓度为60～90％的甲醇水溶液。

[0041] 优选地，所述待测样品和提取剂的用量比为(0.1～0.5)g：(5～50)mL。

[0042] 优选地，所述提取包括依次进行浸提和超声辅助提取；所述浸提的温度为60～90℃，时间为20～60min。

[0043] 优选地，所述超声辅助提取的温度为30～60℃，频率为30～50kHz，时间为10min。

[0044] 优选地，所述硫代葡萄糖苷类化合物标准品包括3‑丁烯基硫苷标准品、戊基硫苷标准品、1‑甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、3‑(甲基亚磺酰基)丙基硫苷标准品、4‑甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、4‑羟基苄基硫苷标准品、4‑(甲基亚磺酰基)丁基硫苷标准品、黑芥子硫苷标准品、1,4‑二甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、己基硫苷标准品、3‑甲硫基‑丙基硫苷标准品、5‑(甲基亚磺酰基)戊基硫苷标准品、3‑吲哚基甲基硫苷标准品、4‑(甲硫基)丁基硫苷标准品、豆瓣菜苷标准品、4‑羟基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品或2‑羟基‑3‑丁烯基硫苷标准品。

[0045] 本发明提供了一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法，包括以下步骤：待测样品和提取剂混合，依次进行提取和固液分离，得到上清液作为待测溶液；利用第一超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定性分析；利用第二超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定量分析，得到所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积；将所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积代入硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线中，得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的含量；所述第一超高液相色谱与质谱分析的参数包括第一超高液相色谱参数和第一质谱参数：所述第一超高液相色谱参数包括：色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm 色谱柱温度为30～50℃；流动相A相为乙腈，流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；进样体积为3～6μL；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱为：0～1min，90％A；1～9min，90％～65％A；所述第一质谱参数包括：扫描模式为母离子扫描，负离子模式；电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，子离子为96.0Da，母离子扫描范围为300.0～
800.0Da，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi；所述第二超高液相色谱与质谱分析的参数包括第二超高液相色谱参数和第二质谱参数：所述第二超高液相色谱参数包括：色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm 色谱柱温度为30～50℃；流动相A相为乙腈，流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.2～
0.5mL/min；进样体积为3～6μL；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱包括：0～1min，90％A；
1～9min，90％～65％A；所述第二质谱参数包括：扫描模式：MRM；电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0046] 本发明中，采用硫代葡萄糖苷类化合物共有的二级质谱碎片，达到高效定性的目的；在这些二级质谱碎片中，基于m/z为96.0的碎片构建一套母离子(precursor ion)模式扫描定性方法，既能够保证检测灵敏度，又能提高定性准确率，减少假阳性检测结果；基于m/z为96.0的碎片为定量离子，利用硫代葡萄糖苷类化合物标准品，构建一套多反应监测(MRM)模式扫描定量方法，完成样品中所有硫代葡萄糖苷类化合物定量分析，破解因某些标准品获取困难导致的无法定量分析的难题，高效完成样品中该类化合物单独定量及总量测定。实施例的数据表明：本发明提供的检测方法对不同硫代葡萄糖苷类化合物的检出限为0.1nM；定量限为0.5nM，具有较高的灵敏度。

[0047] 进一步地，本发明采用通过在60～90℃浸提30min后直接离心过滤上机，效率远高于现有检测方法，极大缩短了检测时间，提高了检测通量。

[0048] 本发明所提供的检测方法具有操作简单、样品通量高、检测准确度高的优点，能高效、准确完成样本中硫代葡萄糖苷类化合物定性定量分析，适用于十字花科蔬菜等植物硫代葡萄糖苷类化合物的定性定量分析及其在育种、营养品质评价等领域的应用。

附图说明

[0049] 图1为硫代葡萄糖苷类化合物质谱裂解规律及主要碎片结构图；

[0050] 图2为利用第一超高液相色谱与质谱分析对花椰菜样品进行定性分析不同子离子对应的检测色谱图；

[0051] 图3为利用第二超高液相色谱与质谱分析对花椰菜样品进行定量分析所得色谱图；

[0052] 图4为体积浓度70％的甲醇水溶液中黑芥子苷的标准曲线图；

[0053] 图5为绿花菜叶样品基质中黑芥子苷的标准曲线图。

具体实施方式

[0054] 本发明提供了一种硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法，包括以下步骤：

[0055] 待测样品和提取剂混合，依次进行提取和固液分离，得到上清液作为待测溶液；

[0056] 利用第一超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定性分析；

[0057] 利用第二超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定量分析，得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积；

[0058] 将所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积代入硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线中，得到所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的含量。

[0059] 在本发明中，如无特殊说明，所用原料均优选为市售产品。

[0060] 本发明将待测样品和提取剂混合，依次进行提取和固液分离，得到上清液作为待测溶液。

[0061] 在本发明中，所述待测样品的粒径优选为250～830μm。在本发明中，所述待测样品优选通过以下步骤制备得到：

[0062] 将待测原料依次进行冷冻干燥和粉碎，得到所述待测样品。

[0063] 在本发明中，所述待测原料优选为花椰菜或绿花菜叶。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为‑40～‑60℃，时间优选为12～48h。本发明对所述粉碎的操作不做具体限定，只要保证所述待测样品的粒径为250～830μm即可。

[0064] 在本发明中，所述提取剂优选为体积浓度为60～90％的甲醇水溶液，进一步优选为体积浓度为70～80％的甲醇水溶液，在本发明的具体实施例中，所述提取剂优选为体积浓度为70％的甲醇水溶液。

[0065] 在本发明中，所述待测样品和提取剂的用量比优选为(0.1～0.5)g：(5～50)mL，进一步优选为0.2g：(10～30)mL，更优选为0.2g：20mL。

[0066] 在本发明中，所述提取优选包括依次进行浸提和超声辅助提取。

[0067] 在本发明中，所述浸提的温度优选为60～90℃，进一步优选为70～80℃；所述浸提的时间优选为20～60min，进一步优选为30～50min，更优选为40min。在本发明中，所述浸提优选在水浴的条件下进行。在本发明中，所述浸提的过程优选为：每浸提5min振荡摇匀，至浸提结束。

[0068] 在本发明中，所述超声辅助提取的温度优选为30～60℃，进一步优选为40～50℃；频率优选为30～50kHz，进一步优选为35～45kHz，更优选为40kHz；时间优选为10min。

[0069] 在本发明中，所述待测样品和提取剂混合之前，优选分别加热至浸提的温度。

[0070] 在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选≥4000rpm，进一步优选为4000～6000rpm；所述离心的时间优选为5～10min。

[0071] 在本发明中，所述待测溶液中硫代葡萄糖苷类化合物的浓度优选在建立标准曲线时标准溶液中硫代葡萄糖苷类化合物的浓度范围内；若所述待测溶液中硫代葡萄糖苷类化合物生物浓度不在建立标准曲线时标准溶液中硫代葡萄糖苷类化合物的浓度范围内，优选进行稀释；所述稀释的试剂优选与提取剂一致。

[0072] 得到待测溶液后，本发明利用第一超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定性分析。

[0073] 在本发明中，所述第一超高液相色谱与质谱分析的参数包括第一超高液相色谱参数和第一质谱参数：

[0074] 所述第一超高液相色谱参数包括：

[0075] 色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm

[0076] 色谱柱温度为30～50℃，优选为40℃；

[0077] 流动相A相为乙腈；流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液，优选为6～9mmol/L乙酸铵水溶液，进一步优选为7～8mmol/L乙酸铵水溶液，在本发明的具体实施例中，流动相B优选为5mmol/L乙酸铵水溶液；

[0078] 流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min；进样体积为3～6μL，优选为4～5μL，在本发明的具体实施例中，进样体积优选为3μL；

[0079] 洗脱方式为梯度洗脱；

[0080] 所述梯度洗脱为：

[0081] 0～1min，90％A；

[0082] 1～9min，90％～65％A；

[0083] 所述第一质谱参数包括：

[0084] 扫描模式为母离子扫描，负离子模式；

[0085] 电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，子离子为96.0Da，母离子扫描范围为300.0～800.0Da，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0086] 在本发明中，所述第一超高液相色谱与质谱分析的质谱仪器优选为AB Science 5500三重四级杆质谱仪。

[0087] 得到待测液后，本发明利用第二超高液相色谱与质谱分析对所述待测溶液进行定量分析，得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积。

[0088] 在本发明中，所述第二超高液相色谱与质谱分析的参数包括第二超高液相色谱参数和第二质谱参数：

[0089] 所述第二超高液相色谱参数包括：

[0090] 色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm，3.5μm

[0091] 色谱柱温度为30～50℃，优选为40℃；

[0092] 流动相A相为乙腈；流动相B相为5～10mmol/L乙酸铵水溶液，优选为6～9mmol/L乙酸铵水溶液，进一步优选为7～8mmol/L乙酸铵水溶液，在本发明的具体实施例中，流动相B优选为5mmol/L乙酸铵水溶液；

[0093] 流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min；进样体积为3～6μL，优选为4～5μL，在本发明的具体实施例中，进样体积优选为3μL；

[0094] 洗脱方式为梯度洗脱；

[0095] 所述梯度洗脱包括：

[0096] 0～1min，90％A；

[0097] 1～9min，90％～65％A；

[0098] 所述第二质谱参数包括：

[0099] 扫描模式：MRM；

[0100] 电喷雾电压为‑4.5kV，离子源温度为450℃，扫描速率为200Da/s，气帘气40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0101] 在本发明中，所述第二超高液相色谱与质谱分析的质谱仪器优选为AB Science 5500三重四级杆质谱仪。

[0102] 得到待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积后，本发明将所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的色谱峰面积代入硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线中，得到所述待测样品中硫代葡萄糖苷类化合物的含量。

[0103] 在本发明中，所述硫代葡萄糖苷类化合物标准品优选包括3‑丁烯基硫苷标准品、戊基硫苷标准品、1‑甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、3‑(甲基亚磺酰基)丙基硫苷标准品、4‑甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、4‑羟基苄基硫苷标准品、4‑(甲基亚磺酰基)丁基硫苷标准品、黑芥子硫苷标准品、1,4‑二甲氧基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品、己基硫苷标准品、3‑甲硫基‑丙基硫苷标准品、5‑(甲基亚磺酰基)戊基硫苷标准品、3‑吲哚基甲基硫苷标准品、4‑(甲硫基)丁基硫苷标准品、豆瓣菜苷标准品、4‑羟基‑3‑吲哚基甲基硫苷标准品或2‑羟基‑3‑丁烯基硫苷标准品，进一步优选为黑芥子硫苷标准品。

[0104] 本发明对所述硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线的建立方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的建立标准曲线的方式即可。

[0105] 在本发明中，所述硫代葡萄糖苷类化合物标准品的浓度‑色谱峰面积标准曲线优选以硫代葡萄糖苷类化合物标准品的色谱峰面积为Y轴，以硫代葡萄糖苷类化合物标准品的摩尔浓度为X轴。

[0106] 图1为硫代葡萄糖苷类化合物质谱裂解规律及主要碎片结构图。

[0107] 下面结合实施例对本发明提供的硫代葡萄糖苷类化合物的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0108] 实施例1样品处理

[0109] 称取冻干(冷冻干燥的温度‑50℃，时间为48h)后粉碎的花椰菜粉末(250～830μm)0.20g样品在75℃预热10min，加入预热至75℃的70vol％甲醇水溶液20mL，在75℃水浴条件下浸提20min，浸提过程中每隔5min震荡摇匀，浸提后室温超声辅助提取10min，频率为
40kHz；于4000rpm离心分离5min。取上清液100μL于1.5mL离心管中，加入900μL体积浓度为
70％甲醇溶液震荡摇匀，过滤膜(0.22μm)，4℃保存待上机。

[0110] 实施例2仪器方法和标准品配制与保存

[0111] 1、仪器设备

[0112] Waters Acquity UPLC液相色谱仪(美国Waters公司)、AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)、涡旋混合器、高速离心机、氮气吹干仪、电子分析天平、移液枪等。

[0113] 2、材料和试剂

[0114] 3‑丁烯基硫苷(Gluconapin)、4‑羟基苄基硫苷(Sinalbin)、黑芥子硫苷(Sinigrin)等标准品购买自上海源叶生物科技有限公司；色谱纯乙腈、甲醇等购自上海泰坦科技股份有限公司。

[0115] 3、标准品溶液配制与保存

[0116] 分别准确称取5mg Gluconapin、Sinalbin、Sinigrin的标准品至容量瓶，使用超纯水定容至10mL，作为标准贮备液避光保存于‑20℃。取标准储备液适量使用70vol％甲醇水溶液配置成10μM混合工作液，并进行梯度系列稀释。

[0117] 实施例3硫代葡萄糖苷类化合物定性分析

[0118] 利用第一超高液相色谱与质谱分析对实施例1所得上机样品进行定性分析。

[0119] 所述第一超高液相色谱与质谱分析的参数包括第一超高液相色谱参数和第一质谱参数；

[0120] 第一超高液相色谱参数包括：色谱柱为Merck ZIC‑HILIC柱，100mm×2.1mm(i.d.)，3.5μm 色谱柱温度优选40℃；流动相A相为乙腈，流动相B相为5mmol/L乙酸铵水溶液；流速为0.3mL/min；进样体积为3μL；梯度洗脱条件：0～1min，90％A；1～9min，90％～65％A；

[0121] 第一质谱参数包括：扫描模式：母离子扫描(precursor ion)模式扫描，优选负离子模式；电喷雾电压为‑4.5kV；离子源温度为450℃；母离子扫描范围为300.0～800.0Da，扫描速率为200Da/s，气帘气(CUR)40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0122] 基于硫代葡萄糖苷类化合物的化学结构综合分析，均能产生m/z值74.99、95.95、96.96、195.00、259.00、275.00等子离子，利用这些子离子开展precursor ion模式分析，结果如图2所示。从图2可以看出：m/z 95.95具有较高的灵敏度和定性准确度。

[0123] 实施例4硫代葡萄糖苷类化合物定量分析条件

[0124] 利用第二超高液相色谱与质谱分析对实施例1所得上机样品进行定量分析。

[0125] 所述第二超高液相色谱与质谱分析的参数包括第二超高液相色谱参数和第二质谱参数

[0126] 第二超高液相色谱参数与第一超高液相色谱参数相同；

[0127] 第二质谱参数包括：扫描模式：MRM，电喷雾电压为‑4.5kV；离子源温度为450℃；扫描速率为200Da/s，气帘气(CUR)40.00psi，喷雾气45psi，辅助加热气45psi。

[0128] 硫代葡萄糖苷质谱参数如表1所示。

[0129] 表1硫代葡萄糖苷类化合物MRM分析的质谱参数

[0130]

[0131]

[0132] 所得谱图如图3所示，从图3可以看出：本发明提供的检测方法能够使样品中各化合物峰型对称，分离度较好。

[0133] 实施例5基质效应分析

[0134] 首先选取黑芥子硫苷标准品，358/96为定量离子对，以绿花菜叶提取物建立基质标准曲线，以体积浓度为70％的甲醇溶液建立溶剂标准曲线，结果分别如图4和5所示。从图4和5中可以看出：基质效应＝k(基质)/k(溶剂)‑1＝‑0.098，为弱基质效应，说明该提取方法的基质效应不明显。

[0135] 实施例6定量精度验证

[0136] 将另外两个标准品4‑羟基苄基硫苷和3‑(甲基亚磺酰基)丙基硫苷与黑芥子硫苷配制成相同浓度，并用黑芥子硫苷标准曲线计算测得浓度，以此考察利用等效定量离子法的可靠性，结果如表2所示。

[0137] 表2定量精度验证

[0138]

[0139] 从表2可以看出：这两个标准品的检测浓度和实际浓度的偏差均在15％以内，说明该方法可靠，能够用来对其他硫苷类化合物进行定量分析。

[0140] 实施例7加标回收验证

[0141] 基于以上结果，开展3种标准品的加标回收实验。在绿花菜叶样品中加入3种标准品(4‑羟基苄基硫苷、3‑丁烯基硫苷与黑芥子硫苷)2nmol使得提取液中标准品浓度均为100nmol/L，同样利用黑芥子硫苷标准曲线计算3种标准品的测得浓度，结果如表3所示。

[0142] 表3加标回收验证

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[0145] 从表3可以看出：这3个标准品的检测浓度和实际浓度的偏差均在15％以内，该方法回收率较可靠，可以应用此方法开展花椰菜中硫苷类化合物定量分析。

[0146] 实施例8方法灵敏度

[0147] 检测限(LOD)是指在样品基质相应溶液中目标物定量离子为3倍信噪比(S/N＝10)时的浓度。定量限(LOQ)是指在样品基质相应溶液中目标物定量离子为10倍信噪比(S/N＝10)时的浓度。通过实验测得该方法对不同硫代葡萄糖苷类化合物的检出限为0.1nM；定量限为0.5nM。

[0148] 实施例9盲样测试

[0149] 不同十字花科蔬菜样品，由其他试验人员按照本发明的检测方法进行测试。结果表明所有定量结果均达到满意结果。

[0150] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。