一种检测生物硫醇的近红外荧光探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测生物硫醇的近红外荧光探针及其制备方法，首先，以异佛尔酮和丙二腈为原料，通过Knoevenagel缩合反应合成TEM；以2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠为原料，通过环化和水解反应合成7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；之后以7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺为原料，通过卤化和水解反应合成7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；再以TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素为原料，经过Knoevenagel缩合反应合成中间体TX‑OH；最后以TX‑OH和丙烯酰氯为原料，合成荧光探针。该荧光探针对硫醇具有较好的选择性，且不受其它氨基酸的干扰。可用于生物样品中生物硫醇的检测，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，其特征在于，荧光探针具有如下式(Ⅰ)所示结构式： (Ⅰ)。

2.一种如权利要求1所述的检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，以异佛尔酮和丙二腈为原料，通过Knoevenagel缩合反应合成中间体(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈；

步骤2，以2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠为原料，通过环化和水解反应合成中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；具体为：将2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠及催化剂三乙胺溶于乙酸酐中，加热回流12h，向反应液中注入水，抽滤得到砖红色固体，洗涤后烘干，柱色谱分离纯化，将所得产物溶解于二氯甲烷中继续反应，并加入乙酸酐和吡啶作为催化剂，室温下搅拌24h，之后使用二氯甲烷和水萃取，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥，过滤后减压旋转蒸发去除有机溶剂并使用柱色谱分离纯化，得到中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠的摩尔比为

1：1；

步骤3，以步骤2中所得中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺为原料，通过卤化和水解反应合成中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；具体为：以偶氮二异丁腈为自由基反应引发剂，将其与7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺溶于四氯化碳中，加热回流8h，减压旋蒸去除有机溶剂，加入乙酸钠使其溶解于乙酸酐，加热回流12h，之后加入盐酸溶液继续搅拌，冷却至室温，抽滤，冰水洗涤，得到棕色固体，即为中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：2；

步骤4，以步骤1和步骤3所得中间体(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈和7‑羟基‑

3‑醛基‑香豆素为原料，经过Knoevenagel缩合反应合成中间体(3‑(7‑羟基‑3‑乙烯基香豆素)‑5 , 5‑二甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈；具体为：将(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素及催化剂溶于无水乙醇中，在50℃条件下反应4h，反应结束后冷却至室温，过滤得到红色固体沉淀，并用无水乙醇反复洗涤，即可得到中间体(3‑(7‑羟基‑3‑乙烯基香豆素)‑5 , 5‑二甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈；(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素的摩尔比为1：

1，催化剂为哌啶；

步骤5，以步骤4所得中间体(3‑(7‑羟基‑3‑乙烯基香豆素)‑5 , 5‑二甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈和丙烯酰氯为原料，合成荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，具体为：将异佛尔酮、丙二腈及催化剂溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，以氩气作为保护气体，在120℃的条件下搅拌6h，反应结束后冷却至室温，将反应混合溶液注入冰水中，析出棕色固体，干燥并使用柱色谱分离纯化，得到中间体(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈；

催化剂为乙酸酐、冰醋酸和哌啶混合而成的粘稠液；异佛尔酮与丙二腈的摩尔比为1：

1。

4.根据权利要求2所述的一种检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，具体为：将(3‑(7‑羟基‑3‑乙烯基香豆素)‑5  , 5‑二甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈和丙烯酰氯及催化剂溶于二氯甲烷，室温下搅拌，TLC监测反应进程至结束，减压旋干溶剂，柱色谱分离纯化，即可得到荧光探针；(3‑(7‑羟基‑3‑乙烯基香豆素)‑5 , 5‑二甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈与丙烯酰氯的摩尔比为1：2，催化剂为三乙胺。

说明书

一种检测生物硫醇的近红外荧光探针及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，还涉及该近红外荧光探针的制备方法。

背景技术

[0002] 半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和还原性谷胱甘肽(GSH)被统称为生物硫醇。作为生物体内大量存在的小分子巯基物种，在平衡氧化还原过程和减轻自由基和毒素造成的损害中扮演着非常重要的作用。研究证明，生物硫醇水平的浮动与许多人类疾病的产生存在极大的相关性，如心脏病、生长不良、皮肤损伤、肝损伤、骨质疏松和阿尔兹海默症等。
因此，生物体内Cys/Hcy/GSH的检测，对于理解疾病的产生和发展将产生积极的、有意义的影响。

[0003] 荧光探针分子一般由荧光团、连接臂和识别基团组成。一般荧光探针分子发射波长较短，通常受到生物样品自身背景的干扰，造成假阳性信号。而近红外(650～900nm)荧光发射可有效减小该干扰因素。因此，近红外荧光探针的发展将极大促进生物样品检测的准确性。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，该荧光探针分子对生物硫醇的检测具有良好的选择性和抗干扰能力。

[0005] 本发明另一的目的在于提供上述检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法。

[0006] 本发明所采用的技术方案是，一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，荧光探针具有如下式(Ⅰ)所示结构式：

[0007]

[0008] 本发明所采用的另一技术方案是，一种检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0009] 步骤1，以异佛尔酮和丙二腈为原料，通过Knoevenagel缩合反应合成中间体TEM；

[0010] 步骤2，以2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠为原料，通过环化和水解反应合成中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；

[0011] 步骤3，以步骤2中所得中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺为原料，通过卤化和水解反应合成中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；

[0012] 步骤4，以步骤1和步骤3所得中间体TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素为原料，经过Knoevenagel缩合反应合成中间体TX‑OH；

[0013] 步骤5，以步骤4所得中间体TX‑OH和丙烯酰氯为原料，合成荧光探针。

[0014] 本发明的特点还在于，

[0015] 步骤1中，具体为：

[0016] 将异佛尔酮、丙二腈及催化剂溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，以氩气作为保护气体，在120℃的条件下搅拌6h，反应结束后冷却至室温，将反应混合溶液注入冰水中，析出棕色固体，干燥并使用柱色谱分离纯化，得到中间体TEM；

[0017] 催化剂为乙酸酐、冰醋酸和哌啶混合而成的粘稠液；异佛尔酮与丙二腈的摩尔比为1：1。

[0018] 步骤2中，具体为：

[0019] 将2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠及催化剂三乙胺溶于乙酸酐中，加热回流12h，向反应液中注入水，抽滤得到砖红色固体，洗涤后烘干，柱色谱分离纯化，将所得产物溶解于二氯甲烷中继续反应，并加入乙酸酐和吡啶作为催化剂，室温下搅拌24h，之后使用二氯甲烷和水萃取，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥，过滤后减压旋转蒸发去除有机溶剂并使用柱色谱分离纯化，得到中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠的摩尔比为1：1。

[0020] 步骤3中，具体为：

[0021] 以偶氮二异丁腈为自由基反应引发剂，将其与7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺溶于四氯化碳中，加热回流8h，减压旋蒸去除有机溶剂，加入乙酸钠使其溶解于乙酸酐，加热回流12h，之后加入盐酸溶液继续搅拌，冷却至室温，抽滤，冰水洗涤，得到棕色固体，即为中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：2。

[0022] 步骤4中，具体为：

[0023] 将TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素及催化剂溶于无水乙醇中，在50℃条件下反应4h，反应结束后冷却至室温，过滤得到红色固体沉淀，并用无水乙醇反复洗涤，即可得到中间体TX‑OH；TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素的摩尔比为1：1，催化剂为哌啶。

[0024] 步骤5中，具体为：

[0025] 将TX‑OH和丙烯酰氯及催化剂溶于二氯甲烷，室温下搅拌，TLC监测反应进程至结束，减压旋干溶剂，柱色谱分离纯化，即可得到荧光探针；TX‑OH与丙烯酰氯的摩尔比为1：2，催化剂为三乙胺。

[0026] 本发明的有益效果是,通过简单的有机合成手段构建了近红外荧光探针实现了三种生物硫醇的同时检测，通过荧光强度的改变呈现出“开‑关”信号响应机制。在检测过程中荧光探针分子表现出了良好的选择性和抗干扰能力，且具有合适的pH适用范围，为进一步的生理条件下的检测提供了一定的应用潜力。

附图说明

[0027] 图1是不同有机溶剂与水(5:5，V:V)混合溶液中探针分子(10μmol/L)荧光发射光谱图；

[0028] 图2是不同有机溶剂与水(5:5，V:V)混合溶液中探针分子(10μmol/L)与Cys响应的荧光发射光谱；

[0029] 图3是DMSO与H2O不同体积比溶液中探针分子(10μmol/L)与Cys响应的荧光发射光谱；

[0030] 图4是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针分子(10μmol/L)在不同pH下与Cys响应荧光变化图；

[0031] 图5是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针分子(10μmol/L)对生物硫醇选择性响应的荧光发射光谱；

[0032] 图6是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针分子(10μmol/L)与Cys及其他不同种氨基酸的竞争响应的荧光强度柱状图；

[0033] 图7是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针分子(10μmol/L)与Hcy及其他不同种氨基酸的竞争响应的荧光强度柱状图；

[0034] 图8是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针分子(10μmol/L)与GSH及其他不同种氨基酸的竞争响应的荧光强度柱状图；

[0035] 图9是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度Cys响应荧光发射光谱，[0036] 图10是探针响应前后荧光强度增加值(F‑F0)与Cys浓度的线性拟合图；

[0037] 图11是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度Cys响应紫外吸收光谱；

[0038] 图12是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度Hcy响应荧光发射光谱；

[0039] 图13是探针响应前后荧光强度增加值(F‑F0)与Hcy浓度的线性拟合图；

[0040] 图14是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度Hcy响应紫外吸收光谱；

[0041] 图15是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度GSH响应荧光发射光谱；

[0042] 图16是探针响应前后荧光强度增加值(F‑F0)与GSH浓度的线性拟合图；

[0043] 图17是DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中探针与不同浓度GSH响应紫外吸收光谱。

具体实施方式

[0044] 下面结合具体实施方式和附图对本发明进行详细说明。

[0045] 本发明一种检测生物硫醇的近红外荧光探针，荧光探针具有如下式(Ⅰ)所示结构式：

[0046]

[0047] 本发明一种检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0048] 步骤1，以异佛尔酮和丙二腈为原料，通过Knoevenagel缩合反应合成如下式(Ⅱ)中间体TEM；

[0049]

[0050] 具体为：将异佛尔酮、丙二腈及催化剂溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，以氩气作为保护气体，在120℃的条件下搅拌6h，反应结束后冷却至室温，将反应混合溶液注入冰水中，析出棕色固体，干燥并使用柱色谱分离纯化，得到中间体TEM；

[0051] 催化剂为乙酸酐、冰醋酸和哌啶混合而成的粘稠液；异佛尔酮与丙二腈的摩尔比为1：1；

[0052] 步骤2，以2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠为原料，通过环化和水解反应合成如下式(Ⅲ)中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；

[0053]

[0054] 具体为：将2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠及催化剂三乙胺溶于乙酸酐中加热回流12h，向反应液中注入水，随之有固体析出，抽滤得到砖红色固体，冰水反复洗涤后烘干，柱色谱分离纯化，将所得产物溶解于二氯甲烷中继续反应，并加入乙酸酐和吡啶作为催化剂，室温下搅拌24h，之后使用二氯甲烷和水萃取，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥，过滤后减压旋转蒸发去除有机溶剂并使用柱色谱分离纯化，得到中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；

[0055] 2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠的摩尔比为1：1；

[0056] 步骤3，以步骤2中所得中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺(NBD)为原料，通过卤化和水解反应合成如下式(Ⅳ)所示中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；

[0057]

[0058] 具体为：以偶氮二异丁腈(AIBN)为自由基反应引发剂，将其与7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺溶于四氯化碳中，加热回流8h，减压旋蒸去除有机溶剂，此后加入乙酸钠使其溶解于乙酸酐，加热回流12h，之后加入盐酸溶液继续搅拌，冷却至室温，抽滤，冰水反复洗涤，得到棕色固体，即为中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；

[0059] 7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：2；

[0060] 步骤4，以步骤1和步骤3所得中间体TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素为原料，经过Knoevenagel缩合反应合成如下式(Ⅴ)所示中间体TX‑OH；

[0061]

[0062] 具体为：将TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素及催化剂溶于无水乙醇中，在50℃条件下反应4h，反应结束后冷却至室温，过滤得到红色固体沉淀，并用无水乙醇反复洗涤，即可得到中间体TX‑OH；

[0063] TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素的摩尔比为1：1，催化剂为哌啶；

[0064] 步骤5，以步骤4所得中间体TX‑OH和丙烯酰氯为原料，合成荧光探针TX，如上式(Ⅰ)所示结构式。

[0065] 具体为：将TX‑OH和丙烯酰氯及催化剂溶于二氯甲烷，室温下搅拌，TLC监测反应进程至结束，减压旋干溶剂，柱色谱分离纯化，即可得到荧光探针；

[0066] TX‑OH与丙烯酰氯的摩尔比为1：2，催化剂为三乙胺。

[0067] 本发明方法制备的荧光探针检测生物硫醇的原理如下：

[0068]

[0069] 在DMSO:H2O(5:5，V:V)混合溶液中，探针溶液本身几乎不发射荧光信号。当向溶液中加入生物硫醇分子后，在488nm激发波长，718nm处荧光强度表现出明显的提升，呈现出荧光信号的“开‑关”响应机制。并且，“裸眼”观察下溶液颜色有黄色转变为深蓝色。

[0070] 实施例

[0071] 本发明一种检测生物硫醇的近红外荧光探针的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0072] 合成路线如下：

[0073]

[0074] 步骤1，以异佛尔酮和丙二腈为原料，通过Knoevenagel缩合反应合成如下式(Ⅱ)中间体TEM；

[0075]

[0076] 具体为：在氩气保护下，250mL三颈烧瓶中加入0.2g乙酸酐、0.4mL冰醋酸和1.8mL哌啶，接着加入16.5mL(110mmol)异佛尔酮、6.6g(110mmol)丙二腈并使之溶解于55mL N,N‑二甲基甲酰胺中，120℃下搅拌6h。反应结束后冷却至室温。反应混合溶液注入冰水中，析出棕色固体，干燥并使用柱色谱分离纯化，洗脱剂为石油醚:二氯甲烷＝1:1(v:v)，得到黄色固体；

[0077] 步骤2，以2，4‑二羟基苯甲醛和丙酸钠为原料，通过环化和水解反应合成如下式(Ⅲ)中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素；

[0078]

[0079] 具体为：100mL圆底烧瓶中加入6.0g 2，4‑二羟基苯甲醛和9.0g丙酸钠，并将其溶解于15mL丙酸酐中，使用滴液漏斗缓慢滴加6mL三乙胺至反应瓶中，加热回流，反应12h，溶液颜色由黄色变为黑色。向反应液中注入30mL水，随之有固体析出；抽滤得到砖红色固体，冰水反复洗涤后烘干。柱色谱分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1，得到白色固体；

[0080] 步骤3，以步骤2中所得中间体7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素和N‑溴代丁二酰亚胺(NBD)为原料，通过卤化和水解反应合成如下式(Ⅳ)所示中间体7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素；

[0081]

[0082] 具体为：50mL圆底烧瓶中加入0.190g 7‑羟基‑3‑甲基‑香豆素溶解于20mL二氯甲烷中，继续加入2mL乙酸酐和3滴吡啶，室温下搅拌24h，TLC监测反应进程直至反应结束。使用二氯甲烷和水萃取，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥。过滤后减压旋转蒸发去除有机溶剂并使用柱色谱分离纯化，洗脱剂为纯二氯甲烷，得到白色固体产物7‑乙酰氧基‑3‑醛基‑香豆素合成；

[0083] 步骤4，以步骤1和步骤3所得中间体TEM和7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素为原料，经过Knoevenagel缩合反应合成如下式(Ⅴ)所示中间体TX‑OH；

[0084]

[0085] 具体为：在氩气保护下，0.30g(1.6mmol)7‑羟基‑3‑醛基‑香豆素和0.372g(2.0mmol)TEM溶解于10mL无水乙醇中，接着加入100μL哌啶，反应液在50℃下过夜反应。反应结束后冷却至室温。过滤得到红色固体沉淀，并用无水乙醇反复洗涤；

[0086] 步骤5，以步骤4所得中间体TX‑OH和丙烯酰氯为原料，合成荧光探针TX，如上式(Ⅰ)所示结构式；

[0087] 具体为：在N2保护下，0.10g(0.28mmol)TX‑OH和0.045mg(0.50mmol)丙烯酰氯溶于5mL无水二氯甲烷中，并且加入100μL无水三乙胺。室温下搅拌，TLC监测反应进程至结束。旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，柱色谱分离纯化，洗脱剂为正己烷:乙酸乙酯＝3:1，得到橙黄色固体；

[0088] 其中，产物表征如下：

[0089] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.38(s,1H),7.64(d,J＝8.5Hz,1H),7.49(d,J＝16.2Hz,1H),7.28(d,J＝1.9Hz,1H),7.20‑7.00(m,2H),6.73(s,1H),6.53‑6.38(m,1H),
6.31(dd,J＝17.2,10.3Hz,1H),6.14‑6.02(m,1H),2.36(s,4H),0.89(s,6H).

[0090] 13C NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ170.54,164.15,159.65,155.24,153.93,153.60,140.88,135.00,133.47,130.83,130.37,127.79,124.71,122.89,119.66,117.87,114.13,
113.34,110.49,78.31,42.77,38.43,32.22,27.90.

[0091] MS:([M+Na]+)；Calcd for C25H20N2O4:435.1315；Found:435.1268.

[0092] 探针测试溶剂筛选

[0093] 在实施例的基础之上，测试了探针TX(10μmol/L)在不同有机溶剂与水混合溶液中的荧光发射性能。如图1所示，通过对不同有机溶剂中荧光发射强度进行比较。发现在选择有机溶剂为DMSO时，探针自身具有较小的背景荧光发射。进一步的，如图2所示，在测试了探针TX(10μmol/L)在不同有机溶剂与水混合溶液中与Cys(5.0equiv.)响应之后的荧光发射性能。当有机溶剂为DNSO时表现出明显的荧光信号的增长。

[0094] 对于探针TX(10μmol/L)在混合溶剂DMSO和水在不同体积比存在下对CysCys(5.0equiv.)响应情况进行了测试，如图3所示。发现当探针TX在DMSO:H2O比例为1:1混合溶剂体系下具有较好的荧光发射。

[0095] 探针适用pH范围测试

[0096] 在DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中对不同pH(3～11)范围内探针对Cys响应的影响进行测试，如图4所示。发现：探针本身在强碱性溶剂中其荧光会出现明显的增长，但在响应之后荧光强度值在中性和碱性溶液中会趋向稳定的状态。所以，该探针测试时合适的pH范围在7～9之间。

[0097] 探针的选择性测试

[0098] 在DMSO:H2O(5:5，V:V)溶液中，比较了在探针TX(10μmol/L)中加入各种氨基酸的荧光发射光谱，其中包括：100μmol/L，1)Thr；2)Ser；3)Phe；4)Met；5)Lys；6)Leu；7)Ile；8)His；9)Arg；10)Ala；11)Val；12)Tyr，和20μmol/L，13)Cys；14)Hcy；15)GSH。如图5所示，除三种硫醇分析物外，在激发波长为488nm下，其它氨基酸并未对荧光强度产生明显的增长。结果表明，探针TX对该三种生物硫醇表现出了较好的选择性检测效果。

[0099] 探针的抗干扰能力测试

[0100] 在10μmol/L探针TX中加入上述实例中各种氨基酸100μmol/L形成干扰氛围。之后，加入分析物20μmol/LCys、Hcy和GSH后测试其荧光光谱的变化情况。如图6、7和8所示，分别对其它各种氨基酸的荧光响应(100μmol/L，网格竖条)和加入Cys、Hcy和GSH(20μmol/L，黑色竖条)后荧光强度进行了比较。激发波长为488nm下其荧光发射强度在718nm处均表现出明显的改变，结果表明，探针TX在其它各种氨基酸的存在下对三种生物硫醇的识别几乎不受影响。

[0101] 探针的滴定实验

[0102] 如图9所示，在488nm波长激发下，探针TX溶液本身不没有明显的荧光发射信号。然而，当存在Cys时，溶液颜色发生了转变。并且，其在710nm处荧光强度数值表现出了极大的增加。此外，当分析物达到20μmol/L时，其荧光强度提升了约5倍。同时，从紫外‑可见吸收光谱图10可以得到，在525nm处有相似于荧光增长的趋势。如图11‑14所示，探针对Hcy和GSH表现出类似于Cys的现象。

[0103] 进一步的，如图15～17所示，探针TX与Cys响应净增荧光强度(F‑F0)与Cys的浓度在0～10μmol/L表现出较好的线性相关(其中，F0和F分别为探针与Cys、Hcy和GSH反应前后2
的荧光强度值)。探针TX的回归方程为y＝30.17+79.58x(R ＝0.9810)。同时，探针TX与Hcy(GSH)响应净增荧光强度(F‑F0)与Hcy(GSH)的浓度在0～4μmol/L表现出较好的线性相关，
2 2
其回归方程为y＝48.14+205.51x(R＝0.9772)(y＝53.36+192.51x(R＝0.9734))。

[0104] 本发明的荧光探针，基于强拉电子能力的双氰基异佛尔酮骨架构建了探针TX用于生物硫醇的检测，通过共轭连接香豆素基团使其荧光发射波长红移至NIR区域。488nm激发波长下，探针自身几乎无荧光。生物硫醇与探针分子反应后，718nm处荧光强度显著加强。并且，反应前后荧光强度净增值(F‑F0)与生物硫醇的浓度，在一定范围内表现出较好的线性相关。探针TX对硫醇具有较好的选择性，且不受其它氨基酸的干扰。可用于生物样品中生物硫醇的检测，具有良好的应用前景。