一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用

摘要

本发明细胞培养技术领域，具体涉及一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。本发明采用脐带间充质干细胞上清液和/或银胶菊内酯培养原代细胞，相较于传统组织块贴壁法，能有效缩短原代脐带间充质干细胞的制备时间，且保持其较好的细胞活率、表型及功能。

权利要求

1.一种原代脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述的培养基由以下成分组成：脐带间充质干细胞上清液，间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯；

所述的脐带间充质干细胞上清液的制备方法包括以下步骤：(1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.03％，混匀；

(2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为100μg/mL，混匀；

(3)将步骤(2)的混合物4℃，12000r/min条件下离心10min，，取上清；

所述的脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：1；

所述的无血清培养基为α‑MEM培养基；

所述的银胶菊内酯的终浓度为10μmol/L。

2.权利要求1所述的培养基在原代脐带间充质干细胞的制备中的应用。

3.一种原代脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)检测：对产妇外周血做外源因子检测，所述外源因子包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒和T淋巴细胞白血病病毒，确保脐带中不含有上述外源因子；

(2)处理脐带得到华通氏胶的组织块，铺到培养皿中，并加入间充质干细胞无血清培养基，置于CO2培养箱内培养，每两天换液，其中，换液培养基为权利要求1所述的原代脐带间充质干细胞的培养基，待细胞融合度达到50％时，进行传代；

(3)细胞传代：用生理盐水清洗细胞2次，加入胰酶消化，离心，接种继续培养传代。

说明书

一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。

背景技术

[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，它有自我更新和多项分化的潜能，具有低免疫原性，增殖能力强等特点，广泛存在于骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙齿、滑膜等组织中。其中脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells，UCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，与其他组织来源的间充质干细胞相比，具有来源丰富、取材方便，无伦理学争议，低免疫原性等优点。

[0003] 脐带间充质干细胞在体内或体外的特定诱导条件下有分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的能力。因其具有多向分化的潜能，所以在临床中可广泛应用到神经系统疾病、心血管系统疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、糖尿病、肌肉变性病、肝脏疾病及慢性疼痛等疾病的治疗中，具有十分广阔的应用前景。脐带间充质干细胞还可以分泌外泌体，外泌体中含有多种分子成分，包括蛋白质、脂质、信使核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)以及微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)，具有执行免疫调节、促进细胞再生以及促血管新生等功能。

[0004] 干细胞的产业化发展，包括上游的干细胞库、中游的干细胞扩增技术和质检技术，以及下游的干细胞产品。国内外许多机构都在开展间充质干细胞的储存工作，而短时间高效的从脐带中分离出干细胞的方法变得极其重要。目前，国内外制备原代间充质干细胞应用最广泛的方法是组织块贴壁法。而随着时间的发展传统的组织块贴壁方法已经跟不上干细胞研究的步伐，组织块贴壁法培养时间较长，分离效率低，且长时间的培养增加了各种菌污染的机率。所以对传统组织块贴壁法进行改良，缩短原代培养的时间以满足临床和科研的需求变得至关重要。

[0005] 在原代干细胞制备方法中，某些专利通过优化培养基以改进传统的组织块贴壁法，如专利CN201480030461.1，CN201910155437.5，CN201910334392.8等，通过配制自有的培养基在原代制备和传代过程中使用，虽然也提高了分离培养周期，但是自有化的培养基没有商品化的培养基稳定。还有一些专利和文献在原代培养过程中将组织块回收利用再次贴壁，如专利CN201711365354.6和《关于改良差速贴壁法原代培养大型成年哺乳动物绵羊肌源性干细胞的研究》(李玢等，中国计划生育和妇产科，2017年，第9卷第12期，第25‑29页)。

[0006] 因此，亟需提供一种明显缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，细胞活率高的培养基及培养方法。

发明内容

[0007] 为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。采用本发明所述的培养基，相较于传统组织块贴壁法，培养时间明显缩短，且在表型、细胞活率、成脂成骨诱导能力和增殖生长曲线上无明显差异。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0009] 一方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞上清液的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

[0010] (1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.01‑0.1％，混匀；

[0011] (2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为50‑200μg/mL，混匀；

[0012] (3)将步骤(2)的混合物离心，取上清。

[0013] 具体地，步骤(1)中所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.01‑0.05％，优选为0.03％。

[0014] 具体地，步骤(2)中所述的银胶菊内酯的浓度为80‑150μg/mL，优选为100μg/mL。

[0015] 另一方面，本发明提供了一种原代脐带间充质干细胞的培养基，所述的培养基包括上述脐带间充质干细胞上清液。

[0016] 具体地，所述的培养基还包括间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯。

[0017] 进一步具体地，所述的脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:0.5‑2，优选为1:1。

[0018] 进一步具体地，所述的银胶菊内酯的终浓度为5‑15μmol/L，优选为10μmol/L。

[0019] 又一方面，本发明提供了上述脐带间充质干细胞上清液或原代脐带间充质干细胞的培养基在原代脐带间充质干细胞的制备中的应用。

[0020] 又一方面，本发明提供了一种原代脐带间充质干细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

[0021] (1)检测：对产妇外周血做外源因子检测，所述外源因子包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒和T淋巴细胞白血病病毒，确保脐带中不含有上述外源因子；

[0022] (2)处理脐带得到华通氏胶的组织块，铺到培养皿中，并加入间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱内培养，每两天换液，其中，换液培养基为上述原代脐带间充质干细胞的培养基，待细胞融合度达到50％时，进行传代；

[0023] (3)细胞传代：用生理盐水清洗细胞2次，加入胰酶消化，离心，接种继续培养传代。

[0024] 具体地，步骤(3)中所述的胰酶为0.025‑0.05％的胰蛋白酶。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0026] 在干细胞培养过程中上清液中含有很多干细胞分泌的细胞因子和外泌体，经研究发现，这些因子和外泌体可以促进干细胞从组织块中爬出和快速增殖。本发明采用脐带间充质干细胞上清液和/或银胶菊内酯培养原代细胞，能有效缩短原代脐带间充质干细胞的制备时间，且保持其较好的细胞活率、表型及功能。

附图说明

[0027] 图1为实施例1所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0028] 图2为实施例2所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0029] 图3为实施例3所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0030] 图4为实施例4所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0031] 图5为实施例5所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0032] 图6为实施例6所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0033] 图7为对比例1所述方法的原代人脐带间充质干细胞的活率和表型。

[0034] 图8为不同实施例的方法培养的人脐带间充质干细胞成脂诱导分化实验。

[0035] 图9为不同实施例的方法培养的人脐带间充质干细胞成骨诱导分化实验。

[0036] 图10为不同实施例的方法培养的人脐带间充质干细胞生长曲线。

具体实施方式

[0037] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

[0039] 实施例1脐带间充质干细胞上清液及其原代脐带间充质干细胞培养基

[0040] 1.脐带间充质干细胞上清液的制备：

[0041] (1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.03％，混匀；

[0042] (2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为100μg/mL，混匀，37℃10min；

[0043] (3)将步骤(2)的混合物4℃，12000r/min条件下离心10min，取上清。

[0044] 2.原代脐带间充质干细胞培养基

[0045] 包括步骤1制备得到的脐带间充质干细胞上清液、间充质干细胞无血清培养基(Gibco公司，货号C12571500BT或AventaCell公司，货号HPCFDCRL50)和银胶菊内酯(Sigma‑Aldrich公司)，其中脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:1，银胶菊内酯的终浓度为10μmol/L。

[0046] 实施例2脐带间充质干细胞上清液及其原代脐带间充质干细胞培养基

[0047] 1.脐带间充质干细胞上清液的制备：

[0048] 收集脐带间充质干细胞培养液，在4℃，12000r/min条件下离心10min，取上清。

[0049] 2.原代脐带间充质干细胞培养基

[0050] 包括步骤1制备得到的脐带间充质干细胞上清液、间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯，其中脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:1，银胶菊内酯的终浓度为10μmol/L。

[0051] 实施例3脐带间充质干细胞上清液及其原代脐带间充质干细胞培养基

[0052] 1.脐带间充质干细胞上清液的制备：

[0053] (1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.03％，混匀；

[0054] (2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为100μg/mL，混匀，37℃10min；

[0055] (3)将步骤(2)的混合物4℃，12000r/min条件下离心10min，取上清。

[0056] 2.原代脐带间充质干细胞培养基

[0057] 包括步骤1制备得到的脐带间充质干细胞上清液和间充质干细胞无血清培养基，其中脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:1。

[0058] 实施例4原代脐带间充质干细胞培养基

[0059] 包括间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯，其中银胶菊内酯的终浓度为10μmol/L。

[0060] 实施例5脐带间充质干细胞上清液及其原代脐带间充质干细胞培养基

[0061] 1.脐带间充质干细胞上清液的制备：

[0062] (1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.03％，混匀；

[0063] (2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为100μg/mL，混匀，37℃10min；

[0064] (3)将步骤(2)的混合物4℃，12000r/min条件下离心10min，取上清。

[0065] 2.原代脐带间充质干细胞培养基

[0066] 包括步骤1制备得到的脐带间充质干细胞上清液、间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯，其中脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:0.5，银胶菊内酯的终浓度为5μmol/L。

[0067] 实施例6脐带间充质干细胞上清液及其原代脐带间充质干细胞培养基

[0068] 1.脐带间充质干细胞上清液的制备：

[0069] (1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.03％，混匀；

[0070] (2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为100μg/mL，混匀，37℃10min；

[0071] (3)将步骤(2)的混合物4℃，12000r/min条件下离心10min，取上清。

[0072] 2.原代脐带间充质干细胞培养基

[0073] 包括步骤1制备得到的脐带间充质干细胞上清液、间充质干细胞无血清培养基和银胶菊内酯，其中脐带间充质干细胞上清液与间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:2，银胶菊内酯的终浓度为15μmol/L。

[0074] 实施例7一种原代脐带间充质干细胞的制备

[0075] (1)检测：对产妇外周血送质检部做外源因子检测，采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)诊断试剂盒进行梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒(epstein‑barr virus,EBv)、T淋巴细胞白血病病毒等外源因子检测，确保脐带中不含有上述外源因子。

[0076] (2)将两头扎好的脐带用无菌PBS缓冲液冲洗两次，以75％酒精浸泡消毒1min，用手术剪将脐带剪成2cm小段，再用无菌PBS缓冲液将残血清洗干净。剔除掉脐带里面的两根动脉一根静脉，剥离脐带内表面的华通氏胶，用PBS缓冲液清洗3次。

[0077] 将华通氏胶剪成1mm3的组织块，然后铺于150mm的细胞培养皿中，注意组织块之间的间隙，将培养皿置于37℃，5％的CO2浓度的CO2培养箱内静置20min，向培养皿缓慢滴加30mL间充质干细胞无血清培养基，于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱培养。每两天换次液。
其中，换液时的原代脐带间充质干细胞培养基分别按照实施例1‑6的步骤制备得到。

[0078] (3)细胞传代：分别记录细胞融合度达到50％的时间(表1)，待细胞融合度达到50％时进行传代。弃去上清液，用0.9％的生理盐水清洗细胞表面2次，每皿加入3mL 0.05％胰酶消化，细胞消化适度后，加6mL间充质干细胞无血清培养基稀释胰酶。用吸管将消化好的细胞吹打成细胞悬液，收集到离心管中，1000rpm/min，5min离心。

[0079] 弃去离心后的上清液，用间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，调整细胞比例，接种到150mm培养皿中，每皿以30mL培养基培养。待细胞融合度达到80％，收集细胞，检测细胞活率、细胞表型、成骨成脂诱导分化能力和生长曲线。

[0080] 对比例1传统组织块贴壁法制备原代脐带间充质干细胞

[0081] 与实施例7的区别在于，步骤(2)中换液用的培养基为间充质干细胞无血清培养基，其余步骤与实施例7相同。

[0082] 表1

[0083] 序号 原代间充质干细胞融合度达到50％的时间(d)实施例1 8
实施例2 9
实施例3 11
实施例4 12
实施例5 12
实施例6 13
对比例1 14

[0084] 各实施例及对比例所述方法中的原代人脐带间充质干细胞形态在倒置显微镜下观察，原代细胞呈贴壁生长，形态均为长梭形或多角形。本发明所述的方法细胞原代细胞在第8天融合度在50％，而传统组织块贴壁法细胞原代细胞在第8天融合度仅在10％，在15天融合度达到50％。

[0085] 实验例1细胞活率、细胞表型检测

[0086] 活率检测：取2×105个细胞，加入PI试剂，混匀，在4℃黑暗环境中孵育。然后再向每个样中加生理盐水定容，洗细胞，离心，去上清。

[0087] 表型检测：1)取9个样品，每份都有2×105个细胞，分别标记为空白、PerCP、PE、APC、FITC、同型、表型、PE同型和HLA‑DR。2)向PerCP，PE，APC，FITC，同型，表型等样品中加入相应试剂，混匀，在4℃黑暗环境中孵育。然后再向每个样中加生理盐水定容，洗细胞，离心，去上清。用生理盐水重悬每个样品。3)上流式细胞仪进行分析，用表型样品直接测各种表型结果。

[0088] 具体检测结果如图1‑7及下表2所示。

[0089] 表2

[0090] 序号 细胞活率 CD90 CD105 CD73 CD14、CD34、CD20、CD45 HLA‑DR实施例1 98.19％ 100.00％ 99.71％ 99.97％ 0.55％ 0.40％
实施例2 97.17％ 99.68％ 99.92％ 99.95％ 0.48％ 0.66％
实施例3 96.44％ 99.87％ 99.79％ 99.84％ 0.80％ 0.18％
实施例4 95.55％ 99.89％ 99.75％ 99.96％ 1.05％ 0.87％
实施例5 94.27％ 99.92％ 99.64％ 99.80％ 0.69％ 0.49％
实施例6 94.20％ 99.66％ 99.61％ 99.70％ 0.39％ 0.18％
对比例1 91.42％ 98.69％ 99.74％ 99.84％ 0.89％ 0.12％

[0091] 由图1‑7及表2可知，本发明所述培养方法的脐带间充质干细胞的表型中表达CD90、CD105、CD73阳性表达率都在95％以上，表达CD14、CD34、CD20、CD45阳性表达率都在2％以下，HLA‑DR阳性表达率都在2％以下，符合要求。此外，本发明所述的培养方法的脐带间充质干细胞在细胞活率上优于传统方法培养的细胞。

[0092] 实验例2细胞成脂成骨诱导分化实验

[0093] 1.成脂诱导分化：收集细胞，以1×104个细胞量接种到24孔板中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱内培养，第2天换成成脂诱导培养基(GIBCO，A10071‑01)，每3‑4天换一次液，第14天用DPBS冲洗一次，用4％甲醛溶液固定细胞30min。固定后，用蒸馏水冲洗2次，用油红O染料染色细胞2‑3分钟。用蒸馏水冲洗3次，在光学显微镜下观察并拍照，检测结果如图3所示。

[0094] 2.成骨诱导分化：收集细胞，以1×104个细胞量接种到24孔板中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱内培养，第2天换成成骨诱导培养基(GIBCO，A10071‑01)，每3‑4天换一次液，第14天用DPBS冲洗一次，用4％甲醛溶液固定细胞30min。固定后，用蒸馏水冲洗2次，用2％茜素红S溶液(Ph4.2)染色细胞2‑3分钟。用蒸馏水冲洗3次，在光学显微镜下观察并拍照，检测结果如图4所示。

[0095] 如图8和图9所示，通过对不同实施例的方法培养的人脐带间充质干细胞成脂、成骨诱导分化实验，证明了在体外的特定条件下，该细胞能够在培养瓶或培养皿中贴壁生长，且可分化为成脂和成骨细胞，具有向成脂和成骨细胞分化的潜能，且本发明所述的方法培养出的细胞在成脂和成骨的潜能上优于传统方法培养出的细胞。

[0096] 实验例3细胞增殖生长曲线

[0097] 收集细胞，以1×104个细胞量接种到24孔板中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，每隔24h取三个孔加入200μL 0.05％胰酶进行消化，800μL间充质干细胞无血清培养基终止消化。然后计数求平均值，连续记录7天。

[0098] 如图10所示，不同实施例的方法培养的人脐带间充质干细胞生长曲线形态相似，1‑2天细胞处于潜伏期，增殖不明显，3‑5天细胞进入对数生长期，细胞增殖加速，第6天以后进入平台期，细胞生长停滞，两种方法培养的脐带间充质干细胞生长曲线比较无明显差异。

[0099] 以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。