一种疟原虫检测的荧光染色方法

摘要

本发明涉及一种用于疟原虫检测的荧光染色方法及其试剂。其方法特征在于通过分子垂钓实验获得能够与疟原虫核结构特异性结合的小分子化合物，对其进行修饰和标记，形成特异性荧光素标记小分子；使用本发明所提供的试剂，实现对血液中疟原虫进行荧光染色检测；试剂与样本混合后，特异性荧光素标记小分子同疟原虫结合，在荧光显微镜下使含有疟原虫的血红细胞呈现亮色或特异性颜色，其他血细胞为黑色或背景色。

权利要求

1.一种疟原虫检测的荧光染色试剂，其特征在于，所述试剂包含0.5mg/ml的特异性荧光素标记小分子、0.5mg/ml伊文思兰、PBS缓冲体系、5mg/ml的BSA、0.05%DMSO、0.01%曲拉通‑x100、15%甲酸、30%乙腈；

所述特异性荧光素标记小分子由以下步骤制备：

1）将疟原虫特定组份进行分子垂钓实验，获得与疟原虫特异结合的化合物小分子，所述的疟原虫特定组份是指五种疟原虫共有的核小体结构；

所述的疟原虫特异结合的化合物小分子是指在化学分子文库筛选出的能够与疟原虫核小体结构特异结合的化合物分子；

该化合物分子式为（4‑二乙氨基‑1‑甲基丁氨基）‑2‑甲羧基‑1‑二乙氨基甲苯；

2）对上述与疟原虫特异结合的化合物小分子进行修饰和荧光素标记，过柱纯化后获得特异性荧光素标记小分子。

说明书

一种疟原虫检测的荧光染色方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种以荧光素为标记物的快速检测方法及可检测疟原虫的荧光染色试剂，涉及的疟原虫为感染人的五种疟原虫，涉及的疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、巴西疟原虫，可用于生物学、医学检验的相关领域。

背景技术

[0002] 荧光染色方法是利用荧光素的光学特性，通过特殊波长的激发光激发下发射出特定颜色的波长，利用显微镜进行待检物质观察的一种方法。荧光染色方法包含非特异性荧光染色试剂和特异性荧光染色试剂。

[0003] 非特异性荧光染色试剂一般采用非特异性荧光燃料，包含金胺O荧光染液等，该类试剂能够对某一种生物大分子进行染色，而不能对含有这一种生物大分子的细胞、病毒、细菌等进行区分。

[0004] 特异性荧光染色试剂采用能够与待检物特异结合的分子为主要核心原料，这些分子与待检物的特殊结构具有抗原抗体或受体配体特异结合的特性。特异性荧光染色试剂对这些分子进行修饰和荧光素标记，具有检测的特异性。

[0005] 疟疾是由疟原虫所致的虫媒传染病。疟原虫是一类单细胞、寄生性的原生动物，有五种疟原虫会使人类感染疟疾，包括恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫及诺氏疟原虫。疟疾流行于102个国家和地区，据世界卫生组织估计，有20亿人口居住在流行区，特别是在非洲、东南亚和中、南美洲的一些国家。疟疾目前仍是公众健康所面临的最严重威胁之一。据世界卫生组织报告，全球大约40％的人口受疟疾威胁，每年约有3亿人感染疟疾，110万人因疟疾死亡，90％为儿童。

[0006] 引起疟疾的病原是疟原虫生活史中红细胞内无性增殖期的裂殖体。当成熟裂殖体胀破红细胞时，释放出裂殖子、疟原虫的代谢产物，以及红细胞碎片等一起进入血流。其中相当一部分物质被巨噬细胞及多形核细胞吞噬，刺激这些细胞产生内源性热原质，后者和疟原虫代谢物共同作用于下丘脑的体温调节中枢，引起发热。

[0007] 疟疾的发作，是达到一定数量的红细胞内无性期(裂体增殖期)疟原虫对机体的刺激引起的。疟疾发作周期和红内期裂体增殖周期一致，因此，间日疟为隔日发作一次，恶性疟初期发作通常隔日一次，其后则发作不规则。间日疟有复发现象，即疟疾初发后红细胞内期疟原虫已被消灭，经数月至年余，未经蚊媒叮咬，仍又出现疟疾发作。这是由于疟原虫在肝细胞内发育存在休眠子。

[0008] 从人体感染疟原虫到发病，称为潜伏期。间日疟潜伏期一般为13‑15天，亦可达6个月以上，亦见长达一年者。多有前驱期。临床急性发作以体温超过37.8℃为准，发热始于中午前后和晚上9点以前，偶见于深夜。开始一、二次症状较轻，热度较低，随后日益加重。恶性疟潜伏期一般为6～27天，平均11天，多突然发病，无寒战，仅有畏寒感。高热者多见，热型复杂，有的像间日疟，隔天发作1次；有的每天发热，热型呈间歇型、弛张型或不规则型；有的持续高热，发热期往往长达20～36h；前后两次发作的间歇期极短。卵形症与间日疟相似。三日疟潜伏期18～35天，平均28天。

[0009] 疟疾的实验室检测技术包括镜检法、免疫学检测疟原虫抗原、PCR检测、Dipstick方法。镜检法包括普通染色镜检法、吖啶橙染色镜检法、核酸探针检测。

[0010] 普通染色镜检法采用吉氏染色液染色后镜检，是疟原虫检测的金标准，但受制于血中疟原虫密度、制片和染色技术、服药后疟原虫变形以及镜检经验等因素的影响；

[0011] 吖啶橙染色镜检法采用吖啶橙代替吉氏染色液，缺点在于吖啶橙为非特异性核酸燃料，对于红细胞内寄生的其他病原体、正常人血液中少量的幼稚红细胞、白细胞可以着色而无法鉴别。

[0012] 免疫学检测疟原虫抗原可查出原虫血症者，故对临床诊断为现症病人以及从人群中查传染源、考核疗效均可使用，主要方法有琼脂糖扩散试验、对流免疫电泳、酶联免疫吸附试验、直接荧光或酶免疫染色法等，缺点在于检测灵敏度低。

[0013] 目前国内外已有几种不同的核酸探针用于疟原虫的检测。由于其独特的高特异性，敏感性可高于镜检，认为核酸探针技术非常有希望替代常规的显微镜检查，且可在短时间内成批处理大量样本，已被认为可以定量及估算疟原虫血症水平，是疟疾流行病学调查及评价抗疟措施效果很有潜力的诊断工具。尚存在一些技术问题须解决及需要暗室操作而有一定的方法学限制。

[0014] PCR检测滤纸干血滴上的疟原虫技术也已成熟，从而便于以PCR技术监测边远地区的疟疾。由于它对实验技术和条件的要求较高，从而限制了其在现场的应用。

[0015] 应用Dipstick方法也有一定的局限性，用此法难以检出尚处于潜伏期或血中仅含有成熟配子体的恶性疟原虫。

[0016] 镜检法是疟原虫检测的金标准。镜检法配套疟原虫检测的特异性荧光染色试剂，在血中疟原虫密度较低时即可进行疟疾诊断，具有明显的临床诊断意义。

发明内容

[0017] 本发明的目的在于提供一种疟原虫的快速、特异和高灵敏的荧光染色方法。涉及的病原体为感染人的五种疟原虫。本发明的另一目的在于提供用于该方法的检测试剂。

[0018] 本发明的目的可通过下列技术方案实现：荧光染色试剂为单支包装，内含：0.5mg/ml的特异性荧光素标记小分子、0.5mg/ml伊文思兰、PBS缓冲体系、5mg/ml的BSA、0.05％DMSO、0.01％曲拉通‑x100、15％甲酸、30％已腈。

[0019] 本发明所述的疟原虫检测的荧光染色试剂的实施步骤如下：

[0020] 1)将所述的疟原虫特定组份进行分子垂钓实验，获得疟原虫特异结合的化合物小分子，该化合物分子式为(4‑二乙氨基‑1‑甲基丁氨基)‑2‑甲羧基‑1‑二乙氨基甲苯[0021] 2)对疟原虫特异结合的化合物小分子进行修饰和荧光素标记，过柱纯化后获得特异性荧光素标记小分子。

[0022] 3)将特异性荧光素标记小分子按照25mg/ml溶解在15％甲酸、30％已腈的水溶液中，作为母液。

[0023] 4)缓冲体系配制，含有0.5mg/ml伊文思兰、PBS缓冲体系、5mg/ml的BSA、0.05％DMSO、0.01％曲拉通‑x100。

[0024] 5)工作液配制：在缓冲体系中加入1/50体积的特异性荧光素标记小分子母液。

[0025] 6)将待检样本20微升滴加在准备好的玻片上，滴加10微升的工作液并混匀。

[0026] 7)荧光显微镜观察

[0027] 8)检测结果：观察到具有荧光信号的血红细胞为阳性，否则为阴性。

[0028] 所述的疟原虫特定组份是指五种疟原虫共有的核小体结构。

[0029] 所述的疟原虫特异结合的化合物小分子是指在化学分子文库筛选出的能够与疟原虫核小体结构特异结合的化合物分子。

[0030] 所述的特异性荧光素标记小分子中是指疟原虫特异结合的化合物小分子和荧光素分子交联反应的产物。

[0031] 所述的母液是特异性荧光素标记小分子的高浓度保存液。

[0032] 所述的缓冲体系是指特异性荧光素标记小分子的工作体系。

[0033] 所述的检测结果，是指利用荧光显微镜观察到的图像进行分析。含有疟原虫的红细胞具有一定的荧光强度，正常血液中的红细胞及其他细胞均为背景色或黑色。

[0034] 本发明所述的一种疟原虫检测的荧光染色试剂的制备步骤如下：

[0035] 1)将从化学分子文库中筛选出的化学分子进行修饰和荧光素标记，获得特异性荧光素标记小分子

[0036] 2)将特异性荧光素标记小分子配制成高浓度保存液

[0037] 3)将特异性荧光素标记小分子配制成工作液

[0038] 4)将上述工作液取1.05ml,装入到2ml的棕色玻璃瓶中，盖上带密封圈的瓶盖[0039] 5)将上述试剂瓶装入锡箔袋中，热封锡箔袋。

[0040] 和现有的疟原虫检测方法相比较，本发明具有以下优势：

[0041] 1)本项目采用特异性荧光试剂进行疟原虫虫体的荧光标记，在荧光显微镜下，疟原虫虫体感染的红细胞因为试剂中特异性结合的荧光素而发亮色，未受疟原虫感染的细胞为背景色或者黑色，非常容易识别，对检验人员要求较低，可提高检出率。

[0042] 2)本项目采用化合物小分子代替抗体进行产品设计。小分子化合物穿透力强，不需对细胞进行通透处理即可进入细胞。故不需要进行细胞固定、通透、孵育、洗脱等冗长的操作时间，具有检测时间的优势

[0043] 3)利用荧光素进行小分子化合物的标记。可实现一步法疟疾检测，操作过程简单。即把荧光染色试剂和待检血在玻片上混合，即可放置在荧光显微镜下进行观测。

[0044] 4)可进行疟原虫感染红细胞的绝对计数。附图说明：

[0045] 附图1，一种疟原虫检测的荧光染色试剂的瓶装示意图

[0046] 附图2，一种疟原虫检测的荧光染色试剂的使用步骤示意图

[0047] 附图3，疟原虫阳性的结果示意图

[0048] 附图4，疟原虫阴性的结果示意图

[0049] 具体实施方法

[0050] 参照附图1，取出疟原虫荧光染色液，轻甩试剂瓶，使瓶内液体到底部。

[0051] 参照附图2，取待检血样20μL到洁净载玻片上；打开试剂瓶取10μL到待检物玻片上；盖上洁净盖玻片进行荧光显微镜观测。

[0052] 参照附图3和4，出现荧光信号的红细胞图像，表明疟原虫阳性；未出现荧光信号细胞图像，表明为阴性。