同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法转让专利
申请号 : CN202110964765.7
文献号 : CN113416791B
文献日 : 2021-11-09
发明人 : 冉凌飞 , 蒿杰 , 刘甲乾 , 路瑶
申请人 : 百特元生物科技(北京)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.同时扩增人25个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒,其特征在于,所述荧光标记扩增试剂盒包括反应体系和检测试剂,所述反应体系包括阳性对照DNA M2或阳性对照DNA
9948、同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水;所述检测试剂包括分子量内标和等位基因阶梯;
所述同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组包括:rs2032678扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:1 2所示;Amelogenin扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:3~ ~
4所示;D5S818扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:5 6所示;D13S317扩增用引物对:核~
苷酸序列如SEQ ID NO:7 8所示;D7S820扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:9 10所~ ~
示;D16S539扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:11 12所示;D10S1248扩增用引物对:~
核苷酸序列如SEQ ID NO:13 14所示;D3S1358扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:15~ ~
16所示;TH01扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:17 18所示;D21S11扩增用引物对:核~
苷酸序列如SEQ ID NO:19 20所示;D2S1338扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:21 22~ ~
所示;D1S1656扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:23 24所示;Penta D扩增用引物对:~
核苷酸序列如SEQ ID NO:25 26所示;D2S441扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:27~ ~
28所示;D19S433扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:29 30所示;D18S51扩增用引物~
对:核苷酸序列如SEQ ID NO:31 32所示;D22S1045扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID ~
NO:33 34所示;vWA扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:35 36所示;D8S1179扩增用引~ ~
物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:37 38所示;TPOX扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:~
39 40所示;FGA扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:41 42所示;CSF1PO扩增用引物对:~ ~
核苷酸序列如SEQ ID NO:43 44所示;Penta E扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:45~ ~
46所示;D6S1043扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:47 48所示;D12S391扩增用引物~
对:核苷酸序列如SEQ ID NO:49 50所示;
~
所述反应预混液包括:0.19 0.38U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、100 200 mM的Tris缓~ ~
冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μM的dNTP、1000~
1500mM的甜菜碱、0.19% 0.38%的Triton、0.5 1mg/ml的BSA、5% 15%的Tween、2.5% 7.5%的~ ~ ~ ~
甘油和去离子水;
所述25个STR基因座的特异性扩增引物组的浓度如下:SEQ ID NO:1 2所示的rs2032678扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.132μM;SEQ ~
ID NO:3 4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.080μM;SEQ ID NO:5~ ~
6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.079μM;SEQ ID NO:7 8所示的中~
D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.097μM;SEQ ID NO:9 10所示的D7S820扩增用~
引物对中各引物的浓度分别为0.297μM;SEQ ID NO:11 12所示的D16S539扩增用引物对中~
各引物的浓度分别为0.135μM;SEQ ID NO:13 14所示的D10S1248扩增用引物对中各引物的~
浓度分别为0.152μM;SEQ ID NO:15 16所示的D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别~
为0.114μM;SEQ ID NO:17 18所示的TH01扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.089μM;
~
SEQ ID NO:19 20所示的D21S11扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.189μM;SEQ ID NO:~
21 22所示的D2S1338扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.086μM;SEQ ID NO:23 24所示~ ~
的D1S1656扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.160μM;SEQ ID NO:25 26所示的Penta D~
扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.272μM;SEQ ID NO:27 28所示的D2S441扩增用引物~
对中各引物的浓度分别为0.145μM;SEQ ID NO:29 30所示的D19S433扩增用引物对中各引~
物的浓度分别为0.265μM;SEQ ID NO:31 32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分~
别为0.117μM;SEQ ID NO:33 34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为~
0.121μM;SEQ ID NO:35 36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.093μM;SEQ ~
ID NO:37 38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.205μM;SEQ ID NO:39~ ~
40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.144μM;SEQ ID NO:41 42所示的FGA~
扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.124μM;SEQ ID NO:43 44所示的CSF1PO扩增用引物~
对中各引物的浓度分别为0.129μM;SEQ ID NO:45 46所示的Penta E扩增用引物对中各引~
物的浓度分别为0.356μM;SEQ ID NO:47 48所示的D6S1043扩增用引物对中各引物的浓度~
分别为0.086μM;SEQ ID NO:49 50所示的D12S391扩增用引物对中各引物的浓度分别为~
0.302μM。
2.根据权利要求1所述的荧光标记扩增试剂盒,其特征在于,所述25个STR基因座按照如下方式分组:
第一组:rs2032678、Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539和D10S1248;
第二组:D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338和D1S1656;
第三组:Penta D、D2S441、D19S433和D18S51;
第四组:D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX和FGA;
第五组:CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391。
3.根据权利要求1或2所述的荧光标记扩增试剂盒,其特征在于,所述检测试剂中,对应各基因座的等位基因阶梯为:
第一组: rs2032678:1、2;Amelogenin:X、Y;D5S818:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18;D13S317:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16;D7S820:6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15;D16S539:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;D10S1248:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18;
第二组:D3S1358:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20;TH01:4、5、6、7、8、9、10、11、
12;D21S11:24、25、26、27、28、28.2、29、29.2、30、31、31.2、32、32.2、33、33.2、34、34.2、35、
35.2、36、36.2、37、38;D2S1338:11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28;D1S1656:9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20;
第三组:Penta D:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16;D2S441:8.1、9、10、11、12、
13、14、15、16;D19S433:6、7、8、9、10、11、11.2、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、
17、18、18.2、19;D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27;
第四组:D22S1045:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19;vWA:11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24;D8S1179:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19;TPOX:
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、
29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2;
第五组:CSF1PO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16;Penta E:5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26;D6S1043:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25;D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。
4.根据权利要求1所述的荧光标记扩增试剂盒,其特征在于,所述检测试剂中,所述分子量内标为BTY‑550,其包含65bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、
340bp、400bp、450bp、490bp、500bp、540bp和550bp共16条DNA片段。
5.权利要求1 4任一项所述荧光标记扩增试剂盒在法医个体识别和/或法医DNA数据库~
建设和/或嫌疑人家系排查和/或司法亲缘关系鉴定中的应用。
6.基于权利要求1 4任一项所述荧光标记扩增试剂盒的检测方法,包括以下步骤:~
利用所述特异性扩增引物组对待测样品进行扩增;将扩增产物在遗传分析仪中进行电泳;电泳后,在GeneMapper_IDX软件上进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述扩增的程序为:变性:95℃,5min;扩增:94℃ 10s,59℃ 80s,30个循环;终止延伸 60℃,10min。
说明书 :
同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩
增试剂盒及应用和方法
技术领域
背景技术
~
性,并且与AMP‑FLP和VNTR等分型方法相比,STR基因分型方法所扩增的产物长度小得多(小
于500 bp),因此对于模板质量要求较低,即使降解的DNA模板也可以进行分析。此外,STR分
型适用于多种DNA纯化方法所纯化的DNA,而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作
Southern印迹分析。鉴于以上这些特点,STR分型技术已经广泛应用于法医身份识别鉴定。
法医DNA数据库的核心在于所收录的STR(short tandem repeat)数据信息,一个完善的法
医DNA数据库应该包含常染色体STR数据库和Y染色体STR数据库。Y染色体STR数据为案件提
供侦查线索,缩小侦查范围,可以预测罪犯可能存在的地区、种族甚至姓氏,常染色体STR数
据用于最后罪犯个体的筛查及确认。
库的完善,我国公安部公布了属于我们自己的核心基因座(20个基因座,包含原美国13个
CODIS核心基因座及Amelogenin、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E)
及优选基因座(10个基因座,包换D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、
D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435用于扩大筛查使用),相对应的,公安DNA法医鉴定对试
剂盒的基因座数量、信息含量及试剂盒的兼容性就有了更高的需求。而目前市面上,在优选
基因座上各家的试剂盒各不相同,公安在使用过程中极不方便,且公安用户除了对基因座
的需求增加以外,主要对扩增时间、适用检材种类、灵敏度等也有了越来越高的要求。
发明内容
容性、减少扩增时间、提高试剂盒的检材适应性、提高试剂盒的灵敏度、缩短扩增片段大小、
增加试剂盒的特异性,进一步满足公安用户的使用需求。
分别是:D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、
D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、CSF1PO、
Penta E、D6S1043和D12S391;所述2个性别鉴定基因座为rs2032678和Amelogenin;所述特
异性扩增引物组包括:rs2032678扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:1 2所示;
~
Amelogenin扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:3 4所示;D5S818扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:5 6所示;D13S317扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:7 8所示;
~ ~
D7S820扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:9 10所示;D16S539扩增用引物对:核苷酸
~
序列如SEQ ID NO:11 12所示;D10S1248扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:13 14所
~ ~
示;D3S1358扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:15 16所示;TH01扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:17 18所示;D21S11扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:19 20所
~ ~
示;D2S1338扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:21 22所示;D1S1656扩增用引物对:核
~
苷酸序列如SEQ ID NO:23 24所示;Penta D扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:25 26
~ ~
所示;D2S441扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:27 28所示;D19S433扩增用引物对:
~
核苷酸序列如SEQ ID NO:29 30所示;D18S51扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:31
~ ~
32所示;D22S1045扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:33 34所示;vWA扩增用引物对:
~
核苷酸序列如SEQ ID NO:35 36所示;D8S1179扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:37
~ ~
38所示;TPOX扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:39 40所示;FGA扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:41 42所示;CSF1PO扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:43 44所
~ ~
示;Penta E扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:45 46所示;D6S1043扩增用引物对:核
~
苷酸序列如SEQ ID NO:47 48所示;D12S391扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:49 50
~ ~
所示。
DNA 9948、上述技术方案所述特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水;所述检测试剂包
括分子量内标和等位基因阶梯。
μM;SEQ ID NO:3 4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;
~ ~
SEQ ID NO:5 6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;SEQ ID
~ ~
NO:7 8所示的中D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.08 0.13μM;SEQ ID NO:9 10
~ ~ ~
所示的D7S820扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.28 0.33μM;SEQ ID NO:11 12所示的
~ ~
D16S539扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:13 14所示的
~ ~
D10S1248扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:15 16所示的
~ ~
D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.09 0.14μM;SEQ ID NO:17 18所示的TH01
~ ~
扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07 0.12μM;SEQ ID NO:19 20所示的D21S11扩增用
~ ~
引物对中各引物的浓度分别为0.17 0.22μM;SEQ ID NO:21 22所示的D2S1338扩增用引物
~ ~
对中各引物的浓度分别为0.07 0.12μM;SEQ ID NO:23 24所示的D1S1656扩增用引物对中
~ ~
各引物的浓度分别为0.13 0.18μM;SEQ ID NO:25 26所示的Penta D扩增用引物对中各引
~ ~
物的浓度分别为0.26 0.31μM;SEQ ID NO:27 28所示的D2S441扩增用引物对中各引物的浓
~ ~
度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:29 30所示的D19S433扩增用引物对中各引物的浓度分
~ ~
别为0.25 0.30μM;SEQ ID NO:31 32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分别为
~ ~
0.10 0.15μM;SEQ ID NO:33 34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10
~ ~
0.15μM;SEQ ID NO:35 36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.08 0.13μM;
~ ~ ~
SEQ ID NO:37 38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.18 0.23μM;SEQ
~ ~
ID NO:39 40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:41
~ ~
42所示的FGA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10 0.15μM;SEQ ID NO:43 44所示的
~ ~ ~
CSF1PO扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10 0.15μM;SEQ ID NO:45 46所示的Penta
~ ~
E扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.32 0.37μM;SEQ ID NO:47 48所示的D6S1043扩增
~ ~
用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;SEQ ID NO:49 50所示的D12S391扩增用引
~ ~
物对中各引物的浓度分别为0.27 0.32μM。
~
200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μ
M的dNTP、1000 1500mM的甜菜碱、0.19% 0.38%的Triton、0.5 1mg/ml的BSA、5% 15%的
~ ~ ~ ~
Tween、2.5% 7.5%的甘油和去离子水。
~
13、14、15;D16S539:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;D10S1248:8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18;
34.2、35、35.2、36、36.2、37、38;D2S1338:11、12、13、14、
16.2、17、18、18.2、19;D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27;
TPOX:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、
27、28、29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2;
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25;D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27。
和550bp共16条DNA片段。
法亲缘关系鉴定中的应用。
个性别鉴定基因座,可有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险;25个基因
座联合起来,具有高个体识别力、高非父排除率的特征。本发明还具有以下有益效果:
过研究筛选,确保所选基因座与市场主流试剂盒的基因座具有一定兼容性,即可以与已有
DNA数据进行共享与交流,最后筛选出所述25个STR基因座。本发明的试剂盒可快速扩增、灵
敏度高、同时可适用于各种检材的常染色体STR扩增检测。所选的25个基因座包含了公安部
规定的20个核心基因座,以及四个优选基因座,包含了目前市面上主流试剂盒的所有位点。
同时还包含了2个性别鉴定基因座,可以有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误
的风险。25个基因座联合起来,具有高个体识别力、高非父排除率的特征。
~
32bp之间,TM值在60℃左右,且每对引物均具有很高的特异性,所有25对引物之间均无相互
作用,使得25个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在70 400bp
~
之间(除FGA),更加利于降解检材的检测。经过扩增反应,每个基因座均能得到特异性的1 2
~
条扩增带,对常见动物及微生物无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。
橙色。借此,在一个反应中可以同时扩增25个基因座,充分满足了目前公安DNA数据库对比
的兼容性。
加,可以有效的减少操作步骤,从而减少交叉污染的风险。本发明的反应预混液还具有快
速、灵敏、适应性强的特点,反应时间缩短至60分钟,灵敏度高达0.03ng、适应各类DNA及各
种血卡、FTA卡、唾液卡等。本发明PCR预混液和引物混合物均为5x,25μL扩增体系模板上样
量最大可达到15μL,有助于低浓度模板的扩增。另外,本系统针对的样本是各种检材提取的
DNA样本,扩增程序时间全长仅为60min,而且对于未稀释的高浓度样本,根据其浓度减少相
应的扩增循环数,省略了稀释的步骤,同时扩增效率及整体均衡性不会受到影响。
特异性、优化扩增程序,筛选各个基因座的等位基因,设计大小合适的分子量内标,从而完
成了一款可以满足当前法医身份鉴定、法医DNA数据库建设、司法亲缘关系鉴定的多功能
STR身份鉴定试剂盒。
附图说明
具体实施方式
分别是:D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、
D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、CSF1PO、
Penta E、D6S1043和D12S391;所述2个性别鉴定基因座为rs2032678和Amelogenin;所述特
异性扩增引物组包括:rs2032678扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:1 2所示;
~
Amelogenin扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:3 4所示;D5S818扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:5 6所示;D13S317扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:7 8所示;
~ ~
D7S820扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:9 10所示;D16S539扩增用引物对:核苷酸
~
序列如SEQ ID NO:11 12所示;D10S1248扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:13 14所
~ ~
示;D3S1358扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:15 16所示;TH01扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:17 18所示;D21S11扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:19 20所
~ ~
示;D2S1338扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:21 22所示;D1S1656扩增用引物对:核
~
苷酸序列如SEQ ID NO:23 24所示;Penta D扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:25 26
~ ~
所示;D2S441扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:27 28所示;D19S433扩增用引物对:
~
核苷酸序列如SEQ ID NO:29 30所示;D18S51扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:31
~ ~
32所示;D22S1045扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:33 34所示;vWA扩增用引物对:
~
核苷酸序列如SEQ ID NO:35 36所示;D8S1179扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:37
~ ~
38所示;TPOX扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:39 40所示;FGA扩增用引物对:核苷
~
酸序列如SEQ ID NO:41 42所示;CSF1PO扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:43 44所
~ ~
示;Penta E扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:45 46所示;D6S1043扩增用引物对:核
~
苷酸序列如SEQ ID NO:47 48所示;D12S391扩增用引物对:核苷酸序列如SEQ ID NO:49 50
~ ~
所示。本发明所述引物组能够充分满足目前公安DNA数据库对比的兼容性,减少扩增时间、
提高鉴定效率和试剂盒的检材适应性。本发明针对25个基因座,设计了25对引物,引物长度
在18 30bp之间,TM值在60℃左右,且每对引物均具有很高的特异性,所有25对引物之间均
~
无相互作用,使得25个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在70
~
470bp之间。经过扩增反应,每个基因座均能得到特异性的1 2条扩增带,对常见动物及微生
~
物(常见微生物名称详见表2)无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰,其他物种及常见微
生物检测图谱见图9、图10、图11、图12。引物序列和在后续反应体系的引物混合物中的终浓
度如表1所示。
DNA 9948、上述技术方案所述特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水;所述检测试剂包
括分子量内标和等位基因阶梯。为了减少法医等使用者在排查过程中的重复扩增,本发明
选择基因座方面,包含了目前主流试剂盒所有的23个常染色STR基因座,23个常染色体STR
基因座分别是:D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、
D2S1338、D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、
CSF1PO、Penta E、D6S1043、D12S391;同时为了减少鉴定过程当中出现由于Y染色体基因缺
失造成的性别鉴定错误,本发明在传统的性别鉴定基因座Amelogenin外,还加入了一个高
度保守的Y染色体Indel位点:rs2032678,用于辅助性别鉴定。为了能在同一管中同时扩增
25个基因座,在对25个基因座的引物进行设计时,使各对引物能在一个管中、稳定兼容互不
反应,且特异性、二级结构、扩增效率、稳定性等大大提高。
μM;SEQ ID NO:3 4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;
~ ~
SEQ ID NO:5 6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;SEQ ID
~ ~
NO:7 8所示的中D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.08 0.13μM;SEQ ID NO:9 10
~ ~ ~
所示的D7S820扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.28 0.33μM;SEQ ID NO:11 12所示的
~ ~
D16S539扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:13 14所示的
~ ~
D10S1248扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:15 16所示的
~ ~
D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.09 0.14μM;SEQ ID NO:17 18所示的TH01
~ ~
扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07 0.12μM;SEQ ID NO:19 20所示的D21S11扩增用
~ ~
引物对中各引物的浓度分别为0.17 0.22μM;SEQ ID NO:21 22所示的D2S1338扩增用引物
~ ~
对中各引物的浓度分别为0.07 0.12μM;SEQ ID NO:23 24所示的D1S1656扩增用引物对中
~ ~
各引物的浓度分别为0.13 0.18μM;SEQ ID NO:25 26所示的Penta D扩增用引物对中各引
~ ~
物的浓度分别为0.26 0.31μM;SEQ ID NO:27 28所示的D2S441扩增用引物对中各引物的浓
~ ~
度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:29 30所示的D19S433扩增用引物对中各引物的浓度分
~ ~
别为0.25 0.30μM;SEQ ID NO:31 32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分别为
~ ~
0.10 0.15μM;SEQ ID NO:33 34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10
~ ~
0.15μM;SEQ ID NO:35 36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.08 0.13μM;
~ ~ ~
SEQ ID NO:37 38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.18 0.23μM;SEQ
~ ~
ID NO:39 40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12 0.17μM;SEQ ID NO:41
~ ~
42所示的FGA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10 0.15μM;SEQ ID NO:43 44所示的
~ ~ ~
CSF1PO扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10 0.15μM;SEQ ID NO:45 46所示的Penta
~ ~
E扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.32 0.37μM;SEQ ID NO:47 48所示的D6S1043扩增
~ ~
用引物对中各引物的浓度分别为0.06 0.11μM;SEQ ID NO:49 50所示的D12S391扩增用引
~ ~
物对中各引物的浓度分别为0.27 0.32μM。各引物浓度更优选如表1所示。通过对引物浓度
~
优化,本发明能够实现更好的均衡性及灵敏度。
200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μ
M的dNTP、1000 1500mM的甜菜碱、0.19% 0.38%的Triton、0.5 1mg/ml的BSA、5% 15%的
~ ~ ~ ~
Tween、2.5% 7.5%的甘油和去离子水。本发明所述去离子水为是高度去离子的水,电阻率达
~
到18.2MΩ,能够完全排除外来离子对扩增体系的干扰。本发明所述反应预混液具有快速、
灵敏度高、适应性强等特点,并且反应预混液可以在‑20℃条件下不结冰,可以有效的防止
冻融对试剂性能的影响。本发明的反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA,有效扩增时间降低到
60分钟,并且对不同来源(血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等)
的DNA均具有优良的扩增效果,同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。
色。
四组优选采用ROX,代表红;第五组优选采用PURPLE,代表紫;ORG代表橙色,用于内标。
13、14、15;D16S539:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;D10S1248:8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18;
34.2、35、35.2、36、36.2、37、38;D2S1338:11、12、13、14、
16.2、17、18、18.2、19;D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27;
TPOX:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15;FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、
27、28、29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2;
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25;D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27。
和550bp共16条DNA片段。可以有效的区分65 550bp的DNA片段的大小。分子量内标是由不同
~
大小荧光标记的DNA片段组成,目的是用来区分扩增产物的大小。
法亲缘关系鉴定中的应用。
对照DNA M2或9948。在本发明中,所述阳性对照DNA M2或9948优选均购自苏州新海生物科
技股份有限公司。
一传一)进行电泳检测可以收集到光信号,通过收集的光信号进行检测。
不限于以下实施例。
色光谱校正试剂(包括蓝、绿、黄、红、紫、橙)。
明扩增的M2分形图见图1、9948分型图见图2、M2或9948基因型见表4。
求》中所述标准(基因座内≥70%、同一颜色组内≥50%、不同颜色组间≥30),对引物浓度进
行了全面的优化,引物浓度见表1,扩增均衡性全面超越以上标准。
良的扩增效果,同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。反应预混液配方详
参见表5。
~200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1
μM的dNTP、1000 1500mM的甜菜碱、0.19% 0.38%的Triton、0.5 1mg/ml的BSA、5% 15%的
~ ~ ~ ~
Tween、2.5% 7.5%的甘油、去离子水。
~
好的扩增程序在ABI Proflex PCR仪上进行扩增,扩增程序如表6:
区分65 550bp的DNA片段的大小。
~
550+1μL PCR产物/1μL等位基因阶梯25A;分装进96孔板后,离心,去掉气泡,将96孔板放进
上样托盘,然后放进3500xl遗传分析仪,进样电压为1.8 kVolts,进样时间12 sec,之后开
始电泳。
内,扩增程序采用本发明标准扩增程序,扩增仪器采用ABI Proflex PCR仪,遗传分析仪采
用3500xl遗传分析仪,分析软件采用GeneMapper‑ID‑X分析软件。本实施例操作步骤如下:
增程序为:变性:95℃,5min;扩增:94℃ 10s,59℃ 80s,30个循环;终止延伸 60℃,10min;
15℃恒温保存。
泡,将96孔板放进上样托盘,然后放进3500xl遗传分析仪,进样电压为1.8 kVolts,进样时
间12 sec,之后开始电泳。
的方法建库,违法犯罪嫌疑人身份的鉴定工作中检材通常为复杂检材,采用提取DNA后进行
扩增检测方法进行检测。本发明可以兼顾两种不同的检材,方便全国DNA数据库的建设及对
违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。操作的详细部分如下:
照郑秀芬《法医DNA分析》第四章DNA提取)。
80s,30个循环;终止延伸 60℃,10min;15℃恒定。
泡,将96孔板放进上样托盘,然后放进3500xl遗传分析仪,进样电压为1.8 kVolts,进样时
间12 sec,之后开始电泳。
DNA检材基因分型图。由图可见,直扩血卡及提取DNA,所有基因座分型正确,且杂合子基因
座两个峰高一致,无峰高失衡现象,同一颜色组及不同颜色组各基因座峰高相当,均衡性
高。
80s,30个循环;终止延伸 60℃,10min;15℃恒定。
泡,将96孔板放进上样托盘,然后放进3500xl遗传分析仪,进样电压为1.8 kVolts,进样时
间12 sec,之后开始电泳。
出来,应出峰44个,实际出峰41个,丢峰3个,丢峰率6.8%,图14为市面一常见试剂盒,应出峰
54个,实际出峰45个,丢峰9个,丢峰率20%。由此看见本发明灵敏度明显高于市面试剂盒。
视为本发明的保护范围。