一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法

摘要

本发明涉及一种盐酸阿考替胺中杂质的检测方法，选择包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液和乙腈作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱的过程中，控制流动相中三乙胺的含量和pH值，检测出的杂质多，灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、盐酸阿考替胺主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，对各研究杂质均能有效分离，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控盐酸阿考替胺中的有关物质。

权利要求

1.一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为Inertsil ODS‑3，4.6×250mm，5μm；以包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，检测波长为220nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min；其中，流动相A的制备过程如下：取磷酸氢二钠2.72g、三乙胺1.0ml和水配制成1000ml溶液，用磷酸调pH值至3.0；所述梯度洗脱过程如下：(1)在0‑5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持90:10不变；(2)在5‑65分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；

所述有关物质包括以下物质：

2.根据权利要求1所述的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，溶解样品的溶剂采用包含流动相A和流动相B的混合溶剂，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为70～95:30～5。

3.根据权利要求2所述的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，所述混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为85～95:15～5。

4.根据权利要求3所述的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，所述混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为90:10。

5.根据权利要求1所述的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为5‑50μl。

6.根据权利要求5所述的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为20μl。

说明书

一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法。

背景技术

[0002] 盐酸阿考替胺(Acotiamide Hydrochloride)，化学名为N‑(2‑(二异丙基氨基)乙基)‑2‑(2‑羟基‑4,5‑二甲氧基苯甲酰胺)噻唑‑4‑甲酰胺盐酸盐三水合物，其化学结构式为：C21H31ClN4O5S·3H2O，分子量为541.06，CAS号为773092‑05‑0，其结构式如下所示：

[0003]

[0004] 盐酸阿考替胺由日本安斯泰来制药公司和日本泽里新药株式会社联合开发的一种新型的促进胃蠕动的毒覃碱M1和M2受体阻断剂，通过抑制乙酰胆碱酶起作用，用于促进胃动力、改善胃容纳障碍、增强胃底扩张。

[0005] 中国CN 106918659 A公开一种盐酸阿考替胺原料及其制剂中有关物质的分析方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以三乙胺‑磷酸盐缓冲水溶液和乙腈的体积比为88‑92:8‑12为流动相A，以三乙胺‑磷酸盐缓冲水溶液和乙腈的体积比为8‑12:88‑92为流动相B，检测波长为218‑222nm，进行梯度洗脱。但是，该专利提供的分析方法灵敏度不佳，主成分峰存在严重拖尾问题，检出的杂质少，色谱图出现基线不平滑，专属性不佳，分离度低的问题。

[0006] 为了保证药物的安全有效，需对药物的有关物质进行研究、检测和监控。

发明内容

[0007] 本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相A为包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至2.5‑4.0；所述流动相B为乙腈；所述梯度洗脱过程如下：(1)在0‑5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持90:10不变；(2)在5‑65分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70。

[0010] 本发明通过筛选流动相以及优化流动相的比例，选择包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液和乙腈作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱的过程中，控制流动相中三乙胺的含量和pH值，在其他条件配合下，检测出的杂质多，各杂质峰之间、盐酸阿考替胺主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，即可快速、有效、准确监控盐酸阿考替胺中的有关物质。

[0011] 本发明提供的检测方法，流动相A采用包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，在流动相A中需要严格控制三乙胺的含量，在梯度洗脱时，流动相A中三乙胺的含量过高或者过低会影响主峰与杂质峰之间的分离效果。流动相A中三乙胺含量过高，影响色谱柱耐用性；三乙胺含量过低，主成分峰拖尾因子变大，与主峰后杂质分离度降低。

[0012] 对于本发明而言，流动相A为包含0.05～0.25％三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，具体三乙胺的含量可以但不局限于0.05％、0.08％、0.10％、0.12％、0.15％、0.18％、0.2％或0.25％，为了获得更好的效果，流动相A中三乙胺的含量为0.10％。

[0013] 本发明提供的检测方法，在选择最佳的流动相之后，严格控制流动相的pH值，pH值过高或者过低不利于盐酸阿考替胺中主峰及其相邻杂质峰之间的分离。流动相pH值过高或过低，影响色谱柱耐用性，导致杂质与主成分及杂质与杂质之间分离度下降，不能达到基线分离。

[0014] 对于本发明而言，流动相A采用包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至2.5‑4.0，具体pH值可以但不局限于2.5、2.8、3.0、3.2、3.5或4.0。为了获得更好的效果，流动相A的配制过程中，用磷酸调节其pH值至2.8‑3.5；进一步优选地，流动相A的配制过程中，用磷酸调节其pH值至3.0。

[0015] 在一种优选方案中，流动相A为包含0.05～0.25％三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至2.8‑3.5。

[0016] 在一种更优选方案中，流动相A为包含0.1％三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至3.0。

[0017] 在一种特别优选方案中，流动相A的制备包括以下步骤：取磷酸氢二钠2.72g、三乙胺1.0ml和水配制成1000ml溶液，再用磷酸调节pH值至3.0，即得。

[0018] 采用本发明的检测方法，溶解样品的溶剂采用包含流动相A和流动相B的混合溶剂，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为70～95:30～5，可以但不局限于70:30、75:25、80:20、85:15、87:13、90:10、92:18或95:5，为了获得更好的分离效果，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为85～95:15～5；进一步优选地，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为90:10。

[0019] 本发明提到的高效液相色谱法的条件还包括：色谱柱为Inertsil ODS‑3或YMC ODS‑AQ，优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm，即色谱柱为Inertsil ODS‑3(4.6×250mm，5μm)或YMC ODS‑AQ(4.6×250mm，5μm)。

[0020] 进一步地，检测波长为210～230nm，优选为220nm；柱温为25～35℃，优选为30℃。

[0021] 进一步地，进样量为5‑50μl，优选为20μl；流速为0.8‑1.2ml/min，优选为1.0ml/min。

[0022] 本发明提供的盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，所述有关物质包括以下物质：

[0023]

[0024]

[0025] 本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质及主成分定位溶液、供试品溶液并进样，计算杂质的含量。

[0026] 其中，杂质及主成分定位溶液为：取杂质1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和盐酸阿考替胺样品适量，用混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为70～95:30～5，优选为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含各杂质5μg和盐酸阿考替胺0.5mg的溶液，作为杂质和主成分定位溶液。

[0027] 供试品溶液为：取盐酸阿考替胺适量，加混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为70～95:30～5，优选为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含盐酸阿考替0.5mg的溶液。

[0028] 本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的其他色谱条件，对阿考替胺以及上述的各杂质进行色谱检测，确定了本发明检测方法，通过对各杂质和盐酸阿考替胺峰定位试验，干扰性试验和阿考替胺的降解试验对本发明进行专属性验证。

[0029] 采用本发明的技术方案，优势如下:

[0030] 本发明提供的盐酸阿考替胺中杂质的检测方法，选择包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液和乙腈作为混合流动相进行梯度洗脱，在梯度洗脱的过程中，控制流动相中三乙胺的含量和pH值，检测出的杂质多，灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、盐酸阿考替胺主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，对各研究杂质均能有效分离，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控盐酸阿考替胺中的有关物质。

附图说明

[0031] 图1是杂质及主成分定位溶液的高效液相色谱图；

[0032] 图2是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；

[0033] 图3是对比例1中供试品溶液的高效液相色谱图；

[0034] 图4是对比例2中供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0035] 通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

[0036] 实施例1

[0037] 高效液相色谱条件：

[0038] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS‑3 4.6×250mm，5μm)；以包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液(取磷酸氢二钠2.72g、三乙胺1.0ml和水配制成1000ml溶液，再用磷酸调节pH值至3.0，)为流动相A；乙腈为流动相B，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；检测波长为220nm；柱温30℃，流速为1.0ml/min。

[0039] 梯度洗脱过程为：(1)在0‑5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持90:10不变；(2)在5‑65分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70。

[0040] 样品配制：

[0041] 取盐酸阿考替胺适量，加混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含盐酸阿考替0.5mg的溶液作为供试品溶液。

[0042] 试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图2。

[0043] 取盐酸阿考替胺配制供试品溶液，进样并记录色谱图，以主成分自身对照法计算供试品中杂质的含量，结果见表1和图2。

[0044] 表1盐酸阿考替胺中各杂质的含量测定结果

[0045]杂质 杂质5 未知杂质1 未知杂质2 总杂
含量(％) 0.025 0.032 0.055 0.112

[0046] 由表1和图2可以看出，盐酸阿考替胺供试品中检出已知杂质6，最大单杂为0.055％，总杂为0.112％。

[0047] 本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的溶剂，对盐酸阿考替胺以及10个杂质进行色谱检测，确定了本发明实施例1的检测方法。

[0048] 通过对各杂质和主成分盐酸阿考替胺的峰定位试验，干扰试验和降解试验对本发明进行专属性验证。

[0049] 杂质及主成分(盐酸阿考替胺)定位溶液为：取杂质1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和盐酸阿考替胺样品适量，用混合溶剂(流动相A和流动相B的的体积比为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含各杂质5μg和盐酸阿考替胺0.5mg的溶液，作为杂质和主成分定位溶液。

[0050] 取杂质及主成分(盐酸阿考替胺)定位溶液，按本例的高效液相色谱条件和方法进行检测，结果见表2和图1。

[0051] 表2专属性验证结果

[0052]

[0053] 由表2和图1可以看出，各杂质峰之间，阿考替胺主峰及其相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，峰纯度均较好，本发明的专属性好。

[0054] 精分别取杂质1‑杂质10、盐酸阿考替胺对照品各适量，加混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为90:10)溶解稀释制成约50μg/ml的溶液，作为各杂质储备液，精密量取适量，加混合溶剂稀释制成定量限、线性40％、80％、100％、150％的溶液。

[0055] 以浓度(μg/ml)为横坐标(X轴)，峰面积为纵坐标(Y轴)，盐酸阿考替胺及杂质的线性范围及线性方程见表3。

[0056] 取上述杂质溶液逐步稀释后进样20μl，以信噪比S/N＝3、S/N＝10分别作为检测限和定量限，结果见表3。

[0057] 表3盐酸阿考替胺和各杂质的检测限、定量限、线性试验结果

[0058]

[0059]

[0060] 由表3可以看出，本发明阿考替胺和各杂质检测灵敏度均较高，其检测限和定量限均较小，并且各杂质在较低浓度范围内线性关系良好。

[0061] 对照品溶液：精密量取线性下各杂质储备液适量，加混合溶剂稀释制成约0.5μg/ml，摇匀，作为杂质对照品溶液；

[0062] 本底溶液配制：精密称取盐酸阿考替胺原料约25mg至50ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

[0063] 回收率溶液(80％)配制：精密称取盐酸阿考替胺原料50mg置100ml量瓶中，精密加入0.8ml各杂质储备液，再加入混合溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)[0064] 回收率溶液(100％)配制：精密称取盐酸阿考替胺原料50mg置100ml量瓶中，精密加入1.0ml各杂质储备液，再加入混合溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)[0065] 回收率溶液(120％)配制：精密称取盐酸阿考替胺原料50mg置100ml量瓶中，精密加入1.2ml各杂质储备液，再加入混合溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，即得。(平行3份)[0066] 取上述对照品溶液、本底溶液、回收率样品溶液各20μl注入液相色谱仪，进行回收率测定，结果统计见表4。

[0067] 表4各杂质的回收率验证结果

[0068]试验 回收率90‑108％ 回收率RSD≤5.0％
杂质1 98.3‑105.1％ 3.3
杂质2 98.6‑104.1％ 4.1
杂质3 96.7‑105.1％ 2.8
杂质4 98.6‑103.5％ 3.5
杂质6 98.9‑104.5％ 2.4
杂质7 100.4‑105.1％ 2.4
杂质8 98.9‑102.4％ 1.9
杂质9 98.1‑104.2％ 2.8
杂质10 98.5‑104.8％ 3.6

[0069] 由表4可以看出，本发明的回收率试验结果符合要求，本发明回收率高。

[0070] 对比例1

[0071] 高效液相色谱条件：

[0072] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS‑3 4.6×250mm，5μm)；以包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液(取磷酸氢二钠2.72g、三乙胺1.0ml和水配制成1000ml溶液，再用磷酸调节pH值至3.0，)为流动相A；乙腈为流动相B，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃，流速为1.0ml/min。

[0073] 梯度洗脱过程为：(1)在0‑5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；(2)在5‑65分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至30:70。

[0074] 样品配制：

[0075] 取盐酸阿考替胺适量，加混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含盐酸阿考替0.5mg的溶液作为供试品溶液。

[0076] 试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图3。

[0077] 本对比例调整梯度洗脱过程中流动相的初始比例，由图3可知，主成分峰保留时间提前至23.261min，与杂质2峰未达到基线分离，分离度下降，影响杂质2检出结果的准确性。

[0078] 对比例2

[0079] 高效液相色谱条件：

[0080] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS‑3 4.6×250mm，5μm)；以包含三乙胺的磷酸氢二钠缓冲液(取磷酸氢二钠2.72g、三乙胺1.0ml和水配制成1000ml溶液，再用磷酸调节pH值至5.0，)为流动相A；乙腈为流动相B，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃，流速为1.0ml/min。

[0081] 梯度洗脱过程为：(1)在0‑5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持90:10不变；(2)在5‑65分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70。

[0082] 样品配制：

[0083] 取盐酸阿考替胺适量，加混合溶剂(流动相A和流动相B的体积比为90:10)溶解并稀释制成每1ml中含盐酸阿考替0.5mg的溶液作为供试品溶液。

[0084] 试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图4。

[0085] 本对比例中调整流动相A中pH值至5.0，由图4可知，主峰保留时间延后至39.544min，与杂质2峰未达到基线分离，分离度下降，影响杂质2检出结果的准确性。

[0086] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。