本发明涉及一种氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱测定方法，属于农药残留检测技术领域。所述方法包括下述步骤：采用QuEChERS前处理方法，将样品以有机溶剂萃取，离心后将上清液经分散固相萃取净化，并以液相色谱串联质谱进行测定。本发明首次建立了氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱分析方法，适用于蔬菜、瓜果、烟草等样品中氟噻虫砜代谢物残留的提取和测定。且本发明在测定氟噻虫砜代谢物残留量时采用氟噻虫砜代谢物空白样品进行基质配标，可使测定结果更为准确。
1.一种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：
将样品以水浸润，加入乙腈进行涡旋振荡提取，‑18℃冷冻保存后，分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二钠，涡旋振荡后离心，取上清液于离心管中，加入无水硫酸镁和N‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，涡旋振荡后离心，上清液经有机相滤膜过滤，最后进行超高效液相色谱‑串联质谱测定分析；
所述氟噻虫砜代谢物具体为3,4,4‑三氟‑3‑丁烯‑1‑磺酸，结构式如下:
所述超高效液相色谱‑串联质谱测定的条件为：色谱柱：Atlantis T3液相色谱柱，规格
50 mm×2.1 mm，3 μm；柱温：40℃；进样量：2 μL；流动相：流动相A：乙腈，流动相B：0.1% 甲酸水溶液，进行等度洗脱：10%A: 90%B，体积比；流速：0.3 mL/min；质谱条件：扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI），温度：150℃；毛细管电压：2.4 kV；去溶剂气温度：
300℃；去溶剂气流速：800 L/h；反吹气流速：150 L/h；监测模式：多反应监测。
2.根据权利要求1所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：每2g样品对应加入10mL水、10mL乙腈。
3.根据权利要求1所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：所述涡旋振荡为以2000rpm的速度振荡2min；所述离心为以4000 rpm的转速离心
4.根据权利要求1或2所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：所述样品为蔬菜、瓜果或烟草。
5.根据权利要求1所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：所述过滤为采用0.22 μm的有机相滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：在超高效液相色谱‑串联质谱测定中，采用空白基质配制系列标准工作溶液。
7.根据权利要求6所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：空白基质的制备过程如下：称取2.00g不含氟噻虫砜代谢物的烟末样品于50mL的具盖离心管中，加入10mL水，手动振荡至样品被水充分浸润后静置10min；加入10mL乙腈，以
2000r/min涡旋振荡2min，‑18℃冷冻保存10min后，分别加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二钠，立即以2000r/min涡旋振荡2min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4000r/min离心10min，取1mL上清液至1.5mL离心管中，加入
150mg无水硫酸镁和25mgN‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，以2000r/min涡旋振荡2min，然后以4000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，即得。
8.根据权利要求6所述的种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：系列标准工作溶液的配制过程如下：
1）储备液的制备：称取10 mg氟砜灵代谢物标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；
2）系列标准工作溶液的配制：分别移取0.2mL上述标准工作溶液和0.2mL空白样品提取液，混合后用乙腈稀释至1mL，配制成基质混合标准工作溶液；配制的各基质混合标准工作溶液中氟噻虫砜代谢物的浓度分别为0.004 μg/mL, 0.01 μg/mL, 0.02 μg/mL, 0.04 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL。
一种氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种烟草中残留氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱测定方法，属于农药残留检测技术领域。
背景技术
[0002] 氟噻虫砜，又氟烯线砜、氟砜灵，是氟代烯烃类硫醚化合物，是近20多年中开发的唯一一个新化学杀线虫剂，具有触杀活性，可使种植者摆脱多年来对熏蒸型杀线虫剂的依赖，同时避免施用熏蒸剂所带来的一些不利后果。氟噻虫砜代谢物可用于多种作物线虫病的综合治理，如茄子、辣椒、西红柿、烟草等茄科作物，黄瓜、西葫芦、南瓜、西瓜、哈密瓜等瓜类作物，菊科、十字花科叶菜，马铃薯、红薯等薯芋类。
[0003] 氟噻虫砜由以色列马克西姆公司（现安道麦）于1993‑1994年研发，2014年上市，近年来，市场增长迅速。2019年1月30日，安道麦马克西姆有限公司在我国登记了95%氟烯线砜原药和40%氟烯线砜乳油；制剂产品商品名为尼咪特®，土壤喷雾，防治黄瓜根结线虫，制剂2
用药量为500～600 mL/667 m 。同年，尼咪特®在中国上市。氟噻虫砜在植物和/或动物中主要代谢为噻唑磺酸代谢物（thiazole sulfonic acid, TSA）、甲基砜代谢物（methyl sulfone metabolite, MeS）和丁烯磺酸代谢物（butene sulfonic acid metabolite, BSA）。其中，研究表明：氟噻虫砜在烟草中主要代谢物为BSA。毒理学数据表明氟噻虫砜会导致小鼠肺部细胞增殖，并进一步导致肺泡/细支气管增生，最终导致肿瘤的出现。且研究表明BSA代谢物具有与氟噻虫砜相似的毒性。
[0004] 目前，美国环保署发布的蔬菜瓜果类中氟噻虫砜的残留限量为0.5 mg/kg, CORESTA（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco）推荐的在烟草中的暂时性指导性残留量（Guidance Residue Level, GRL）为0.15 mg/kg，包括其代谢物BSA换算成的氟噻虫砜残留量。因此，十分有必要建立氟噻虫砜代谢物的分析方法，从而为氟噻虫砜及其代谢物残留量的监控提供技术支持。
发明内容
[0005] 本发明的首要目的在于提供一种氟噻虫砜代谢物残留的液相色谱串联质谱测定方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
[0007] 将样品以水浸润，加入乙腈进行涡旋振荡提取，‑18℃冷冻保存以避免后续除水盐析过程局部放热过多导致残留的氟噻虫砜代谢物分解或挥发，然后分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二钠进行除水和盐析，其中柠檬酸钠和柠檬酸二钠是为了提供碱性的缓冲环境，以保证氟噻虫砜代谢物的回收率，涡旋振荡后离心，取上清液于离心管中，加入无水硫酸镁和N‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，涡旋振荡后离心，上清液经有机相滤膜过滤，最后进行超高效液相色谱‑串联质谱测定分析。
[0008] 每2g样品对应加入10mL水、10mL乙腈。
[0009] 所述涡旋振荡为以2000rpm的速度振荡2min。
[0010] 所述离心为以4000 rpm的转速离心10min。
[0011] 所述过滤为采用0.22 μm的有机相滤膜过滤。
[0012] 所述超高效液相色谱‑串联质谱测定的条件为：色谱柱：Atlantis T3液相色谱柱（50 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流动相：流动相A：乙腈，流动相B：0.1% 甲酸水溶液，进行等度洗脱；流速：0.3 mL/min；质谱条件：扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI），温度：150℃；毛细管电压：2.4 kV；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流速：800 L/h；反吹气流速：150 L/h；监测模式：多反应监测。
[0013] 所述等度洗脱的洗脱条件为：10%A: 90%B（体积比）。
[0014] 上述0.1% 甲酸水溶液是指甲酸与水的体积比为1:999。
[0015] 在液相色谱‑串联质谱测定中，采用空白基质配制系列标准工作溶液。
[0016] 氟噻虫砜代谢物BSA分子量小、极性强、离子化效率低，对其检测具有技术难度。目前尚无针对此物质的检测方法报道。本发明的氟噻虫砜代谢物残留的测定方法，对样品件处理以及色谱条件等进行了系统优化，先用QuEChERS前处理技术，对样品中残留的氟噻虫砜代谢物进行提取，然后再进行超高效液相色谱‑串联质谱测定，外标法定量。本发明的氟噻虫砜代谢物残留的测定方法简单、准确、精密度高。
附图说明
[0017] 图1空白基质匹配的标准工作溶液总离子流图；
[0018] 图2 定性和定量提取离子图。
具体实施方式
[0019] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0020] 仪器与试剂
[0021] 超高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）；
[0022] Milli‑Q超纯水系统（美国Millipore公司）；
[0023] 氟噻虫砜代谢物（安道麦马克西姆有限公司）；
[0024] 乙腈（色谱纯，美国J. T. Baker公司）。
[0025] 实施例1
[0026] 本实施例的烟草中残留氟噻虫砜代谢物的QuEChERS提取方法，包括以下步骤：
[0027] 称取2.00g（精确至0.01g）烟末样品于50mL的具盖离心管中，加入10mL水，手动振荡至样品被水充分浸润后静置10min。加入10mL乙腈，以2000r/min涡旋振荡2min，‑18℃冷冻保存10min后，分别加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二钠，立即以2000r/min涡旋振荡2min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4000r/min离心10min，取1mL上清液至1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁和25mgN‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，以2000r/min涡旋振荡2min，然后以4000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，待液相色谱串联质谱分析。
[0028] 本实施例的烟草中残留氟噻虫砜代谢物的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下步骤：
[0029] 1）待测液的制备
[0030] 称取2.00g（精确至0.01g）烟末样品于50mL的具盖离心管中，加入10mL水，手动振荡至样品被水充分浸润后静置10min。加入10mL乙腈，以2000r/min涡旋振荡2min，‑18℃冷冻保存10min后，分别加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二钠，立即以2000r/min涡旋振荡2min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4000r/min离心10min，取1mL上清液至1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁和25mgN‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，以2000r/min涡旋振荡2min，然后以4000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，即得。需要说明的是：提取溶剂除乙腈外，还考察了甲醇，结果表明乙腈的提取效率更高。
[0031] 2）空白基质的制备
[0032] 称取2.00g（精确至0.01g）不含氟噻虫砜代谢物的烟末样品于50mL的具盖离心管中，加入10mL水，手动振荡至样品被水充分浸润后静置10min。加入10mL乙腈，以2000r/min涡旋振荡2min，‑18℃冷冻保存10min后，分别加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二钠，立即以2000r/min涡旋振荡2min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4000r/min离心10min，取1mL上清液至1.5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁和25mgN‑丙基乙二胺键合固相吸附剂，以2000r/min涡旋振荡2min，然后以4000r/min离心10min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，即得。
[0033] 3）系列标准工作溶液的配制
[0034] 储备液的制备：称取10 mg氟砜灵代谢物标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液（氟砜灵代谢物在其他有机溶剂中不溶或溶解度小）。
[0035] 系列标准工作溶液的配制：分别移取0.2mL上述标准工作溶液和0.2mL空白样品提取液，混合后用乙腈稀释至1mL，配制成基质混合标准工作溶液；配置的各基质混合标准工作溶液中氟噻虫砜代谢物的浓度分别为0.004 μg/mL, 0.01 μg/mL, 0.02 μg/mL, 0.04 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL。
[0036] 4）标准工作曲线的制作
[0037] 将步骤3）所得6种浓度的系列标准工作溶液进行超高效液相色谱‑串联质谱测定分析，以目标物的色谱峰面积为纵坐标，以氟噻虫砜代谢物的含量为横坐标进行回归分析，得到标准曲线及其回归方程。第三级标准工作溶液的色谱图如图1所示。标准工作曲线为Y=2
381.479*X+9018.97（R =0.997498）。
[0038] 上述超高效液相色谱‑串联质谱的测定条件为：色谱条件：色谱柱为Atlantis T3液相色谱柱（50 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流动相：流动相A：乙腈，流动相B：0.1% 甲酸水溶液，进行等度洗脱（10%A: 90%B，体积比）；流速：0.3 mL/min。质谱条件：扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI），温度：150℃；毛细管电压：2.4 kV；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流速：800 L/h；反吹气流速：150 L/h；监测模式：多反应监测模式（MRM），详细参数见表1。需要说明的是：除步骤4）中的Atlantis T3色谱柱外，还分别考查了Thermo Hypercarb色谱柱对氟噻虫砜代谢物测定的影响，其中Atlantis T3效果最好。
[0039] 表1氟噻虫砜代谢物的UPLC‑MS/MS MRM参数
[0040]
[0041] *定量离子
[0042] 5）待测液的超高效液相色谱‑串联质谱测定
[0043] 将步骤1）所得待测液进行超高效液相色谱‑串联质谱测定，测定条件同步骤4）中超高效液相色谱‑串联质谱的测定条件。将测定所得的目标分析物的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积之比代入步骤4）所得的标准曲线中，计算得到待测液中氟噻虫砜代谢物的含量。
[0044] 实验例2
[0045] 对空白烟末样品按10 、20、50mg/kg三个添加水平进行回收率实验，平行测定3次，得到的相对回收率在95.6 102.9%范围内。以空白基质逐步稀释由空白基质匹配的最低浓~度标准工作溶液，以3倍信噪比为检出限、10倍信噪比为定量限，得到本方法的检出限为：
0.01 mg/kg、定量限为：0.03 mg/kg。
