烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法

摘要

本发明所提出的烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法；采用超高液相色谱分析，最优的色谱条件为采用HSS T3(2.1×100mm,1.7μm)；色谱柱温度为32℃，进样量10μL；流动相A相为浓度为体积百分比为5:95的甲醇：0.1％甲酸，B相为浓度0.1％的甲酸甲醇；流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件非规则梯度设置，该测定方法能够准确、快速地测定出这九种物质的含量；以满足不同类型物质的同时、快速准确的检测。

权利要求

1.一种烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)对照工作溶液配制

称取九种天然活性成分对照品混合，并采用50％甲醇水溶液作为提取液进行定容并超声，得到浓度为1000μg/mL的溶液A；再采用50％甲醇水溶液作为提取液稀释溶液A得到10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的梯度浓度对照工作液；九种天然活性成分为：没食子酸、天麻素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、葛根素、芦丁、槲皮素和姜黄素；

(2)待测品制备

称取待测品1.0000g定容至25mL，用提取液溶解超声萃取10分钟后，冷却至室温后再用提取液稀释并定容得到滤液，滤液供液相色谱检测；

(3)液相色谱分析

采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用PDA检测器进行检测；

色谱条件：采用HSS T3柱，2.1×100mm,1.7μm；色谱柱温度为32℃，进样量10μL；流动相包括有A相和B相，A相为浓度为体积百分比为5:95的甲醇：0.1％甲酸，B相为体积百分比为浓度为0.1％的甲酸甲醇；流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件为：

0min‑2min流动相A为100％，

5min时流动相A为85％、流动相B为15％，

7min时流动相A为80％、流动相B为20％，保留5min，

14min时流动相A为40％、流动相B为60％，保留2min，

18min时流动相A为20％、流动相B为80％，保留5min，

24min时流动相A为100％，且平衡5min后进下一针；

检测器PDA的波长条件为：206nm、221nm、325nm和428nm。

2.根据权利要求1的烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法，其特征在于，在步骤(2)中，称取超声后的溶液10mL置于离心管中，在8000r/min下离心10min后，用0.22μm微孔滤膜过滤。

3.根据权利要求1的烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法，其特征在于，九种天然活性成分对照品为色谱级别。

说明书

烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及烟用香精中天然活性成分的定量分析技术领域，尤其涉及一种烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法。

背景技术

[0002] 烟用香精香料具有改善卷烟吸味品质，赋予卷烟特征香气的作用，是构成卷烟品牌风格的重要因素。烟用香精中一些天然活性成分对健康吸味均有一定的影响，因此有必要对烟用香精香料中活性成分的质量进行全面评估。而其中的九种天然活性成分就是检测的重点，但是这九种天然活性成分的均属不同类物质，且吸收波长也不尽相同，如果强行取一个中间波长来检测不同物质，必定会造成有些物质的检出限太低，无法达到基最低检出限，而造成误差；在现有技术中，也多是针对某一种物质或者某一类具有共同特性的物质采用HPLC法进行同时检测，因为其可以采用相对常规的流动相和洗脱梯度，并且波长选择也是折中选择即可。但是，烟用香精的检测是需要将不同类物质的同时检出，那么其洗脱特性和分离度是需要考究的，而流动相的选择及梯度洗脱程度都是直接影响到不同类物质的检测成功与否，也决定了这个检测过程所需时间，因此，针对包含多种不同类成分的烟用香精的检测，如何解决不同类物质共用的流动相的选择和洗脱梯度设置；以及采用何种波长吸收峰来做到同时检测，都是在烟用香精检测中需要解决的问题。

发明内容

[0003] 针对上述技术中存在的如:还未有一种高效、快速测定烟用香精中不同类的九种天然活性成分的测定方法；本申请所涉及九种天然活性成分为：没食子酸、天麻素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、葛根素、芦丁、槲皮素和姜黄素；且计量单位均为mg/g。

[0004] 具体为一种烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法，包括以下步骤:

[0005] (1)对照工作溶液配制

[0006] 称取九种天然活性成分对照品混合，并采用50％甲醇水溶液作为提取液定容并超声，得到浓度为1000μg/mL的溶液A；再采用提取液50％甲醇水溶液稀释溶液A得到10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的梯度浓度对照工作液；九种天然活性成分为：没食子酸、天麻素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、葛根素、芦丁、槲皮素和姜黄素；

[0007] (2)待测品制备

[0008] 称取待测品1.0000g定容至25mL棕色容量瓶中，用提取液溶解超声萃取10分钟后，冷却至室温后再用提取液稀释并定容得到滤液，滤液供液相色谱检测；

[0009] (3)液相色谱分析

[0010] 采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用PDA检测器进行检测；

[0011] 色谱条件：采用HSS T3柱，2.1×100mm,1.7μm；色谱柱温度为32℃，进样量10μL；流动相包括有A相和B相，A相为浓度为体积百分比为5:95的甲醇：0.1％甲酸，B相为0.1％浓度的甲酸甲醇；流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件为：

[0012] 0min‑2min流动相A为100％，

[0013] 5min时流动相A为85％、流动相B为15％，

[0014] 7min时流动相A为80％、流动相B为20％，保留5min，

[0015] 14min时流动相A为40％、流动相B为60％，保留2min，

[0016] 18min时流动相A为20％、流动相B为80％，保留5min，

[0017] 24min时流动相A为100％，且平衡5min后进下一针；

[0018] 检测器PDA的波长条件为：206nm、221nm、325nm和428nm。

[0019] 作为优选，在步骤(2)中，称取超声后的溶液10mL置于离心管中，在8000r/min下离心10min后，用0.22μm微孔滤膜过滤。

[0020] 作为优选，九种天然活性成分对照品为色谱级别。

[0021] 本发明的有益效果是:本发明所提出的烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法；因为该九种天然活性成分不属于同类物质，因此其物质极性和分离洗脱程度均不相同；故而本发明首次建立了测定烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法；采用超高液相色谱分析，最优的色谱条件为采用HSS T3柱，2.1×100mm,1.7μm；色谱柱温度为32℃，进样量10μL；流动相包括有A相和B相，A相为浓度为体积百分比为5:95的甲醇：0.1％甲酸，B相为体积百分比为浓度为0.1％的甲酸甲醇；流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件为：0min‑2min流动相A为100％，5min时流动相A为85％、流动相B为15％，7min时流动相A为80％、流动相B为20％，保留5min，14min时流动相A为40％、流动相B为60％，保留2min，18min时流动相A为20％、流动相B为80％，保留5min，24min时流动相A为100％，且平衡5min后进下一针，该测定方法能够准确、快速地测定出这九种物质的含量。

附图说明

[0022] 图1为本发明烟用香精中九种物质对照品的液相色谱图；

[0023] 图2为本发明1号烟用香精样品的液相色谱图；

[0024] 图3为本发明2号烟用香精样品的液相色谱图；

[0025] 图4为本发明3号烟用香精样品的液相色谱图；

[0026] 图5为本发明4号烟用香精样品的液相色谱图；

[0027] 图6为本发明5号烟用香精样品的液相色谱图；

[0028] 图7为本发明6号烟用香精样品的液相色谱图；

[0029] 图8为本发明实施例2的液相色谱图。

具体实施方式

[0030] 为了更清楚地表述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地描述。

[0031] 首先，对于本发明的发明初衷和思路，是因为烟用香精中含有九种不同类的天然活性物质，而不同类的物质如果采用超高液相法进行检测的话，如何根据各种物质的极性来设计梯度洗脱都是一个现有技术中无法解决的问题，并且，对于这些不同类物质的吸收波长也不同的情况下，采用何种波长进行能够让其吸收峰快速呈现并且准确分离也是难点所在。

[0032] 实施例1

[0033] 一种烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法包括以下步骤:九种天然活性成分对照品为色谱级别；

[0034] (1)对照工作溶液配制

[0035] 准确称取九种天然活性成分适量于25mL棕色容量瓶中，加提取液超声5min，待全部溶解后，再用浓度为50％的甲醇水溶液作为提取溶定容至刻度，使其浓度约为：1000μg/mL；作为溶液A保存至4℃冰箱中，保存期为3个月；再采用50％的甲醇水溶液作为提取液稀释溶液A得到10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的梯度浓度对照工作液；九种天然活性成分为：没食子酸、天麻素、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、葛根素、芦丁、槲皮素和姜黄素；

[0036] (2)待测品制备

[0037] 称取待测品1.0000g定容至25mL棕色容量瓶中，用提取液溶解超声萃取10分钟后，冷却至室温后再用提取液稀释并定容得到滤液，称取超声后的溶液10mL置于离心管中，在8000r/min下离心10min后，用0.22μm微孔滤膜过滤；滤液供液相色谱检测；

[0038] (3)液相色谱分析

[0039] 采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用PDA检测器进行检测；

[0040] 色谱条件：采用HSS T3柱，2.1×100mm,1.7μm；色谱柱温度为32℃，进样量10μL；流动相包括有A相和B相，A相为浓度为体积百分比为5:95的甲醇：0.1％甲酸，B相为浓度0.1％的甲酸甲醇；流速为0.3mL/min；梯度洗脱条件为：

[0041] 0min‑2min流动相A为100％，

[0042] 5min时流动相A为85％、流动相B为15％，

[0043] 7min时流动相A为80％、流动相B为20％，保留5min，

[0044] 14min时流动相A为40％、流动相B为60％，保留2min，

[0045] 18min时流动相A为20％、流动相B为80％，保留5min，

[0046] 24min时流动相A为100％，且平衡5min后进下一针；

[0047] 检测器PDA的波长条件为：206nm，221nm，325nm和428nm进行全时段同时扫描。

[0048] 由于采用了全时段的同时扫描，因此会呈现是四个波长对应的四条曲线，但是其出风分离时间是不一样的，因此可以直接拟合成一条曲线进行展示和观察。另外，在现有技术中，梯度洗脱往往有几种常见的设置方式，也就是两种溶剂组成可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度；在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，而这种不断变化的过程，对于不同类物质的洗脱更是难以抉择，例如现有技术中针对上述九种中儿茶素类物质洗脱，最常用的溶剂是稀磷酸与稀乙酸，而稀磷酸是无机酸，对系统及柱可能会造成不同程度的损害；即便是忽略这一弊端，对于其它物质的分离程度也不够良好；因此，针对本申请的九种不同类物质，其流动相洗脱梯度的设计无法从现有技术中直接推断获得。

[0049] 将上述步骤(1)中的各浓度梯度的混合标准溶液按照方法流程进行测定；同时对六个批次的烟用香精进行九种天然活性成分的测定；得到如图1‑图7的液相色谱图；根据对照品的液相色谱图的出峰时间可以知道，每种物质的出峰时间并不重叠，但是非常紧凑，并且可以很快速准确的被分离检测到；所以在图2‑图7可以判断出各物质的反应峰，从而利用保留时间和峰面积进行定性定量的分析；六批次烟用香精的含量如下表1：

[0050] 表1

[0051]

[0052] 实施例2

[0053] 其余条件均与实施例1中相同，在洗脱梯度设置采用了不同的设置；

[0054] 流动相：A相，甲醇：0.1％甲酸＝5：95；B相，0.1％甲酸甲醇，梯度洗脱条件为：

[0055] 0min‑2min流动相A为95％，B相为5％；

[0056] 5min时流动相A为85％、流动相B为15％，

[0057] 7min时流动相A为80％、流动相B为20％，保留5min，

[0058] 14min时流动相A为40％、流动相B为60％，保留2min，

[0059] 18min时流动相A为20％、流动相B为80％，保留5min，

[0060] 24min时流动相A为95％，B相为5％，且平衡5min后进下一针；

[0061] 请参阅图8；结果发现，依照实施例2进行的实验出现了没食子酸与天麻素的析出峰重叠，无法准确的进行计量；而通过上述梯度洗脱条件的对比可以知道，条件已经在现有常用的线性梯度或凹形梯度上优化，但是还是无法准确对不同类物质的准确分离。可见如本申请这种需要分离多种不同类物质的检测中，其流动相和梯度洗脱条件的设计尤为关键、并且无法通过简单的重复实验从现有技术中推导而出。

[0062] 本发明的优势在于:

[0063] 1)本发明建立了一种利用超高液相色谱配备PDA检测器快速检测烟用香精中九种天然活性成分含量的测定方法，能够准确地进行定量，为不同类物质的准确判定、快速检测提供科学依据；

[0064] 2)本发明中的处理流程选择对各种物质达到了优异的分离效果；

[0065] 3)实现在24分钟内，对样品的快速灵敏分析。

[0066] 以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。