PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN202110978222.0
文献号 : CN113419060B
文献日 : 2021-11-02
发明人 : 杜淑媛 , 卢璋 , 张鸿雁 , 杨增琳 , 曹瑞迪 , 张飘然 , 高卢翔 , 刘文秀
申请人 : 山东师范大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种检测病原体的方法,其特征在于:采用试纸条进行检测,检测的方法为:采用直接视觉检测、光热检测、催化显色检测方法进行多模式结合检测;
所述试纸条的制备方法包括:
制备免疫‑PB@Au复合物;将病原体抗体与PB@Au一起孵育,使PB@Au纳米复合材料和病原体抗体结合,得到免疫‑PB@Au复合物;
构建免疫渗滤试纸条;将病原体抗体滴加于NCM上,使NCM成功包被上病原体抗体,得到病原体抗体包被的试纸条;
所述直接视觉检测的方法为:
将免疫‑PB@Au复合物与含有病原体的样品混合,放置在37℃下10分钟;然后,在抗体包被区上滴加上述混合物,在37℃孵育10分钟;最后,用超纯水清洗NCM,干燥后观察抗体包被区形成的颜色;
所述光热检测的方法为:
使用激光照射NCM上的免疫‑PB@Au复合物,检测温度变化;
所述催化显色检测的方法为:
将2mg DAB溶解在PBS中作为显色底物,使用时添加H2O2,形成催化体系;然后,将催化体系滴到每个抗体包被区,在37℃下孵育10分钟;根据PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加,直接观察催化显色结果。
2.如权利要求1所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述PB@Au纳米复合材料的制备方法为:将PB纳米颗粒溶液与HAuCl4溶液混合,然后在沸腾条件下添加柠檬酸三钠溶液,在PB纳米颗粒的表面负载由柠檬酸三钠还原氯金酸而形成的Au纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述PB纳米颗粒溶液的浓度为‑1
0.5‑1.5mg·mL ,所述HAuCl4溶液的浓度为0.01‑0.02%w/v。
4.如权利要求2所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述PB纳米颗粒溶液与HAuCl4溶液的体积比为0.5:4‑16。
5.如权利要求2所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述PB纳米颗粒溶液与HAuCl4溶液混合后加热至沸腾3‑5分钟再添加柠檬酸三钠;
所述柠檬酸三钠的浓度为0.5‑1.5%w/v;柠檬酸三钠与PB纳米颗粒溶液的体积比为
500:85‑340;
添加柠檬酸三钠后,持续煮沸3‑5分钟,然后冷却、离心,即得PB@Au纳米复合材料。
6.如权利要求1所述的检测病原体的方法,其特征在于:直接视觉检测的方法中,免疫‑PB@Au复合物与鼠伤寒沙门氏菌以1:1的体积比混合。
7.如权利要求1所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述光热检测的方法中,激光的参数为:2W、100s、808nm。
8.如权利要求1所述的检测病原体的方法,其特征在于:所述催化显色检测的方法中,‑1
PBS的添加量为3mL,pH为6.5,浓度为0.01moL·L 。
说明书 :
PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
术。
温扩增反应(LAMP)。与耗时费力的传统平板培养方法相比,快速检测方法虽然缩短了检测
时间,但仍存在检测条件严格、灵敏度与准确性低等缺点。因此,需要建立一种灵敏、准确、
便捷的检测方法来预防和控制病原体的暴发。
受到其低灵敏度和准确性的限制。为了提高ICT的灵敏度,采用了具有催化和光热性能的新
型标记纳米材料来产生信号放大;为了提高ICT的准确性,多模式检测被用于验证检测结
果。然而,这些纳米材料仍面临着制备时间长、合成工艺复杂、成本高等缺点,限制了其进一
步的应用。因此,寻找一种性能优良、易于合成的新型纳米材料来产生和放大检测信号是十
分必要的。
已广泛应用于生物/化学传感的研究,如在水溶液中检测过氧化氢、葡萄糖和L‑乳酸。利用
PB的类过氧化物酶活性,将其应用于侧流免疫试纸条中,提高了检测灵敏度,但存在单一颜
色梯度缺乏视觉冲击力和颜色标准的问题,同时无法实现目标物定量,难以对病原体进行
灵敏、准确的检测。
发明内容
的光热和催化性能,提高检测的灵敏度和准确度。本发明利用PB和催化产物的颜色叠加,在
提高检测灵敏度的同时产生色系变化指示结果,催化显色产生的颜色叠加程度能更清楚地
显示病原体的感染剂量,从而达到及时防控的目的。本发明还通过直接视觉检测、光热检测
和催化显色检测进行多模式检测的相互验证,进一步提高检测结果的准确性,建立一种灵
敏、准确的病原体免疫渗滤试纸条定量检测方法。
物。
对目标物的检测。此外,病原体的爆发风险量可以通过催化颜色叠加更直观地展示出来。
过程可在30分钟内完成。该方法还成功应用于实际样品中病原体的检测,证明了其具有良
好的实用性。
附图说明
测、光热检测和催化显色检测。
后,PB、PB@Au 1、PB@Au 2、PB@Au 3、PB@Au 4和PB@Au 5对应的照片和紫外可见吸收光谱;
−1
(D)用H2SO(4 4 moL·L )终止催化显色反应后,不同纳米材料在460 nm处的吸光度值。
Au复合物的水动力学直径;(F)PB的XPS全谱;(G)PB@Au的XPS全谱;(H)PB@Au中的Au元素的
XPS窄谱。
化酶活性的双倒数曲线。
数量。
检测牛奶、自来水和酱油等食品中添加的鼠伤寒沙门氏菌来进行实际应用评估。
具体实施方式
理解的相同含义。
也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
进行灵敏、准确的检测。
PB纳米颗粒的表面上。
定性和抗体连接率,并在试纸上实现催化颜色叠加,提高检测灵敏度。而且,金纳米粒子具
有优异的光热效应,有助于建立快速检测方法,且检测信号得到放大。
和准确性。
点,最后通过离心得到免疫‑PB@Au复合物;
纸条。
热检测的检测限为10 CFU·mL ,催化显色后,当鼠伤寒沙门氏菌数量为10 CFU·mL 时
出现颜色,表现出高于直接视觉检测的灵敏度,蓝绿色PB@Au和棕黄色oxDAB的颜色叠加可
5 −1 5 −1
以形成多重颜色,在10 CFU·mL 以下,免疫渗滤试纸条呈现红色系,在10 CFU·mL 以上
则变成蓝色系。光热检测限与催化显色检测限一致,可实现鼠伤寒沙门氏菌的定量和灵敏
测定。
μL)被快速添加到混合溶液中,并持续煮沸3分钟。在PB NPs的表面形成由柠檬酸三钠还原
氯金酸而形成的Au NPs。冷却后,溶液在4℃下11000 g离心30分钟,沉淀用超纯水重新溶解
到所需的浓度。为了获得具有最佳催化和光热特性的PB@Au纳米复合材料,优化了HAuCl4的
量。
(25 μL,8% w/v)并继续孵育60分钟以封闭多余位点。最后,将免疫‑PB@Au复合物于10000 g
离心处理6分钟,沉淀用超纯水重新溶解到所需的浓度。
(1 μL,0.4 mg·mL )滴在NCM上,37℃下反应30分钟,以成功包被鼠伤寒沙门氏菌抗体。将
BSA(20 μL,4% w/v)滴在NCM上,37℃保持30分钟,以封闭多余的活性位点。最后,用超纯水
清洗NCM,然后在使用前放置在4℃。
在实际样品检测中,1 mL的无菌自来水、牛奶和酱油分别加入不同数量的鼠伤寒沙门氏菌
3 5 7 −1
(10、10、10 CFU·mL ),在37℃放置10分钟。6000 g离心5分钟后,沉淀被收集,用PBS清洗
并重悬。所有含有细菌的溶液和材料在丢弃前在高压灭菌锅(121℃,20分钟)中灭菌。
干燥后观察抗体包被区形成的颜色。不含鼠伤寒沙门氏菌的样本被设定为阴性对照。
PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加,直接观察催化显色结果。
材料,检测原理和步骤如图1所示。首先,通过柠檬酸三钠还原HAuCl4在PB上形成Au NPs,以
制备PB@Au纳米复合材料。然后,在PB@Au上固定鼠伤寒沙门氏菌抗体,以构建免疫‑PB@Au复
合物(图1A)。活化后的NCM包被上鼠伤寒沙门氏菌抗体,然后使用BSA封闭,最终构建免疫渗
滤试纸条(图1B)。图1C显示鼠伤寒沙门氏菌检测的双抗夹心免疫测定原理。含有鼠伤寒沙
门氏菌的样品溶液与免疫‑PB@Au复合物混合孵育,然后将混合物滴到NCM的抗体包被区,通
过特异性识别形成抗体‑细菌‑抗体复合物。图1D是针对鼠伤寒沙门氏菌的多模式检测。对
于直接视觉检测,获得免疫‑PB@Au复合物固有的蓝色,用于鼠伤寒沙门氏菌的分析。对于光
热检测,获得PB@Au的ΔT用于根据标准曲线计算鼠伤寒沙门氏菌的数量。对于催化显色检
测,通过PB@Au的类过氧化酶活性,催化显色底物DAB,产生由PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加
得到的多重颜色,提高检测灵敏度和指示鼠伤寒沙门氏菌爆发数量。通过多模式检测的相
互验证,提高了实验结果的准确性。
区域具有出色的光吸收和光热转换特性。PB NPs溶液(1 mg·mL ,0.5 mL)与HAuCl4溶液
(0.01% w/v,4,6,8,12,16 mL)混合,即PB@Au 1‑5。对PB@Au1‑5的光吸收和光热转换特性进
行了表征和比较。随着HAuCl4的增加,溶液的颜色从深蓝色变化到浅蓝色,然后到浅黄色。
在紫外可见吸收光谱(图2A)中观察到PB NPs的最大吸收峰约720 nm,这是PB NPs的特征
峰。与PB NPs相比,连接Au NPs后,PB@Au的最大吸收峰值明显下降。然而,由于长时间高温
加热导致PB NPs热解使最大吸收峰值的位置发生蓝移。PB@Au 4和PB@Au 5没有明显的吸收
峰值,因为溶液主要包括HAuCl4。
用,提高光热效应。在一系列纳米材料中,PB@Au 2具有最佳的光热转换特性。
−1
黄色,再到浅黄色(4 moL·L )。紫外可见吸收光谱(图2C)显示,所有溶液在催化显色后都
在460 nm处有最大吸收峰,PB@Au 2的吸光度值是最大的(如图2D所示),这表明它产生的
oxDAB最多。由于Au和PB NPs之间表面积增大和协同效应,PB@Au 2的类过氧化物酶活性增
强,所以它被选中用于后续的实验。
态是大约200 nm大小的圆角纳米长方体。图3B显示,PB@Au纳米复合材料已成功制备,PB表
面均匀负载上直径约15 nm的球形Au NPs。
体。PB、PB@Au和免疫‑PB@Au复合物的Zeta电位的绝对值超过30 mV,这表明这些纳米材料具
有良好的稳定性,可以在液态溶液中均匀分布(图3D)。PB NPs的平均Zeta电位为‑33.4 mV,
这表明其表面存在负电荷。PB@Au的zeta电位为‑38.3 mV,这是由于负电荷增加,Au NPs表
面吸附大量柠檬酸根离子而带负电荷。免疫‑PB@Au复合物的Zeta电位绝对值为33.0 mV,低
于PB@Au的,因为当体系的pH值低于抗体的等电点时,抗体带正电荷。在图3E中,PB NPs的水
动力学尺寸为266.6 nm,为了在PB NPs表面形成 Au NPs而经过长时间高温加热后,PB@Au
的大小降至106.7 nm。因成功修饰上抗体,免疫‑PB@Au复合物的大小增加到379.8 nm。
4f7/2的结合能,这也表明PB@Au上的Au是单体形式,与TEM的结果一致。以上所有结果都证明
了PB@Au纳米复合材料制备成功。
收相关稳态温度:I是辐照电流:Aλ是808 nm波长处的吸光度值。
PB@Au具有更高的比表面积,因此其光热效应得到增强。
照射周期中的热循环性能,以表征PB@Au的光热稳定性。当PB@Au溶液被照射100 s(808 nm,
2 W)时,激光被关闭,然后自然冷却到室温后再次照射。照射过程重复4次。在激光照射过程
中,每10 s记录一次PB@Au溶液的温度。从图4B中可以看出,每个周期的最高温度基本相同。
热稳定性。由于PB结构稳定性高,PB@Au具有良好的光热稳定性,允许在光热分析方法中重
复使用PB@Au。
ΔT与PB@Au浓度的关系,R为0.99827(图4D)。结果表明,PB@Au的浓度是直接影响光热效应
的重要因素之一。
oxDAB的特征吸收峰。PB@Au纳米复合材料的催化特性由460 nm处的吸光度值决定。
到7.4,H2O2的体积(30%)从1.0到3.0 μL,反应时间从5到25分钟。在图5B‑D中,最佳催化条件
如下:pH 6.5,2.5 μL H2O(2 30%)反应时间为10分钟。在最佳条件下,通过改变催化系统中的
DAB(图5E),实现稳态动力学分析。结果表明,由PB@Au纳米复合材料催化的反应遵循了典型
的Michaelis‑Menten机制(图5F)。最大初始速度(Vmax)和米氏常数(Km)是以吸光度值的倒
‑6 −1
数为纵坐标计算的,分别为5.09 ×10 M·s 和6.821 mM。
选择100 s作为最佳照射时间,可以满足快速检测的要求。
封闭后的NCM与BSA封闭的免疫PB@Au复合材料(8%)孵育。结果在图7A中显示,在添加4% BSA
时,抗体包被区的颜色不可见,同时NCM的ΔT最低。因此,4% BSA是封闭NCM的最佳浓度。
溶液时,抗体包被区无颜色,此时的ΔT是所有这些浓度中最低的。因此,8%的BSA被选为封
闭免疫PB@Au复合材料上剩余活性位点的最佳浓度。
HCl(0.01 M)或NaOH(0.01 M)添加到PB@Au中,调节pH值从5.0到7.0。结果如图7C所示,随着
pH值从5.0增加到6.0,NCM抗体包被区形成的颜色逐渐变深。抗体包被区形成的颜色在6.5
时变得不明显,因为在中性或弱碱性溶液中,PB的稳定性较差。同样,6.0的ΔT在所有pH值
中是最高的。因此,免疫PB@Au复合材料的最佳构建pH值为6.0。
2、3、4、6、8 μL、0.2 mg·mL )。结果如图7D显示,随着抗体数量的增加,NCM上抗体包被区形
成的颜色逐渐明显。当抗体体积为6 μL时,NCM上抗体包被区形成的颜色清晰且较深。ΔT随
抗体数量增加而上升的趋势与视觉检测的一致。考虑到实验成本,我们选择了6 μL作为在
PB@Au上结合的抗体量。
量的鼠伤寒沙门氏菌来获得检测限。在图8A中,直接视觉检测的检测限为10 CFU·mL ,低
于该浓度时不可见。
)。在图8B中,ΔT和鼠伤寒沙门氏菌数量之间的关系呈现一个S形曲线。此外,在10‑10
−1 2
CFU·mL 之间存在良好的线性关系,R为0.9719,线性方程为y=1.4833x+0.6833。根据标准
1 −1
曲线计算得,鼠伤寒沙门氏菌光热检测的检测限为10 CFU·mL 。
oxDAB。催化显色后,当鼠伤寒沙门氏菌数量为10 CFU·mL 时出现颜色(图8A);因此,与直
接视觉检测相比,灵敏度成功得到了提高。蓝绿色PB@Au和棕黄色oxDAB的颜色叠加可以形
成多重颜色。随着细菌数量的增加,NCM上截留了更多的PB@Au,导致颜色梯度从浅红色到棕
5 −1 5 −1
红色,然后到蓝灰色。在10 CFU·mL 以下,免疫渗滤试纸条呈现红色系,在10 CFU·mL
5 −1
以上则变成蓝色系,而10 CFU·mL 恰好是鼠伤寒沙门氏菌引起的食源性疾病的感染剂
量。因此,它为预防和控制鼠伤寒沙门氏菌污染提供了基础。通过光热检测和催化显色检测
相互验证结果的准确性,实现该检测方法的实际应用。
选为非靶标菌(10 CFU·mL ),以超纯水为空白对照,鼠伤寒沙门氏菌为靶标菌(10
−1
CFU·mL )。从图8C中的照片中可以看出,只有添加鼠伤寒沙门氏菌的免疫渗滤试纸条有蓝
色,空白对照也没有颜色。添加鼠伤寒沙门氏菌的试纸条的ΔT高于其他添加非靶标菌的,
这强烈地显示了方法的特异性。
对鼠伤寒沙门氏菌(10 CFU·mL )进行测试,分析组内和组间变异性,组内和组间变异系
数分别为2.9%和4.4%,表明该方法的重复性符合快速检测方法的要求。
闭的试纸条在37℃恒温恒湿培养箱放置3天,然后取出用于检测鼠伤寒沙门氏菌(10
−1
CFU·mL )。与原始试纸条相比,储存3天的试纸条的ΔT降低幅度很小,仅为8.65%,这表明
抗体基本上保持原始活性,说明试纸条可以在4℃稳定地储存至少6个月。上述结果表明,包
被在NCM上的抗体在长期储存中仍具有良好的生物活性和稳定性。
3 5 7 −1
寒沙门氏菌感染剂量设定3个添加浓度,分别是10 ,10 和10 CFU·mL 。图8D的结果显示,
可接受的回收率从83.59%到109.60%不等。牛奶和酱油样品对应的回收率高于自来水的回
收率,这是由于样品中蛋白质、脂肪和其他分子干扰检测信号造成的。结果表明,该方法可
成功应用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。
捷,灵敏度好,不需要大型仪器。此外,所建立的方法采用直接视觉检测、光热检测和催化显
色检测,以提高检测结果的准确性。通过PB@Au与oxDAB的颜色叠加形成多重颜色,提高了检
测灵敏度和准确性。虽然在这些方法中,检测限不是最低的,但它可以满足鼠伤寒沙门氏菌
5 ‑1
感染剂量的检测要求(10 CFU·mL )。最后,该方法成功应用到实际样品中鼠伤寒沙门氏
菌的检测。
金纳米粒子 3小时 磷酸盐缓冲液和牛奶 103‑108 103 否 酶标仪
磁性纳米粒子 1.5小时 磷酸盐缓冲液和饮用水 300‑103 300 否 温度传感器
磁性纳米粒子 1.5小时 纯培养基和鸡肉 101‑105 1.6×101 否 智能手机APP
MoS2@Au纳米复25分钟 磷酸盐缓冲液,自来水,牛奶和102‑107 102 是 热像仪
合材料 葡萄汁
SiO2@MnO2纳米45分钟 纯培养基和牛奶 1.9×101‑1.9×105, 2.1×101‑ 19, 21 否 电化学工作站
复合材料 2.1×105
MoS2 30分钟 磷酸盐缓冲液,自来水和牛奶 102‑107 102 是 热像仪
金纳米粒子 10分钟 磷酸盐吐温缓冲液和牛奶 1.25×105‑2×106 1.25×105, 否 无
1.25×106
PB@Au纳米复合30分钟 磷酸盐缓冲液,自来水,牛奶和101‑105 101 是 热像仪
材料 酱油
1 −1 2 −1
检测的灵敏度(10 CFU·mL )比直接视觉检测提高一个数量级(10 CFU·mL ),并且方便
的催化颜色叠加检测有助于及时预防和控制鼠伤寒沙门氏菌的爆发。通过直接视觉检测、
光热检测和催化显色检测,可以相互验证检测结果的准确性。本发明评估了方法的特异性、
可重复性、稳定性和适用性,结果表明,基质对检测效率几乎没有影响。因此,这一方法有潜
力通过替换特异性抗体来检测其他病原体。
改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。