吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺病药物中的应用

摘要

本发明提供一种化合物吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺疾病药物中的新应用。经动物实验证明，本发明所述的化合物吲哚乙酸在动物水平上能够明显抑制慢性阻塞性肺疾病肺部炎性细胞浸润、抑制慢性阻塞性肺疾病炎症因子产生和肺部细胞凋亡，抑制与肺部细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase‑3表达，显著改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺功能，降低慢性阻塞性肺疾病肺部嗜中性粒细胞比例，可用于制备防治慢性阻塞性肺疾病相关药物。

权利要求

1.化合物吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，所述化合物吲哚乙酸为式（Ⅰ）所示的化合物或药学上可接受的盐（Ⅰ）；

所述慢性阻塞性肺疾病为嗜中性粒细胞炎症相关性慢性阻塞性肺疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物吲哚乙酸能够改善慢性阻塞性肺疾病的肺功能。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物吲哚乙酸能够抑制慢性阻塞性肺疾病肺部炎性细胞浸润。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物吲哚乙酸能够抑制慢性阻塞性肺疾病炎症因子产生；所述慢性阻塞性肺疾病炎症因子包括TNF‑α、IL‑1β和IL‑17A。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物吲哚乙酸能够降低慢性阻塞性肺疾病肺组织中的凋亡细胞比例，抑制与肺部细胞凋亡相关蛋白的表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述与肺部细胞凋亡相关蛋白包括cleaved caspase‑3。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物吲哚乙酸能够降低慢性阻塞性肺疾病肺部嗜中性粒细胞的比例。

说明书

吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，特别是涉及吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺病药物中的应用。

背景技术

[0002] 慢性阻塞性肺疾病是一种以持续气流阻塞、慢性支气管炎和(或)肺气肿为特征的复杂异质性肺部疾病，是全球发病率和死亡率较高的常见疾病之一，与机体对于有害气体
或有害微粒的异常炎症反应相关。目前慢性阻塞性肺疾病是我国第四大死亡原因，严重损
害人类健康，是一个重要的公共卫生问题。

[0003] 吲哚乙酸最初是于1928年由Frits Warmolt Went在植物中发现，是植物中最常见的生长素。然而，越来越多的研究也表明许多微生物也能够产生吲哚乙酸，如农杆菌、固氮
螺旋体、芽孢杆菌、肠杆菌等。哺乳动物细胞中也存在内源性的吲哚乙酸，可能由色氨酸的
脱羧作用或色氨酸的氧化脱氨作用产生。哺乳动物体内还存在外源性的吲哚乙酸，通常由
哺乳动物肠道中的微生物产生。目前的研究表明，吲哚乙酸对二乙基亚硝胺诱导的肝癌小
鼠具有保护作用，在非酒精性脂肪肝小鼠模型中能够缓解肝脏的氧化应激以及炎症反应。
然而关于吲哚乙酸在慢性阻塞性肺疾病及相关的呼吸道疾病中作用目前还没有报道过。

发明内容

[0004] 鉴于以上所述现有技术的不足，本发明提供一种吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺疾病药物中的新应用。

[0005] 化合物吲哚乙酸在制备防治慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，所述化合物吲哚乙酸为式(Ⅰ)所示的化合物或所示化合物的水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐，
如式(II)所示的吲哚乙酸钠盐。

[0006]

[0007] 化合物吲哚乙酸在制备防治以嗜中性粒细胞炎症为主的慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

[0008] 吲哚乙酸是无色结晶粉末，分子式为C10H9NO2，分子量为175.187，熔点为164‑165℃，微溶于水，可溶于极性有机溶剂。在光和空气中易分解，不耐贮存。其水溶液能被紫外光
分解，但对可见光稳定。对人、畜安全。

[0009] 本发明中，所述化合物吲哚乙酸能够明显改善慢性阻塞性肺疾病的肺功能。

[0010] 本发明中，所述化合物吲哚乙酸能够明显抑制慢性阻塞性肺疾病肺部炎性细胞浸润。

[0011] 本发明中，所述化合物吲哚乙酸能够明显抑制慢性阻塞性肺疾病炎症因子产生。所述慢性阻塞性肺疾病炎症因子包括但不限于TNF‑α、IL‑1β和IL‑17A。

[0012] 本发明中，所述化合物述吲哚乙酸能够明显降低慢性阻塞性肺疾病肺组织中的凋亡细胞比例，抑制与肺部细胞凋亡相关蛋白的表达。所述与肺部细胞凋亡相关蛋白包括但
不限于cleaved caspase‑3。所述cleaved caspase‑3被认为是最重要的凋亡执行者，一旦
激活，细胞凋亡的发生将不可逆转。

[0013] 本发明中，所述化合物述吲哚乙酸能够明显降低慢性阻塞性肺疾病肺部嗜中性粒细胞的比例。因而，化合物吲哚乙酸可以应用于制备防治嗜中性粒细胞炎症相关性慢性阻
塞性肺疾病，特别是与嗜中性粒细胞炎症相关的支气管炎症型慢性阻塞性肺疾病药物。

[0014] 一种药物组合物，包括所述吲哚乙酸化合物及药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或它们的组合物。

[0015] 所述的化合物吲哚乙酸或所述的药物组合物在药物制备中的应用，其中，所述药物用于预防、治疗或减轻慢性阻塞性肺疾病。

[0016] 进一步地，本发明所述慢性阻塞性肺疾病包括但不限于气道炎症、肺气肿，肺通气损伤，和由此引发的呼吸及危重症。本发明中，所述的慢性阻塞性肺疾病是指一种以气流受
限为特征的疾病，临床特征包括呼气气流减少、肺用力排空缓慢，气喘，咳嗽和咯痰，并伴有
慢性气道阻塞及肺部过度膨胀，发病时常同时出现慢性阻塞性支气管炎和阻塞性肺气肿。

[0017] 临床数据表明，吲哚乙酸在慢性阻塞性肺疾病病人的痰液中显著降低，与慢性阻塞性肺疾病的发生发展过程密切相关。本发明通过制备慢性阻塞性肺疾病小鼠模型，并采
取吲哚乙酸干预，通过对小鼠肺功能指标、炎症因子、炎症细胞浸润情况、肺部细胞凋亡比
例、肺部细胞凋亡蛋白cleaved caspase‑3相对表达量、肺部嗜中性粒细胞的比例进行检测
及统计分析，发现吲哚乙酸干预能够改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺功能，抑制慢性
阻塞性肺疾病炎症因子产生，抑制炎症细胞浸润，降低肺部细胞凋亡比例，抑制与细胞凋亡
相关蛋白的表达、降低肺部嗜中性粒细胞比例。

[0018] 本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0019] 1、经动物实验表明，本发明所述的化合物吲哚乙酸在动物水平上能够明显抑制慢性阻塞性肺疾病肺部炎症细胞浸润、炎症因子产生和肺部细胞凋亡，改善慢性阻塞性肺疾
病模型小鼠肺功能，降低慢性阻塞性肺疾病肺部嗜中性粒细胞比例，可用于防治慢性阻塞
性肺疾病。

[0020] 2、本发明所述化合物吲哚乙酸制备方法简单，性质稳定，使用安全，易于控制，便于临床应用推广。

附图说明

[0021] 图1为吲哚乙酸改善慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的肺功能指标FEV100/FVC的结果图。数据采用t检验分析，ns表示两组时间无统计学差异；*表示两组之间具有统计学差异，p
<0.05。

[0022] 图2为吲哚乙酸抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺泡灌洗液的炎症因子产生的ELISA结果图。数据采用t检验分析，ns表示两组时间无统计学差异；*表示两组之间具有统
计学差异，p<0.05；**表示两组之间具有统计学差异，p<0.01。

[0023] 图3为吲哚乙酸抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的肺部炎症细胞浸润的病理结果图；其中，A图为Control组肺组织形态学变化的HE染色图代表图；B图为IAA组肺组织形态学
变化的HE染色图代表图；C图为COPD组肺组织形态学变化的HE染色图代表图；D图为COPD+
IAA组肺组织形态学变化的HE染色图代表图，图片标尺为400μm。

[0024] 图4为吲哚乙酸抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的肺部炎症细胞浸润的各组肺组织形态学变化的HE染色图中的炎症细胞浸润程度的评分结果统计。数据采用t检验分析，ns
表示两组时间无统计学差异；*表示两组之间具有统计学差异，p<0.05；**表示两组之间具
有统计学差异，p<0.01；***表示两组之间具有统计学差异，p<0.001。

[0025] 图5为吲哚乙酸减少慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺部凋亡细胞比例结果图。数据采用t检验分析，ns表示两组之间无统计学差异；*表示两组之间具有统计学差异，p<0.05。

[0026] 图6为吲哚乙酸抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺部细胞凋亡蛋白cleaved caspase‑3的蛋白免疫印迹(Western blot)结果图和统计；其中，A图为各组的凋亡蛋白
cleaved caspase‑3以及内参蛋白β‑actin的免疫印迹代表图，B图为各组免疫印迹条带灰
度值的统计结果。数据采用t检验分析，ns表示两组时间无统计学差异；*表示两组之间具有
统计学差异，p<0.05；**表示两组之间具有统计学差异，p<0.01。

[0027] 图7为吲哚乙酸降低慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺部嗜中性粒细胞比例结果图。数据采用t检验分析，ns表示两组之间无统计学差异；***表示两组之间具有统计学差异，p<
0.001。

具体实施方式

[0028] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0029] 实施例1：制备慢性阻塞性肺疾病小鼠模型及吲哚乙酸干预

[0030] 1、制备COPD小鼠模型：

[0031] 选取6‑8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重18‑25g，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司。将小鼠随机分成4组，分别为对照组(Control组)，吲哚乙酸组(IAA组)，模型组(COPD
组)，模型加吲哚乙酸组(COPD+IAA组)。从实验开始的第一天，将7μg脂多糖(LPS)+1.2U弹性
胰蛋白酶(Elastase)(溶于100μLPBS)通过滴鼻的方式滴进COPD组和COPD+IAA组每只小鼠
的肺部，每周滴一次，连续滴4周，Control组和IAA组则以相同的方法滴PBS。

[0032] 2、吲哚乙酸干预：

[0033] 使用适量1mol/L的氢氧化钠使吲哚乙酸粉末完全溶解，加入0.25mol/L的氯化氢将溶液PH调至7.4，加入PBS将浓度稀释至5mg/mL，避光‑20℃保存。从实验开始的第一天，
IAA组和COPD+IAA组通过腹腔注射将吲哚乙酸(剂量5mg/mL,体积200μL)注射进入小鼠体
内，每天注射一次，连续注射4周，同时Control组和COPD组以相同的方法注射PBS。连续干预
4周后，进行后续相关指标检测。

[0034] 实施例2：吲哚乙酸改善慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的肺功能

[0035] 1、肺功能检测：

[0036] 将完成模型制备和IAA干预的模型组和非模型组小鼠进行肺功能检测，使用三溴乙醇对小鼠进行麻醉，使用已消毒的手术器械将小鼠气管暴露，通过实验动物肺功能检测
系统(美国DSI公司)对小鼠肺功能指标FEV100和FVC指标进行检测读取，计算FEV100/FVC比
值。完成肺功能检测后进行后续其他指标的检测。

[0037] 2、实验结果：

[0038] 如图1所示，COPD组与Control组相比，COPD组FEV100/FVC显著下降(p<0.05)，而COPD+IAA组与COPD组相比前者FEV100/FVC显著上升(p<0.05)，IAA组与Control组相比无显
著差异。实验结果表明，慢性阻塞性肺疾病会导致小鼠肺功能下降，注射吲哚乙酸对慢性阻
塞性肺疾病小鼠的肺功能具有保护作用，同时吲哚乙酸不会对正常小鼠的肺功能有明显的
影响。

[0039] 实施例3：吲哚乙酸能够抑制慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺部炎症因子产生

[0040] 1、肺泡灌洗液上清液获取：

[0041] 将完成肺功能检测的小鼠进行肺泡灌洗获取肺泡灌洗液，使用已消毒的20G的PE针头插入已暴露的气管，用手术线将PE针头固定。用1mL无菌注射器取0.8mL冰上预冷的磷
酸盐缓冲液(PBS)，连接已固定好的PE针头对小鼠肺部进行灌洗，轻轻来回灌洗三次，得到
肺泡灌洗液。在5000g，4℃的条件下将肺泡灌洗液离心10min，取上清液转移至新的离心管
做后续检测，细胞沉淀留做肺泡灌洗液涂片和HE染色。

[0042] 2、ELISA检测炎症因子：

[0043] 分别使用TNF‑α、IL‑1β和IL‑17A的ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)对肺泡灌洗液上清液进行检测。分别向已包被相应抗体的微孔中加入50μL肺泡灌洗液上清
液、不同浓度的标准品和样品稀释液，每孔再加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测
抗体，使用封板膜将孔封住，37℃下孵育1h。将孔中的液体倒出，在吸水纸上拍干，每孔加入
350μL洗涤液，静置1min后甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤5次。每孔各加入50μL的
底物A和50μL的底物B，37℃下避光孵育15min。每孔加入50μL的终止液，使用多功能酶标仪
(美国PerkinElmer公司)在450nm波长处读取OD值，绘制标准曲线并计算各个样品的炎症因
子浓度。

[0044] 3、实验结果：

[0045] 如图2所示，小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的ELISA结果显示，COPD组与Control组相比，COPD组小鼠肺泡灌洗液中的炎症因子(TNF‑α、IL‑1β和IL‑17A)水平显著上升，COPD+IAA
组与COPD组相比前者炎症因子水平显著下降，而IAA组与Control组相比无显著差异。实验
结果表明，慢性阻塞性肺疾病会导致小鼠肺部炎症因子水平上升，注射吲哚乙酸能够抑制
慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部炎症因子的上升情况，而对正常小鼠无明显影响。

[0046] 实施例4：吲哚乙酸能够缓解慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺部炎症细胞浸润

[0047] 1、肺组织病理石蜡切片制作：

[0048] (1)组织固定：将完成肺功能检测的小鼠部分新鲜肺组织分离出来，浸泡于4％多聚甲醛固定液中固定24h。

[0049] (2)脱水：按照以下程序进行脱水：75％酒精3h、85％酒精2h、95％酒精1h、95％酒精2h、无水乙醇1h、无水乙醇1h、环保透明剂1h、环保透明剂1h、融化石蜡2h、融化石蜡2h。

[0050] (3)包埋：在石蜡切片包埋机上进行包埋。

[0051] (4)切片：在石蜡切片机上进行切片，厚度为4μm。

[0052] 2、HE染色

[0053] 将石蜡切片放入环保透明剂10min、环保透明剂10min、环保透明剂10min、无水乙醇5min、95％酒精5min、75％酒精5min，自来水冲洗干净。苏木素染色5min，自来水冲洗，1％
的盐酸酒精分化10s，自来水冲洗干净。伊红染色2s，95％乙醇1min，无水乙醇1min，环保透
明剂1min，环保透明剂1min。使用中性树脂对HE染色切片进行封片。

[0054] 4、拍照

[0055] 将制成的HE切片置于EVOS fl auto全自动荧光倒置显微镜(美国Thermo fisher公司)下，选择10X的放大倍数，每张切片随机选取10个视野进行拍摄。

[0056] 5、评分

[0057] 对每个视野的炎症细胞浸润情况进行评分，具体评分细则为：当支气管周围不存在炎症细胞时为0分，当支气管周围存在少量炎症细胞时为1分，当支气管周围存在1层炎症
细胞时为2分，当支气管周围存在2‑4层细胞时为3分，当支气管周围存在5层或以上的炎症
细胞时为4分。计算平均值作为每张HE切片的最终得分。

[0058] 6、实验结果

[0059] 如图3和图4所示，肺组织HE染色及评分结果显示，COPD组与Control组相比，COPD组小鼠肺组织支气管周围炎症细胞浸润程度显著增加(p<0.001)，COPD+IAA组与COPD相比
前者上述情况显著下降(p<0.05)，而IAA组与Control组相比无显著差异。实验结果表明，慢
性阻塞性肺疾病会导致小鼠肺部炎症细胞浸润加重，注射吲哚乙酸能够缓解慢性阻塞性肺
疾病小鼠肺组织中炎症细胞浸润，而对正常小鼠无明显影响。

[0060] 实施例5：吲哚乙酸能够抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部细胞凋亡

[0061] 1、Tunel染色：

[0062] 将石蜡切片放入环保透明剂10min、环保透明剂10min、环保透明剂10min、无水乙醇5min、95％酒精5min、75％酒精5min，自来水冲洗干净。使用0.1％TritonX‑100，0.1％柠
檬酸钠室温滴加通透8min。用TBS洗3次，每次5min。每张切片滴加3％BSA与20％正常小牛血
清的混合液封闭非特异性反应，室温30min。甩去血清，每张切片滴加50ul Tunel反应混合
液(A液：B液＝1:9)混匀，避光在湿盒中孵育60min，37℃，阴性对照用TBS代替工作液。完成
后TBS洗3次，每次5min。DAPI染核，避光室温10min。抗荧光衰减封片剂封片。

[0063] 2、拍照：

[0064] 将制成的Tunel切片置于荧光显微镜(德国Leica公司)下，选择40X的放大倍数，每张切片随机选取10个视野，拍摄蓝绿两种荧光，绿光为凋亡细胞，蓝光为总细胞。

[0065] 3、计算统计：

[0066] 使用Image J软件对拍摄的图片进行细胞计数，以凋亡细胞数和总细胞数的比值作为细胞凋亡率。

[0067] 4、实验结果：

[0068] 如图5所示，肺组织Tunel染色统计结果显示，COPD组与Control组相比，COPD组小鼠肺组织发生凋亡的细胞的比例显著增加(p<0.05)，COPD+IAA组与COPD相比前者上述情况
显著下降(p<0.05)，而IAA组与Control组相比无显著差异。实验结果表明，慢性阻塞性肺疾
病会使小鼠肺部凋亡细胞比例增加，注射吲哚乙酸能够减少慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部凋
亡细胞的比例，而对正常小鼠无明显影响。

[0069] 实施例6：吲哚乙酸能够抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部细胞凋亡蛋白cleaved caspase‑3的产生

[0070] 1、蛋白提取：

[0071] 取50mg肺组织置于2mL含研磨珠的研磨管中，加入0.5mL RIPA裂解液及5μL蛋白酶抑制剂，放置于快速样品制备仪(美国MP公司)中充分振荡研磨，将研磨后的匀浆液转移至
新的1.5mL离心管，12000rpm，4℃离心15min，吸取上清液转移至另一新的1.5mL离心管，根
据BCA蛋白定量试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)说明书进行蛋白质浓度定量，加入PBS
和loading buffer将样品稀释至1μg/μL，并在98℃下加热10min使蛋白充分变性。

[0072] 2、Western blot检测cleaved caspase‑3的相对表达量：

[0073] (1)12％分离胶配制：分别取3.4mL蒸馏水、4.0mL30％Acr‑Bis(29:1)、2.5mL4×Tris‑HCl‑SDS分离胶缓冲液(pH 8.8)、0.1mL 10％过硫酸铵溶液和0.004mL TEMED充分混
匀，倒入制胶装置。

[0074] (2)3.5％浓缩胶配制：待分离胶凝固，分别取2.28mL蒸馏水、0.68mL30％Acr‑Bis(29:1)、1.0mL 4×Tris‑HCl‑SDS分离胶缓冲液(pH 6.8)、0.04mL 10％过硫酸铵溶液和
0.004mL TEMED充分混匀，倒入制胶装置，插入15孔的梳子。

[0075] (2)上样：待浓缩胶凝固，将胶安装到电泳槽中，倒入电泳液，轻轻将梳子拔出。按顺序进行上样，上样量分别为蛋白marker 5μL，样品10μL。

[0076] (3)电泳：当样品位于浓缩胶时将电压调至80V的恒压，当样品移动至分离胶时将电压调至120V的恒压，当marker充分分开时停止。

[0077] (4)转膜：将完成电泳的SDS‑PAGE胶取出，用转膜专用夹子和滤纸将胶与浸泡过甲醇的PVDF膜夹紧转移至装满转膜液的转膜槽，恒流300mA转膜60min。

[0078] (5)封闭：将完成转膜的PVDF膜取下，在蒸馏水转浸泡10s，通过蛋白Marker切出目的条带，加入新鲜配制的5％脱脂牛奶封闭1h。

[0079] (6)一抗孵育：完成封闭的PVDF膜用1x TBST缓冲液洗3次后，对应加入cleaved caspase‑3抗体(稀释倍数为1:1000)和β‑actin抗体(稀释倍数为1:1000)，置于4℃下的摇
床孵育过夜。

[0080] (7)二抗孵育：完成一抗孵育的PVDF膜使用1x TBST缓冲液洗3次后，加入山羊抗兔二抗(稀释倍数为1:5000),室温下孵育1h。

[0081] (8)发光成像：完成二抗孵育的PVDF膜使用1x TBST缓冲液洗3次后，使用化学发光液在荧光化学成像系统(美国Bio‑rad公司)下，对PVDF膜上的蛋白进行成像拍照。

[0082] (9)统计：使用Image J软件对图片进行灰度值计算，并统计。

[0083] 3、实验结果

[0084] 图6中A图和B图结果显示，COPD组与Control组对比，肺组织中cleaved caspase‑3的表达显著上升，COPD+IAA组与COPD组相比cleaved caspase‑3的表达显著下降，而IAA组
与Control组相比无显著差异。实验结果表明，慢性阻塞性肺疾病会促进小鼠肺部细胞凋亡
相关蛋白的表达，注射吲哚乙酸能够明显抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部细胞凋亡相关蛋
白的表达，而对正常小鼠无明显影响。

[0085] 实施例7：吲哚乙酸能够降低慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部嗜中性粒细胞的比例

[0086] 1.肺泡灌洗液涂片

[0087] 将实施例3中获得的肺泡灌洗液细胞沉淀，加入400μL的PBS重悬，使用牛鲍氏白细胞计数板进行细胞计数，计算出每管的细胞总数。2500r/s离心7min，倒掉上清，使用20μL的
PBS进行重悬，使用移液器将细胞悬液均匀涂抹到载玻片上，自然风干之后置于10％的中性
甲醛固定15min，用清水洗去中性甲醛后进行HE染色。

[0088] 2.HE染色

[0089] 将载玻片进行染色，染色步骤如下：苏木素60s，流水冲洗，盐酸酒精分化10s，流水冲洗，碳酸锂反蓝20s，流水冲洗，伊红染色10s，流水冲洗。将玻片置于烤片机中烤干，使用
中性树脂进行封片。

[0090] 3.镜检

[0091] 使用光学显微镜对200‑400个白细胞进行分类，计算出嗜中性粒细胞所占的比例。

[0092] 4.实验结果

[0093] 图7结果显示，COPD组与Control组对比，肺组织中嗜中性粒细胞的比例显著上升，COPD+IAA组与COPD组相比嗜中性粒细胞的比例显著下降，而IAA组与Control组相比无显著
差异。实验结果表明，慢性阻塞性肺疾病会促进小鼠肺部嗜中性粒细胞的比例升高，注射吲
哚乙酸能够明显降低慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部嗜中性粒细胞的比例，而对正常小鼠无明
显影响。

[0094] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完
成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。