一种负载THC的干细胞载药系统及其制备方法

摘要

本发明提供了一种负载四氢姜黄素的干细胞的制备方法：首先分离培养获得间充质干细胞；然后按照浓度梯度‑温度梯度递增顺序将四氢姜黄素和间充质干细胞混合然后保温孵育；然后洗涤、消化、重悬获得干细胞悬液，即负载四氢姜黄素的干细胞。本发明通过采用药物浓度梯度以及孵育温度梯度的改变，增加THC的细胞负载效率，获得高负载率的的THC干细胞载药系统。本发明还通过超滤管离心的方法收集外囊泡包裹的THC的浓缩液，相比较于外泌体的制备流程，更为简便，且起到更好功效。

权利要求

1.一种负载四氢姜黄素的干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）分离培养获得间充质干细胞；

（2）按照浓度梯度递增顺序将四氢姜黄素和间充质干细胞混合然后保温孵育；

（3）将步骤（2）的干细胞洗涤后消化、重悬获得负载四氢姜黄素的干细胞悬液；

步骤（2）中，所述浓度梯度数量为3个；所述四氢姜黄素的浓度为10 μg/mL时，孵育温度为25℃，孵育时间为5 min；所述四氢姜黄素的浓度为30 μg/mL时，孵育温度为39 ℃，孵育时间为10 min；所述四氢姜黄素的浓度为50 μg/mL时，混合温度为37℃，孵育温度为37℃，孵育时间为24 h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述间充质干细胞流式细胞术检测的CD44、CD73、CD90、CD105均不低于95%，CD34、CD45、HLA‑DR均不高于2%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的来源选自脐血、脐带、骨髓、脂肪。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述脐带来源的间充质干细胞采用以下方法制备：

（i）新鲜脐带分离华通氏胶加入间充质干细胞培养基培养至第4天，然后每天半量换液培养至第7天，以不含EDTA的TrypLE™ Express消化后终止消化并离心洗涤细胞，重悬后以5

1×10个/mL密度传代；

（ii）传代后细胞每日全量换液，第3天传代一次；

5

（iii）以5×10个/mL浓度传代，37℃，5% CO2培养3天，传代。

5.一种如权利要求1‑4任一所述的制备方法获得的负载四氢姜黄素的干细胞。

6.一种如权利要求5所述的负载四氢姜黄素的干细胞制备负载THC的外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：将负载四氢姜黄素的干细胞培养一段时间，收集并纯化培养基，然后分离获得负载THC的外囊泡。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，外囊泡的分离采用旋转超滤方法：将纯化后的培养基加入30 KDa超滤管中，离心后所得浓缩液即为负载THC的外囊泡的悬液。

8.一种权利要求6或7所述的方法获得的负载THC的外囊泡。

说明书

一种负载THC的干细胞载药系统及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种负载四氢姜黄素的干细胞载药系统及其制备方法。

背景技术

[0002] 姜黄素（Curcumin，CUR）是从植物姜黄中提取的天然多酚物质，是传统医学的常规用药，并且几个世纪以来作为膳食的补充剂服用，安全可靠。姜黄素还具有较高的医药价
值，目前已被证明具有抗炎、抗氧化、消除氧自由基、保护肝脏、抗纤维化、抗肿瘤活性和防
止阿尔茨海默氏病等多种药理作用。然而姜黄素稳定性差（见光易分解）、水溶性差、生物利
用度低等缺点，限制了其应用。姜黄素在体内代谢后，其主要代谢产物为四氢姜黄素
（Tetrahydrocurcumin，THC），分子式为C21H26O6，分子量为372.2，密度1.222，熔点95℃‑97
℃。1978年，Holder等就已经证实了THC具有类似姜黄素的药理作用。THC，在结构上比姜黄
素少了不饱和C=C双键，因此缺少了发色团所需的共轭双键，所以外观颜色上，THC由姜黄素
的黄色变成白色粉末，且具有更高的稳定性。目前，THC已被发现在抗癌领域、抗氧化领域、
降脂、降糖领域具有良好的应用前景，且大量的实验结果表明，其生物活性均优于姜黄素。
目前，四氢姜黄素存在稳定性差,生物利用低等缺点，限制了其开发与应用。

[0003] 载药系统的选择除了安全性外，避免众多载体的临床转化面临着网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)或单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte 
system，MPS)的快速清除是另一个考虑点。纳米颗粒包裹药物系统，由于免疫原性问题，使
其使用受到限制。而细胞产生的外囊泡，作为内源性纳米载体，具有生物相容性好的明显优
势。细胞外囊泡作为药物载体，具有体积小、荷负电、避免吞噬、产生免疫逃逸、循环时间长、
穿透深层组织等优点。但是外泌体载体具有靶向性差等缺点。干细胞作为递药系统，因其低
免疫原性以及归巢性、旁分泌等特点，既可以起到干细胞的治疗作用，又可以携带外囊泡包
裹的药物抵达病灶处，同时实现药物运输与细胞治疗两大作用。目前，神经干细胞（NSCs）与
间充质干细胞（MSCs）已经被广泛地应用于抗肿瘤药物的传递研究中。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的问题，本发明提供一种负载THC的干细胞载药系统及其制备方法，克服干细胞单独用于疾病治疗药效不明确等缺点同时提高THC的稳定性且生物利用度
较高。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

[0006] 一种负载四氢姜黄素（THC）的干细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0007] （1）分离培养获得间充质干细胞；

[0008] （2）按照浓度梯度‑温度梯度递增顺序将四氢姜黄素和间充质干细胞混合然后保温孵育；

[0009] （3）将步骤（2）的干细胞洗涤后消化、重悬获得负载四氢姜黄素的干细胞悬液。

[0010] 步骤（1）中，所述间充质干细胞流式细胞术检测的CD44、CD73、CD90、CD105均不低于95%，CD34、CD45、HLA‑DR均不高于2%。优选的，所述间充质干细胞流式细胞术检测的CD44、
CD90、CD105、CD73不低于98%，CD34、HLA‑DR、CD45不高于0.3%。

[0011] 所述间充质干细胞来源不限，选自但不限于脐血、脐带、骨髓、脂肪。优选的，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。更优选的，所述脐带来源的间充质干细胞采用
以下方法制备：

[0012] （i）新鲜脐带分离华通氏胶加入间充质干细胞培养基培养至第4天，然后每天半量换液培养至第7天，以不含EDTA的TrypLE™ Express消化后终止消化并离心洗涤细胞，重悬
5
后以1×10个/mL密度传代；

[0013] （ii）传代后细胞每日全量换液，第3天传代一次；

[0014] （iii）以5×105个/mL 浓度传代，37℃，5% CO2培养3天，传代。

[0015] 步骤（2）中，所述四氢姜黄素的浓度为10‑100 μg/mL，孵育温度为25‑39℃；所述梯度溶液数量为3‑5个。优选的，步骤（2）中，所述梯度溶液数量为3个；所述四氢姜黄素的浓度
为10 μg/mL时，孵育温度为25℃，孵育时间为5 min；所述四氢姜黄素的浓度为30 μg/mL时，
孵育温度为39 ℃，孵育时间为10 min；所述四氢姜黄素的浓度为50 μg/mL时，孵育温度为
37℃，孵育时间为24 h。

[0016] 一种上述负载四氢姜黄素的干细胞，其四氢姜黄素的负载率为18%‑25%。

[0017] 上述负载四氢姜黄素的干细胞制备负载THC的细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：将负载四氢姜黄素的干细胞培养一段时间，收集并纯化培养基，然后分离获得外囊泡，即为
负载THC的细胞外囊泡。

[0018] 优选的，外囊泡的分离采用旋转超滤方法：将纯化后的培养基加入30 KDa超滤管中，离心后所得浓缩液即为负载THC的细胞外囊泡的悬液。

[0019] 所述离心条件为4500 rpm，4℃，离心2 h。

[0020] 一种上述方法获得的负载THC的细胞外囊泡，其四氢姜黄素的包裹率为18%‑28%。

[0021] 本发明具有以下优点：

[0022] 本发明的方法首先获得了高纯度的脐带间充质干细胞，能够长时间维持其表型并保持体外分化能力和增殖特性；通过采用药物浓度梯度以及孵育温度梯度的改变，增加THC
的细胞负载效率，获得高负载率的的THC干细胞载药系统。本发明还提供了获得干细胞外囊
泡包裹THC浓缩液的方法。外泌体的收集过程较为繁复，市面上一般通过超速离心收集外泌
体，产量极低，而且成本非常高，很难用于规模化生产与治疗。本方法通过超滤管离心的方
法收集外囊泡包裹的THC的浓缩液，相比较于外泌体的制备流程，更为简便，且起到更好功
效。

附图说明

[0023] 图1是不同间充质干细胞的流式细胞检测图；

[0024] 图2是不同间充质干细胞的分化能力检测图；

[0025] 图3是负载THC的间充质干细胞和负载THC的外囊泡的获得步骤示意图；

[0026] 图4是负载THC的外囊泡的透射电镜图；

[0027] 图5是不同包裹率THC外囊泡对HSF细胞迁移的影响；

[0028] 图6是不同包裹率THC外囊泡对Col I和MMP‑1表达量的影响；

[0029] 图7是负载THC的外囊泡对治疗皮肤损伤的效果；

[0030] 图8是负载THC的外囊泡对抑制光损伤的效果；

[0031] 图9是负载THC的脐带间充质干细胞抑制炎症因子TNF‑α表达检测图；

[0032] 图10是负载THC的脐带间充质干细胞对HUVEC成血管能力的影响。

具体实施方式

[0033] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

[0034] 实施例1 间充质干细胞的分离培养

[0035] （1）新鲜脐带用生理盐水充分洗涤后，剪成小段，去除动脉、静脉，取华通氏胶10 mL，平分加入4瓶T175培养瓶，加入MSC培养液（北京银丰）培养4天；

[0036] （2）每天半量换液培养至7天传代，传代采用不含EDTA的TrypLE，每瓶加胰酶2.5 mL，消化3 min，每瓶加入培养液5 mL，终止消化；移入离心管，300 g离心5 min，弃上清；生
理盐水重悬，细胞筛网过滤，轻轻吹吸混匀洗涤，300 g离心5 min，收集所有沉淀，培养液重
5
悬，调整细胞密度为1×10个/mL传代；

[0037] （3）将细胞37℃，5% CO2培养，每日全量换液，第3天传代一次；再传2代后，收集细胞；

[0038] （4）以5×105个/mL浓度传代培养，即得到纯化的脐带间充质干细胞MSCs1。将获得的脐带间充质干细胞进行流式细胞检测，结果如图1a所示，CD73>95%、CD 34<0.2%、CD 44> 
99%、CD45<0.5%、CD90>99%，HLA‑DR<0.2%、CD 105>99%。

[0039] 对同一个体获得的新鲜脐带按照以下通常方法制备MSCs：

[0040] （1）新鲜脐带用生理盐水充分洗涤后，剪成小段，去除动脉、静脉，剪成2‑3 mm3大小，加入20%胎牛血清的DMEM/F12培养基包被的T75瓶中，每瓶加入15‑20块脐带；37℃，5%
CO2培养箱中培养，每隔24h加入1 mL培养液，72 h后全量换液；

[0041] （2）每周换液两次，待细胞贴壁生长至70%融合率时，胰酶消化3min，DMEM/F12培养5
基重悬，1×10 密度传代至T75培养瓶，之后再传代两次后获得脐带间充质干细胞MSCs2，进
行流式检测，结果如图1b所示，CD44、CD73、CD90、CD105均不低于75%，CD34、CD45、HLA‑DR均
不高于2%。

[0042] 将上述两种间充质干细胞分别进行成脂、成骨和成软骨的分化测试：

[0043] （1）成脂：用MSC细胞培养基调整细胞密度为1胞密度4/mL，2mL加入6孔板中。37℃，5% CO2培养24h后，加入成脂诱导分化的培养液，隔两天换液一次，诱导14天后，染色。吸走
上清，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min；PBS清洗2次，60%异丁醇浸泡30s，油红O试剂盒染
色，显微镜下拍照（图2a）；

[0044] （2）成骨：6孔板中加入1mL 0.1%的明胶，超净台静置30min，吸干明胶后，超净台凉4
干备用。用MSC细胞培养基调整细胞密度为1×10/mL，2 mL加入6孔板中。37℃，5% CO2 培养
24 h后，加入成骨诱导分化的培养液，隔两天换液一次，诱导21天后，番茄红试剂盒染色，显
微镜下观察（图2b）；

[0045] （3）成软骨：诱导培养基悬细胞，2.5培养基5个细胞接种于15mL离心管，150g，5min，使细胞沉淀于管底，悬松离心管盖，将离心管轻轻置于37℃，5%CO2培养箱静置培养，
诱导培养24h后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，诱导的细胞每三天换液一次，诱
导21天后，取微团4%多聚甲醛固定24h，脱水、包埋、制作冷冻切片，阿利新蓝试剂盒染色观
察（图2c），同时采用AB‑PAS染色（图2d）。

[0046] 通过分化测定可知，相比于MSCs2，MSCs1的分化能力更强。

[0047] 实施例2 负载THC间充质干细胞（THC‑MSC）和负载THC外囊泡（THC‑Evs）的制备

[0048] 1.负载THC的间充质干细胞和外囊泡的制备

[0049] 按照图3所示的步骤制备负载THC的间充质干细胞和负载THC的外囊泡：

[0050] （1）将实施例1获得的脐带间充质干细胞培养至T175瓶中，37℃，5% CO2培养至融合度90%以上；

[0051] 以MSC细胞培养液稀释四氢姜黄素（THC）使其终浓度为10 μg/mL，30 μg/mL，50 μg/mL，分别金属浴加热至25℃、39℃、37℃，备用；

[0052] （2）将间充质干细胞中的培养液倾倒出，加入25℃、10 μg/mL 含THC培养液25 mL，25℃孵育5 min；倾倒出培养液，加入39℃、30 μg/mL含THC培养液25 mL，39℃孵育10 min；
倾倒出培养液，加入37℃、50 μg/mL含THC培养液25 mL，37℃、5% CO2孵育24 h；

[0053] （3）将步骤（2）的细胞倾倒出培养液，用PBS清洗细胞3次，用TypLE消化3 min，300g离心5min，去除液体，生理盐水悬浮细胞，即为负载THC的脐带间充质干细胞；

[0054] （4）将步骤（2）中MSCs1制备的细胞倾倒出培养液，PBS清洗3遍，加入MSC培养液，放入37℃，5% CO2 的培养箱中，孵育24 h，收集培养液；

[0055] 将上述培养液10000g，4℃离心30 min，上清液即为纯化的培养基；

[0056] 将纯化的培养基加入30 KDa超滤管中，4500rpm，4℃，离心2h，获得负载THC的外囊泡1（THC‑Evs 1）的浓缩液，‑80℃冻存，备用。

[0057] 按照上述步骤（1）‑（4）以MSCs1为材料，制备负载THC的外囊泡2（THC‑Evs 2）的浓缩液，不同在于仅采用10 μg/mL下25℃孵育5min，50 μg/mL下37℃孵育24h；不包括30 μg/
mL下39℃孵育10min的步骤。

[0058] 2.细胞THC负载率检测

[0059] 将上述获得的负载THC的脐带间充质干细胞经过生理盐水反复洗涤，收集细胞5×6
10，超声破碎，4℃，13000rpm离心30min，通过LC‑MS/MS检测THC的浓度：

[0060] 色谱条件：色谱柱Agilent SB C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），柱温30 ℃；流动相为含0.1%的甲酸的乙腈‑水（50:50），流速0.3 mL/min；进样量10 μL；

[0061] 质谱条件：采用电喷雾离子化源，正离子模式，喷雾电压源温度为100℃；雾化气为氮气，雾化压力40 psi；去溶剂气为氮气，温度为350℃，流速为10L/mL；碰撞气为高纯氮气，
压力为0.1MPa，采用多反应监测（MRM）；

[0062] 标准曲线：以四氢姜黄素浓度为横坐标，四氯姜黄素和内标物（地西泮）的峰面积比值为纵坐标，计算样品所含四氢姜黄素质量。

[0063] 按照以下公式计算负载率：负载率= M0/M×100%，

[0064] 其中，

[0065] M为加入四氢姜黄素质量（g/L），

[0066] M0为姜黄素质量检测值（g/L）。

[0067] 通过检测，MSCs1制备的负载THC间充质干细胞的负载率为18%‑25%，而MSCs2制备的仅为5%‑15%，通过t‑检验，两者之间差异显著；说明纯度更高的间充质干细胞的负载率更
高。

[0068] 3.外囊泡质量检验

[0069] 采用透射电镜观察外囊泡形态：在封口膜上滴加30 射电负载THC的细胞外囊泡的浓缩液，用镊子夹住一片碳涂层铜网，正面朝下倒扣在样品液滴上，等待1 min，小心用镊子
夹起铜网，用滤纸吸干铜网表面的液体。在封口膜上滴加2%磷钨酸染液30 染液，将铜网正
面朝下倒扣在磷钨酸染液上，盖到液滴上，等待约1 min，用滤纸吸干铜网表面的液体。将铜
网放入透射电镜样品杆中，在80 kV的加速电压下观察负载THC细胞外囊泡的形态，如图4所
示：浓缩液中含有大量细胞外囊泡，且囊泡完整。

[0070] 外囊泡的THC包裹率检测：将上述冻存的负载THC的外囊泡取出，37℃融化；往复冻融5次，采用上述LC‑MS/MS方法检测THC含量，计算负载率。该方法得到的THC‑Evs 1的包裹
率为18%‑28%，而THC‑Evs 2的包裹率仅为5%‑13%（图4）。由此说明，30 μg/mL下39℃孵育10 
min的步骤可以显著提高外囊泡的负载率。

[0071] 应用例1 负载THC的外囊泡促进HSF迁移

[0072] 1.促进人皮肤成纤维细胞HSF的迁移

[0073] （1）按照实施例2的方法平行制备三批次不同个体来源的THC‑Evs，经LC‑MS/MS检测，包裹率分别为19%、21%、25%。按照实施率2中THC‑Evs 2的方法制备包裹率为8%的外囊
泡。将取制备的外囊泡浓缩液，以5%的体积分数加入HSF培养基；将HSF细胞传至6孔板中培
养至融合率70%，加入上述含THC‑Evs的培养液，处理48h，以不含THC的细胞外囊泡为空白对
照（THC包裹率为0%）；

[0074] （2）将上述HSF细胞更换为不含FBS的培养液，饥饿培养2 h，0.1% BSA调整细胞密5
度至10 /mL。准备Transwell小室，吸取100 μL细胞悬液加入上室，下室加入600 μL正常培
养液，细胞培养箱中培养。12‑18 h后，取出小室，于4%多聚甲醛溶液中固定30 min，2%结晶
紫染色液中染色5 min，于倒置显微镜下拍照，计算迁移率。

[0075] 结果如图5所示：与不含THC及低负载率（8%）的细胞外囊泡相比，包裹THC的细胞外囊泡在包裹率分别为19%、21%、25%时，HSF迁移能力增强，且具有统计学意义上的显著性。这
说明，包裹THC的细胞外囊泡能够有效促进人皮肤成纤维细胞HSF的迁移。

[0076] 2.对Col I和MMP‑1表达量的影响

[0077] 收集THC‑Evs处理后的HSF细胞，提取RNA，检测浓度、纯度后，反转录用于RT‑PCR。引物设计如下：

[0078]

[0079] PCR扩增条件为：预变性95℃、15 min，变性95℃、15 s，退火60 ℃、30 s，延伸72℃、20 s，反应循环40次，72℃、10 min后终止反应。

[0080] 通过Ct值计算目的基因相对于内参基因表达量的变化，结果如图6a所示：与对照相比，三种包裹量的THC‑Evs处理后，Col I的表达量均显著上调，其中，包裹率21%和25%的
Col I的表达量两者间无差异，显著高于包裹率19%的。与对照相比，MMP‑1的表达量显著下
调；其中，包裹率19%和25%的MMP‑1的表达量两者间无差异，而包裹量21%的MMP‑1表达量显
著高于其余两处理。

[0081] 收集THC‑Evs处理后的HSF细胞培养液，依据人基质金属蛋白酶1(MMP‑1)ELISA Kit，人Ⅰ型胶原(Col I)ELISA Kit（武汉华美）试剂盒说明，检测蛋白水平表达：加样后经过
温育、洗涤、显色及终止后，立即测定450 nm波长处的OD值。根据以下公式计算排除试剂空
白的影响：OD待测物=OD测定值‑OD空白。以标准品的不同浓度作为X轴，对应的OD值为Y轴，绘制标准
曲线。如图6b所示，THC细胞外囊泡浓缩液可以在蛋白水平提高人皮肤成纤维细胞HSF中Col 
I的表达，下调分解胶原蛋白的基质金属酶MMP‑1的表达。

[0082] 应用例2 负载THC的外囊泡复合透明质酸水凝胶治疗皮肤损伤

[0083] 取1 mg透明质酸钠（分子量1000‑2000 kDa）粉末，加入至1 mL包裹THC的细胞外囊泡浓缩液（包裹率21%）中，漩涡振荡使其充分溶解，制成凝胶状液体（THC‑Evs/ HA），同时配
制空外囊泡和透明质酸钠的水凝胶（Evs/ HA）、单独透明质酸钠水凝胶（HA）备用；

[0084] 用1%戊巴比妥钠按50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉昆明鼠，腿部备皮，用8%硫化钠脱毛，脱毛位置用碘酒进行消毒，用沾有印泥的直径为8 mm的圆筒在脱毛位置印上圆环，用
镊子夹起圆环中心皮肤，沿圆环剪除全层皮肤，形成机械损伤创面，模型制备当天记为第0
天，每隔两日涂抹不同凝胶处理伤口，进行单笼饲养，第2、4、8、10天分别观察伤口情况，结
果如图7所示：与单纯透明质酸凝胶处理组相比，采用脐带间充质干细胞分泌的外囊泡复合
透明质酸，可以有效的促进昆明鼠的损伤修复；采用包裹THC细胞外囊泡复合透明质酸治疗
效果最佳，在治疗第10天，可以看到损伤的基本恢复。

[0085] 应用例3 负载THC的外囊泡抑制细胞光损伤

[0086] （1）细胞的准备：收集HSF细胞，调整密度为6×104个/mL，传至六孔板中，37℃，5% CO2培养24 h，用含5% THC‑Evs 1体积分数的培养液，继续处理细胞48h，检测其对抗光老化
的防护作用；对照组为不含THC的细胞外囊泡；阴性对照为正常培养液；

[0087] （2）紫外照射：在距离UVB 15cm处辐照5min，辐照后细胞经PBS清洗一遍，加入无血清培养液继续培养6 h；

[0088] （3）SA‑β‑gal检测：按照Senescence Cells Histochemical Staining Kit试剂盒说明： 1×Fixation Buffer，室温10min固定；加入Staining buffer，染色，37℃不含CO2培
养过夜，倒置显微镜镜下观察衰老细胞。

[0089] 结果如图8所示：衰老细胞SA‑β‑gal活性提高，被染成绿色。与普通MSC培养液相比，发明条件下获得富含外囊泡的条件培养液与含有THC‑Evs的条件培养液明显降低绿色
细胞比例，减缓衰老细胞产生。这说明，THC外囊泡浓缩液相较于不含THC的外囊泡浓缩液，
可以有效抑制、减少衰老细胞的形成。

[0090] 应用例4 负载THC间充质干细胞活化T细胞

[0091] 丝裂原植物血凝素PHA可以刺激人外周血单核细胞激活，分泌大量TNF‑α。UCMSC与单个核细胞共培养，具有抑制PHA刺激的T细胞分泌TNF‑α的能力。

[0092] PBMC制备：静脉血40 mL，2000 rpm离心10 min；吸取上层血浆；生理盐水1:1稀释血细胞，Ficoll离心管分离；血样与Ficoll比例3:1，400 g离心20 min；吸取白膜层细胞，加
入30 mL生理盐水，1500 rpm离心10 min，弃上清，加入一定量生理盐水重悬，重复上述离
心；一定量生理盐水溶解沉淀，即为PBMC细胞溶液。

[0093] 按照以下步骤进行试验：

[0094] （1）空白组：AIM培养基+5%CTS重悬PBMC，2×106/mL，100μL每孔；

[0095] （2）实验组：AIM培养基+5%CTS +PHA工作浓度=10 μg/mL重悬PBMC，2×106/mL，100 μL每孔；

[0096] （3）MSC与PBMC，37℃培养箱共培养72h，ELISA试剂盒检测TNF‑α含量；

[0097] （4）根据数据制作标准曲线，计算PBMC组的TNF‑α浓度，只添加PHA实验组的TNF‑α浓度‑a，添加PHA且与MSC共培养实验组的TNF‑α浓度‑b，计算淋巴细胞分泌TNF‑α相对抑制
率，抑制率（%）=（a‑b）/a×100%。

[0098] 如图9所示：与MSC相比，负载THC的MSCs能够有效抑制TNF‑α的产生（抑制率93%），调节T细胞免疫能力。

[0099] 应用例5 MSC‑THC细胞促进HUVEC血管生成能力

[0100] 将Matrigel 4℃融化离心数分钟，置于冰上备用；将Trans‑well板提前预冷，每孔加入50μL matrigel，避免产生气泡，在37℃孵箱放置45min；HUVEC长满70‑80%时，消化，下
室每孔加入50μL重悬液，浓度为10000‑60000/孔细胞，重复三孔；将准备好的MSC及MSC‑
THC，50000个细胞加入上室，二者37℃共培养，约4h后可见血管形成。如图10所示：MSC‑THC
有效促进HUVEC细胞成小管能力。