一种检测阪崎肠杆菌的新方法、应用及检测试剂盒转让专利
申请号 : CN202110991715.8
文献号 : CN113433253B
文献日 : 2021-11-19
发明人 : 董志珍 , 赵良娟 , 王洪彬 , 王玉迎 , 赵宏 , 庞路 , 宓捷波 , 袁兆霆 , 于敏 , 赵化冰 , 王淞
申请人 : 天津海关动植物与食品检测中心 , 天津科技大学
摘要 :
本发明公开了一种检测阪崎肠杆菌的新方法、应用及检测试剂盒，所述方法通过分析以下特征肽检测奶制品中的阪崎肠杆菌污染：I1：SEQ ID NO.1；I2：SEQ ID NO.2；I3：SEQ ID NO.3；I4：SEQ ID NO.4。本发明使用液相色谱三重四级杆质谱联用仪检测特征肽，本方法检测过程不依赖于菌落挑选和生化鉴定，具有高可靠性，并大大减少了检测时间，为食品中坂崎肠杆菌污染的检验提供了可靠有效的方法。
权利要求 :
1.一种基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于：所述方法通过分析以下特征肽检测样品中的阪崎肠杆菌：I1：SEQ ID NO.1；
I2：SEQ ID NO.2；
I3：SEQ ID NO.3；
I4：SEQ ID NO.4；
所述特征肽中I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品中阪崎肠杆菌阳性。
2.根据权利要求1所述的基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于：采用液相色谱‑质谱联用系统对阪崎肠杆菌的组合特征肽进行检测。
3.根据权利要求2所述的基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于：采用LC‑ESI/QQQ MRM模式进行检测。
4.如权利要求1至3任一项所述的基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法在阪崎肠杆菌检测方面中的应用。
5.一种基于组合特征肽的阪崎肠杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括如下阪崎肠杆菌的组合特征肽：
I1：SEQ ID NO.1（LTPTILR）；
I2：SEQ ID NO.2（NANDGISLVQTAEGNLNEINTNLQR）；
I3：SEQ ID NO.3（AVVAAVEELK）；
I4：SEQ ID NO.4（LADVLAAAEAR）。
6.根据权利要求5所述的基于组合特征肽的阪崎肠杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阪崎肠杆菌增菌液、生理盐水、Buffer 1、Buffer 2、胰蛋白酶、甲酸、特征肽标准品；所述Buffer 1为含10 mM二硫苏糖醇的50 mM碳酸氢铵溶液；所述Buffer 2为含
0.5 M碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。
7.根据权利要求5或6所述的基于组合特征肽的阪崎肠杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：菌体收集及样品前处理：通过离心收集菌体，使用生理盐水洗涤沉淀2次，在菌体沉淀中加入0.5 ml Buffer 1，混匀后超声破碎10 min；随后，加入100 μL的Buffer 2迅速混匀，避光反应15min；随后加入4 μL胰蛋白酶，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min；加入0.5 μL甲酸终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析；
LC‑ESI/QQQ分析：先使用非靶向模式分析特征肽标准品，确认标准肽的保留时间和特征碎片，然后通过多反应监测模式MRM靶向检测样品中的特征肽；
阪崎肠杆菌污染鉴定方法：若特征肽组合I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品阪崎肠杆菌阳性。
说明书 :
一种检测阪崎肠杆菌的新方法、应用及检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于食源性致病菌检测技术领域，尤其是一种检测阪崎肠杆菌的新方法、应用及检测试剂盒。
背景技术
[0002] 食源性致病菌的存在严重威胁着人类健康与公共卫生。食物携带的致病微生物可以在宿主体内繁殖并表达毒力因子，进而损伤机体健康。尽管公共卫生水平不断提高，但时
至今日食源性致病菌仍频繁引起疾病暴发。高效严谨的检验检疫手段，对于食源性致病菌
危害的控制和国民食品安全极其重要。
至今日食源性致病菌仍频繁引起疾病暴发。高效严谨的检验检疫手段，对于食源性致病菌
危害的控制和国民食品安全极其重要。
[0003] 阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种杆状、非孢子形成、周生鞭毛、兼性厌氧革兰氏阴性食源性病原体，属于肠杆菌科。阪崎肠杆菌以前一直被归属为黄色阴沟肠
杆菌，直到1980 年才正式更名为阪崎肠杆菌。作为新兴的机会性食源性病原体，肉类、蔬
菜、谷物和乳制品等高蛋白的食物是阪崎肠杆菌的天然温床。食用被阪崎肠杆菌污染的食
物常导致婴儿或免疫力低下的成人感染，并伴发有菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎或其
他疾病，死亡率高达40%以上，即使被治愈的患者仍面临急性神经系统并发症，如四肢瘫、脑
脓肿、神经发育迟缓和脑积水。尽管已有探讨阪崎肠杆菌毒力特征及致病机制过程的相关
研究，但大都局限于探究感染过程的特定基因，阪崎肠杆菌毒力因子在很大程度上仍然未
知。初步研究发现，阪崎肠杆菌生物膜已经间接地成为食品污染的主要来源，生物膜一方面
可以为阪崎肠杆菌提供防御，防止被人体巨噬细胞识别，抵抗恶劣生存环境和多种抗生素；
另一方面协助阪崎肠杆菌在人类肠道、黏膜定植，并可以在不锈钢或玻璃器皿、聚四氟乙烯
等接触面形成生物膜。国际上对阪崎肠杆菌的毒力因子和致病性知之甚少，产毒菌株与非
产毒菌株的诸多差异，不仅在最开始的分类学中造成了巨大阻碍，也为后续的检测方法设
立了重重困难。
杆菌，直到1980 年才正式更名为阪崎肠杆菌。作为新兴的机会性食源性病原体，肉类、蔬
菜、谷物和乳制品等高蛋白的食物是阪崎肠杆菌的天然温床。食用被阪崎肠杆菌污染的食
物常导致婴儿或免疫力低下的成人感染，并伴发有菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎或其
他疾病，死亡率高达40%以上，即使被治愈的患者仍面临急性神经系统并发症，如四肢瘫、脑
脓肿、神经发育迟缓和脑积水。尽管已有探讨阪崎肠杆菌毒力特征及致病机制过程的相关
研究，但大都局限于探究感染过程的特定基因，阪崎肠杆菌毒力因子在很大程度上仍然未
知。初步研究发现，阪崎肠杆菌生物膜已经间接地成为食品污染的主要来源，生物膜一方面
可以为阪崎肠杆菌提供防御，防止被人体巨噬细胞识别，抵抗恶劣生存环境和多种抗生素；
另一方面协助阪崎肠杆菌在人类肠道、黏膜定植，并可以在不锈钢或玻璃器皿、聚四氟乙烯
等接触面形成生物膜。国际上对阪崎肠杆菌的毒力因子和致病性知之甚少，产毒菌株与非
产毒菌株的诸多差异，不仅在最开始的分类学中造成了巨大阻碍，也为后续的检测方法设
立了重重困难。
[0004] 针对于阪崎肠杆菌的检测方法主要有生化鉴定法、酶联免疫法（ELISA）、PCR法。其中，作为国标法常用的生化鉴定法是根据阪崎肠杆菌的菌落形态特点以及数十项生化表征
来实现的，存在操作繁琐、耗时长、可靠性和准确性差等缺点。酶联免疫反应可以通过金黄
色葡萄球菌肠毒素与抗体的相互作用实现快速检测，但该方法常由于检测样本中所含无关
抗原造成假阳性结果且成本偏高。随着分子技术的发展，依赖于特定识别元件的聚合酶链
反应逐渐普及。PCR的特异性和检测速度卓越，然而这种基于靶标的方法局限于特定的引
物，被检产品中的扩增抑制因子也会干扰检测结果。另外，经历遗传修饰的菌体仍然可能产
生假阳性或阴性结果。因此，发展快速、准确的检测阪崎肠杆菌的方法具有重要意义。
来实现的，存在操作繁琐、耗时长、可靠性和准确性差等缺点。酶联免疫反应可以通过金黄
色葡萄球菌肠毒素与抗体的相互作用实现快速检测，但该方法常由于检测样本中所含无关
抗原造成假阳性结果且成本偏高。随着分子技术的发展，依赖于特定识别元件的聚合酶链
反应逐渐普及。PCR的特异性和检测速度卓越，然而这种基于靶标的方法局限于特定的引
物，被检产品中的扩增抑制因子也会干扰检测结果。另外，经历遗传修饰的菌体仍然可能产
生假阳性或阴性结果。因此，发展快速、准确的检测阪崎肠杆菌的方法具有重要意义。
[0005] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开专利文献。
发明内容
[0006] 本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种检测阪崎肠杆菌的新方法、应用及检测试剂盒。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法，所述方法通过分析以下特征肽检测样品中的阪崎肠杆菌：
[0009] I1：SEQ ID NO.1（LTPTILR）；
[0010] I2：SEQ ID NO.2（NANDGISLVQTAEGNLNEINTNLQR）；
[0011] I3：SEQ ID NO.3（AVVAAVEELK）；
[0012] I4：SEQ ID NO.4（LADVLAAAEAR）。
[0013] 进一步地，所述特征肽中I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品中阪崎肠杆菌阳性。
[0014] 进一步地，采用液相色谱‑质谱联用系统对阪崎肠杆菌的组合特征肽进行检测。
[0015] 进一步地，采用LC‑ESI/QQQ MRM模式进行检测。
[0016] 如上所述的基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法在阪崎肠杆菌检测方面中的应用。
[0017] 一种基于组合特征肽的阪崎肠杆菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括如下阪崎肠杆菌的组合特征肽：
[0018] I1：SEQ ID NO.1（LTPTILR）；
[0019] I2：SEQ ID NO.2（NANDGISLVQTAEGNLNEINTNLQR）；
[0020] I3：SEQ ID NO.3（AVVAAVEELK）；
[0021] I4：SEQ ID NO.4（LADVLAAAEAR）。
[0022] 进一步地，所述试剂盒中还包括阪崎肠杆菌增菌液、生理盐水、Buffer 1、Buffer 2、胰蛋白酶、甲酸、特征肽标准品；所述Buffer 1为含10 mM二硫苏糖醇的50 mM碳酸氢铵溶
液；所述Buffer 2为含0.5 M碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。
液；所述Buffer 2为含0.5 M碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。
[0023] 进一步地，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：
[0024] (1) 菌体收集及样品前处理：通过离心收集菌体，使用生理盐水洗涤沉淀2次，在菌体沉淀中加入0.5 ml Buffer 1，混匀后超声破碎10 min；随后，加入100 μL的Buffer 2
迅速混匀，避光反应15min；随后加入4 μL胰蛋白酶，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min；
加入0.5 μL甲酸终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析；
迅速混匀，避光反应15min；随后加入4 μL胰蛋白酶，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min；
加入0.5 μL甲酸终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析；
[0025] (2)LC‑ESI/QQQ分析：先使用非靶向模式分析特征肽标准品，确认标准肽的保留时间和特征碎片，然后通过多反应监测模式MRM靶向检测样品中的特征肽。
[0026] 阪崎肠杆菌污染鉴定方法：若特征肽组合I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品阪崎肠杆菌阳性。
[0027] 本发明取得的优点和积极效果为：
[0028] 1、本发明将致病微生物的检测转化为了对其特征肽的检测，通过挖掘阪崎肠杆菌的特征肽，开发了一种基于特征肽的靶向分析检测食品中阪崎肠杆菌污染的新方法及其检
测试剂盒。本方法发挥了三重四级杆质谱高可靠性和高灵敏度等优势，同时极大地减少了
检测时间和假阳性结果，为食品（如奶制品）中坂崎肠杆菌的检验提供了可靠有效的新方
法。
测试剂盒。本方法发挥了三重四级杆质谱高可靠性和高灵敏度等优势，同时极大地减少了
检测时间和假阳性结果，为食品（如奶制品）中坂崎肠杆菌的检验提供了可靠有效的新方
法。
[0029] 2、相比阪崎肠杆菌检验国家标准（GB4789.40‑2016）中的方法，本发明方法不依赖于可疑菌落的人为判断和挑选，不依赖于繁琐的生化检验步骤，检测过程高效可靠，易于实
现标准化和自动化操作。
现标准化和自动化操作。
[0030] 3、本发明方法 将液相色谱三重四级杆质谱联用仪的应用范围拓展到了致病微生物的检验领域，该仪器广泛应用于农药残留和非法添加的检验，并大量装备于海关和食品
质量监督检验部门，因此现有设备可以满足本发明的实施和推广。
质量监督检验部门，因此现有设备可以满足本发明的实施和推广。
附图说明
[0031] 图1为本发明中阪崎肠杆菌特征肽的筛选图；其中，（a）多肽筛选来源于21株阪崎肠杆菌的全蛋白质组学分析；（b）大肠杆菌和沙门氏菌的蛋白质组是由计算机虚拟消化，阪
崎肠杆菌候选特征肽特异性较差被淘汰；（c）对候选特征肽进行PCA分析图；（d）PCA负载图，
反映了多肽对从其他菌株中分离阪崎肠杆菌的贡献；
崎肠杆菌候选特征肽特异性较差被淘汰；（c）对候选特征肽进行PCA分析图；（d）PCA负载图，
反映了多肽对从其他菌株中分离阪崎肠杆菌的贡献；
[0032] 图2为本发明中阪崎肠杆菌候选特征肽的比较与优选图；其中，（a）阪崎肠杆菌种属覆盖率图，（b）36株阪崎肠杆菌各个特征肽的响应强度图。
具体实施方式
[0033] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0034] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0035] 一种基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法，所述方法通过分析以下特征肽检测样品中的阪崎肠杆菌：
[0036] I1：SEQ ID NO.1（LTPTILR）；
[0037] I2：SEQ ID NO.2（NANDGISLVQTAEGNLNEINTNLQR）；
[0038] I3：SEQ ID NO.3（AVVAAVEELK）；
[0039] I4：SEQ ID NO.4（LADVLAAAEAR）。
[0040] 较优地，所述特征肽中I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品中阪崎肠杆菌阳性。
[0041] 较优地，采用液相色谱‑质谱联用系统对阪崎肠杆菌的组合特征肽进行检测。
[0042] 较优地，采用LC‑ESI/QQQ MRM模式进行检测。
[0043] 如上所述的基于组合特征肽的靶向分析检测阪崎肠杆菌的检测方法在阪崎肠杆菌检测方面中的应用。
[0044] 一种基于组合特征肽的阪崎肠杆菌检测试剂盒，所述试剂盒中包括如下阪崎肠杆菌的组合特征肽：
[0045] I1：SEQ ID NO.1（LTPTILR）；
[0046] I2：SEQ ID NO.2（NANDGISLVQTAEGNLNEINTNLQR）；
[0047] I3：SEQ ID NO.3（AVVAAVEELK）；
[0048] I4：SEQ ID NO.4（LADVLAAAEAR）。
[0049] 较优地，所述试剂盒中还包括阪崎肠杆菌增菌液、生理盐水、Buffer 1、Buffer 2、胰蛋白酶、甲酸、特征肽标准品；所述Buffer 1为含10 mM二硫苏糖醇的50 mM碳酸氢铵溶
液；所述Buffer 2为含0.5 M碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。
液；所述Buffer 2为含0.5 M碘乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液。
[0050] 较优地，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：
[0051] (2) 菌体收集及样品前处理：通过离心收集菌体，使用生理盐水洗涤沉淀2次，在菌体沉淀中加入0.5 ml Buffer 1，混匀后超声破碎10 min；随后，加入100 μL的Buffer 2
迅速混匀，避光反应15min；随后加入4 μL胰蛋白酶，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min；
加入0.5 μL甲酸终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析；
迅速混匀，避光反应15min；随后加入4 μL胰蛋白酶，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min；
加入0.5 μL甲酸终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析；
[0052] (2)LC‑ESI/QQQ分析：先使用非靶向模式分析特征肽标准品，确认标准肽的保留时间和特征碎片，然后通过多反应监测模式MRM靶向检测样品中的特征肽。
[0053] 阪崎肠杆菌污染鉴定方法：若特征肽组合I1、I2、I3、I4中任意检出≥2条，则可判定样品阪崎肠杆菌阳性。
[0054] 具体地，相关制备及检测如下：
[0055] 实施例1：特征肽的挖掘
[0056] 1)非靶向蛋白质组学分析：采用UPLC‑Q Exactive对21株阪崎肠杆菌进行非靶向蛋白质组鉴定分析，再通过Mascot处理数据。液相色谱条件：流速0.2 mL/mL；进样量10 μL；
洗脱程序：0 5 min，B相保持由5%；5 30 min，B相由5%升至40%；30 40 min，B相保持95%。质
~ ~ ~
谱条件：加热电喷雾离子源(HESI)；正离子模式；采用全扫描模式，粒子范围：m/z 300‑1500
；分辨率70 000；Ctrap最大容量（AGC target）：100000；Ctrap最大注入时间：100 ms；鞘气
速度：40 arb；辅助气流速：3 arb；喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：300 ℃。Mascot软件鉴定
蛋白质条件：蛋白质数据库选择SwissProt，蛋白酶种类选择胰蛋白酶，最大漏切位点1个，
固定修饰选择Carbamidomethyl（C），可变修饰选择Oxidation（M），分子量误差：1.2 Da；电
荷类型选2+，3+。鉴定结果中的这肽段必须至少覆盖95%的被检菌株且肽MS1面积大于200，
最终筛选出290条肽段作为候选特征肽（如图1（a）所示）。
洗脱程序：0 5 min，B相保持由5%；5 30 min，B相由5%升至40%；30 40 min，B相保持95%。质
~ ~ ~
谱条件：加热电喷雾离子源(HESI)；正离子模式；采用全扫描模式，粒子范围：m/z 300‑1500
；分辨率70 000；Ctrap最大容量（AGC target）：100000；Ctrap最大注入时间：100 ms；鞘气
速度：40 arb；辅助气流速：3 arb；喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：300 ℃。Mascot软件鉴定
蛋白质条件：蛋白质数据库选择SwissProt，蛋白酶种类选择胰蛋白酶，最大漏切位点1个，
固定修饰选择Carbamidomethyl（C），可变修饰选择Oxidation（M），分子量误差：1.2 Da；电
荷类型选2+，3+。鉴定结果中的这肽段必须至少覆盖95%的被检菌株且肽MS1面积大于200，
最终筛选出290条肽段作为候选特征肽（如图1（a）所示）。
[0057] 2)特异性分析：特异性分析采用本地化BLAST+对阪崎肠杆菌、变形虫纲蛋白质库进行同源性检索。利用Skyline计算机虚拟消化技术对290条候选特征肽进一步筛选。
Skyline软件设定参数：背景蛋白质组自定义为阪崎肠杆菌全库；虚拟酶切选择胰蛋白酶，
不允许漏切；多肽长度界定6 25个氨基酸；母离子电荷类型选择2+，3+；子离子类型选择b，
~
y。具体措施是在290条候选特征肽中排除阪崎肠杆菌亲缘菌株的理论水解肽段（图1（b）），
最终筛选至90条多肽。
Skyline软件设定参数：背景蛋白质组自定义为阪崎肠杆菌全库；虚拟酶切选择胰蛋白酶，
不允许漏切；多肽长度界定6 25个氨基酸；母离子电荷类型选择2+，3+；子离子类型选择b，
~
y。具体措施是在290条候选特征肽中排除阪崎肠杆菌亲缘菌株的理论水解肽段（图1（b）），
最终筛选至90条多肽。
[0058] 3)PCA主成分评价：进一步优选特征肽，采用90条候选特征肽对25株阪崎肠杆菌及10株亲缘菌株进行PCA分析（图1（c）），结果表明该90条肽可以明显区分阪崎肠杆菌及其亲
缘菌株，最终从Loading图（图1（d））中优选出9条对聚类分析作用最强的特征肽。
缘菌株，最终从Loading图（图1（d））中优选出9条对聚类分析作用最强的特征肽。
[0059] 实施例2 ：候选特征肽的特异性验证及优选
[0060] 4)采用营养琼脂培养基（1% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.3% 牛肉膏，2% 琼脂）分别培养阪崎肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的标准菌株，37 ℃培养24 h。
[0061] 2) 菌体收集及样品前处理：加入0.5 ml Buffer 1 (C)与（1）处理后的菌液混匀，超声破碎10 min。随后，加入100 μL的Buffer 2 (D)迅速混匀，避光反应15min。随后加入4
μL胰蛋白酶(E)，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min。加入0.5 μL甲酸(F)终止胰蛋白酶消
化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析。
μL胰蛋白酶(E)，在50 ℃的水浴锅中进行消化15 min。加入0.5 μL甲酸(F)终止胰蛋白酶消
化，直接分析样品或在‑20 ℃下储存直至分析。
[0062] 5)LC‑DSI/QQQ的MRM模式靶向分析。色谱条件：色谱柱采用Vydax C18柱（2.1mm×150mm，5 μm）；流速0.3 ml/min；进样量2 μL；流动相A相为含0.1 %甲酸的水溶液，B相为含
0.1 %甲酸的乙腈溶液。洗脱程序为，0 3 min，B相保持2%；3 20 min，B相由2%升至45.5%。质
~ ~
谱条件：采用正离子模式和MRM模式；Turbo V离子源雾化温度：550 ℃；离子喷雾电压：5500
V；幕帘气流：172.2 kPa；碰撞气流：68.3 kPa；FS1（Ion Source Fas1）雾化气流： 413.7
kPa；FS2（Ion Source Fas2）辅助气流：379.2 kPa；特征肽按照表1的MRM方法参数设置。
0.1 %甲酸的乙腈溶液。洗脱程序为，0 3 min，B相保持2%；3 20 min，B相由2%升至45.5%。质
~ ~
谱条件：采用正离子模式和MRM模式；Turbo V离子源雾化温度：550 ℃；离子喷雾电压：5500
V；幕帘气流：172.2 kPa；碰撞气流：68.3 kPa；FS1（Ion Source Fas1）雾化气流： 413.7
kPa；FS2（Ion Source Fas2）辅助气流：379.2 kPa；特征肽按照表1的MRM方法参数设置。
[0063]
[0064]
[0065] 4)定性判断方法：采用Skyline软件分析 LC‑DSI/QQQ 数据。通过与特征肽标准品数据的比较确认样品中的特征肽，需要满足以下条件：a）目标离子保留时间的偏差应小于
0.1 min。b）信噪比大于3；c）丰度最高的子离子的峰面积比值（Pr）的偏差值在± 0.05之
内，Pr偏差值计算公式如公式所示。
0.1 min。b）信噪比大于3；c）丰度最高的子离子的峰面积比值（Pr）的偏差值在± 0.05之
内，Pr偏差值计算公式如公式所示。
[0066]
[0067] 若阪崎肠杆菌的4条特征肽阳性检出≥2条，则视为阪崎肠杆菌阳性。评价结果如表2所示。
[0068]
[0069]
[0070] 4)特征肽的优选：良好的特征肽应在阪崎肠杆菌中的保留时间具有规律，且在其亲缘菌株中不得检出。通过HPLC‑ESI/QQQ 质谱的MRM分析36株阪崎肠杆菌及10株其亲缘菌
株，比较了9条候选特征肽的检测效能。结果表明，9条特征肽都展现了较高的阪崎肠杆菌种
属覆盖率（图2（a）），其中I1、I2、I3、I4、I8均达到了80%以上。采用9条特征肽检测沙门氏菌、
大肠杆菌对特征肽进行特异性评价，除I2、I7、I8外所有的候选特征肽均未检出。特征肽的
质谱响应能力越强，意味着同等浓度下更容易被检出。响应能力为特征肽的筛选提供了一
定的指导作用，响应能力很差的肽段不适合于作为特征肽使用。当然，不同肽在实际样品中
的丰度不同，候选肽作为特征肽是否适合，还要取决于实际生物样品中的检出效能。图2（b）
展示了36株阪崎肠杆菌各个特征肽的响应强度，其中I1、I3、I4的响应较强。综上所述，I1、
I3、I4的特异性高、响应较强，可作为理想的特征肽，而I5 I9的种属覆盖率较低、响应强度
~
较低，故不适合作为特征肽。此外，I2虽特异性相对较差，但其种属覆盖率高且来源蛋白是
参与阪崎肠杆菌结构组成的关键蛋白，且本研究采用组合肽进行定量，极大地降低了假阳
性的检出，故I2也考虑用作阪崎肠杆菌特征肽。
株，比较了9条候选特征肽的检测效能。结果表明，9条特征肽都展现了较高的阪崎肠杆菌种
属覆盖率（图2（a）），其中I1、I2、I3、I4、I8均达到了80%以上。采用9条特征肽检测沙门氏菌、
大肠杆菌对特征肽进行特异性评价，除I2、I7、I8外所有的候选特征肽均未检出。特征肽的
质谱响应能力越强，意味着同等浓度下更容易被检出。响应能力为特征肽的筛选提供了一
定的指导作用，响应能力很差的肽段不适合于作为特征肽使用。当然，不同肽在实际样品中
的丰度不同，候选肽作为特征肽是否适合，还要取决于实际生物样品中的检出效能。图2（b）
展示了36株阪崎肠杆菌各个特征肽的响应强度，其中I1、I3、I4的响应较强。综上所述，I1、
I3、I4的特异性高、响应较强，可作为理想的特征肽，而I5 I9的种属覆盖率较低、响应强度
~
较低，故不适合作为特征肽。此外，I2虽特异性相对较差，但其种属覆盖率高且来源蛋白是
参与阪崎肠杆菌结构组成的关键蛋白，且本研究采用组合肽进行定量，极大地降低了假阳
性的检出，故I2也考虑用作阪崎肠杆菌特征肽。
[0071] 实施例3：特征肽在检测奶粉样品阪崎肠杆菌污染中的应用
[0072] 在纯奶粉（伊利，中国）中添加目标致病菌菌液至菌浓为100 CEU/ mL。取0.1 mL污染的奶粉样品，添加于0.9 mL LB培养基中，37℃培养12 h。后续步骤与实施例2中（2）‑（4）
处理方法一致。评价结果如表3所示。
处理方法一致。评价结果如表3所示。
[0073]
[0074]
[0075] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本
发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
发明的范围不局限于实施例所公开的内容。