一种高效的海马齿再生体系建立方法转让专利
申请号 : CN202110734958.3
文献号 : CN113439660B
文献日 : 2022-05-13
发明人 : 王丹 , 魏翔莺 , 叶桂萍 , 何伟红 , 杨楠
申请人 : 闽江学院
摘要 :
本发明公开了一种高效的海马齿的再生体系建立方法，属于植物快速繁殖再生技术领域，解决海马齿再生效率低的问题。所述一种高效的生海马齿的再生体系建立方法，包括以下步骤：海马齿无菌苗的准备；海马齿不定芽的诱导及成苗；再生苗的移栽与管理。采用本发明的方法能够高效诱导海马齿不定芽生成及后续成苗。
权利要求 :
1.一种海马齿再生体系建立方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）海马齿无菌苗的准备：在超净工作台中，将采集的海马齿的成熟种籽经过表面消毒后播种于播种培养基中，在24℃恒温光照培养箱中培养1‑2个月，获得海马齿无菌幼苗待用；
（2）海马齿不定芽的诱导及成苗：在超净工作台中取步骤（1）海马齿无菌幼苗的叶片，切除叶片两端，将叶片中间部分切成0.5 cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上；在
24℃培养箱中避光培养10天，然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养2‑3个月；
期间观察叶片愈伤的诱导以及不定芽的分化，统计愈伤及不定芽的分化率；随后，将不定芽从愈伤上切下后转入生根培养基上，培养20‑30天，至不定芽长大后切取单株茎段，插入生根培养基诱导不定芽生根成苗；
（3）再生苗的移栽与管理：将步骤（2）中生根的再生苗，从培养基中取出，用自来水把根系表面的培养基冲洗干净后种植在穴盘中，浇透水后盖上保鲜膜进行保湿炼苗；一周后逐渐揭开保鲜膜，在温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔一周用营养液浇灌一次；
步骤（2）中所述的分化培养基的成分为：4.43g/L MS培养基、1.5 mg/L玉米素、30 g/L蔗糖、3 g/L植物凝胶，pH值在5.6‑6.0；
步骤（2）中所述的生根培养基的成分为：4.43g/L MS培养基、0 ‑0.4 mg/L IAA、30 g/L蔗糖、3 g/L植物凝胶，pH值在5.6‑6.0。
2.根据权利要求1所述的一种海马齿再生体系建立方法，其特征在于：步骤（1）中所述的种籽表面消毒是采用75vol%的乙醇消毒30‑90 s，随后10vol%的NaClO消毒5‑15 min，消毒期间不断摇晃使种籽得到充分的清洗，最后用无菌水冲洗3‑5次。
3.根据权利要求1所述的一种海马齿再生体系建立方法，其特征在于：步骤（1）中的播种培养基组成为：2.22 g/L MS培养基、30 g/L蔗糖、7 g/L琼脂，pH值在5.8‑6.0之间。
4.根据权利要求1所述的一种海马齿再生体系建立方法，其特征在于：步骤（3）中移栽穴盘中的栽培用土是将基质和沙子以2：1混合后，铺于穴盘中待用。
5.根据权利要求1所述的一种海马齿再生体系建立方法，其特征在于：步骤（3）中浇灌用的营养液的配方为：大量元素: 0.10 g/L KNO3，0.03 g/L MgSO4，0.23 g/L Ca(NO3)2·
4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA；以及微量元素：3 μmol /L H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，pH值为5.4‑5.8。
6.如权利要求1所述的一种海马齿再生体系建立方法在海马齿生物材料制备中的应用。
说明书 :
一种高效的海马齿再生体系建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物快速繁殖再生技术领域，具体涉及一种高效的海马齿再生体系的建立方法。
背景技术
[0002] 海马齿作为一种红树林伴生植物，能够在高盐、干旱及重金属污染等恶劣环境中保持良好长势，对生态环境的修复具有重要研究及应用价值。海马齿作为环境修复的先锋
植物，挖掘其中优良基因并结合转基因技术创制更高环境修复效率的海马齿新种质是目前
植物修复研究的一个重点方向。海马齿高效再生体系的建立是基因功能研究及转基因工作
开展的重要问题，在海马齿种质创新和新品种选育方面具有重要的应用价值。
植物，挖掘其中优良基因并结合转基因技术创制更高环境修复效率的海马齿新种质是目前
植物修复研究的一个重点方向。海马齿高效再生体系的建立是基因功能研究及转基因工作
开展的重要问题，在海马齿种质创新和新品种选育方面具有重要的应用价值。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种高效的海马齿再生体系建立方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0005] 一种高效的海马齿再生体系建立方法，包括以下步骤：
[0006] （1）海马齿无菌苗的准备：在超净工作台中，将采集的海马齿的成熟的种籽经过表面消毒后播种于播种培养基中，在24℃恒温光照培养箱中培养1‑2个月，获得海马齿无菌幼
苗待用；
苗待用；
[0007] （2）海马齿不定芽的诱导及成苗：在超净工作台中取步骤（1）海马齿无菌幼苗的叶片，切除叶片两端，将叶片中间部分切成0.5cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上；
在24℃培养箱中避光培养10天，然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养2‑3个
月；期间观察叶片愈伤的诱导以及不定芽的分化，统计愈伤及不定芽的分化率；随后，将不
定芽从愈伤上切下后转入生根培养基上，培养20‑30天，切取单株不定芽，在生根培养基上
诱导不定芽生根成苗；
在24℃培养箱中避光培养10天，然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养2‑3个
月；期间观察叶片愈伤的诱导以及不定芽的分化，统计愈伤及不定芽的分化率；随后，将不
定芽从愈伤上切下后转入生根培养基上，培养20‑30天，切取单株不定芽，在生根培养基上
诱导不定芽生根成苗；
[0008] （3）再生苗的移栽与管理：将步骤（2）中生根的再生苗，从培养基中取出，用自来水把根系表面的培养基冲洗干净后种植在穴盘中，浇透水后盖上保鲜膜进行保湿炼苗；一周
后逐渐揭开保鲜膜，在温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔一周用营
养液浇灌一次。
后逐渐揭开保鲜膜，在温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔一周用营
养液浇灌一次。
[0009] 上述步骤（1）中所述的种籽表面消毒是采用75vol%的乙醇消毒30‑90s，随后10vol%的NaClO消毒5‑15 min，消毒期间不断摇晃使种籽得到充分的清洗，最后用无菌水冲
洗3‑5次。
洗3‑5次。
[0010] 上述步骤（1）中的播种培养基组成为：2.22g/L MS培养基、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH值在5.6‑6.0之间。
[0011] 上述步骤（2）中所述的分化培养基的成分为：4.43 g/L MS培养基、1.5‑3.0 mg/L 玉米素(ZT)、0‑0.75 mg/L 吲哚乙酸（IAA）、30 g/L蔗糖、3 g/L植物凝胶，pH值在5.6‑6.0。
[0012] 步骤（2）中所述的生根培养基的成分为：4.43 g/L MS培养基、0‑0.4 mg/L 吲哚乙酸、30 g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，pH值在5.6‑6.0。
[0013] 步骤（3）中移栽穴盘中的栽培用土是将基质和沙子以2：1混合后，铺于穴盘中待用。浇灌用的营养液的配方为：大量元素0.10 g/L KNO3，0.03 g/L MgSO4，0.23 g/L Ca
(NO3)2·4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA以及微量元素(3 μmol /L H3BO3，
0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O)，PH值为
5.4‑5.8。
(NO3)2·4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA以及微量元素(3 μmol /L H3BO3，
0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O)，PH值为
5.4‑5.8。
[0014] 上述的一种高效的海马齿再生体系建立的方法在海马齿生物材料制备中的应该用。
[0015] 本发明的优点在于：
[0016] 建立了一个高效的海马齿再生体系，操作步骤简单，愈伤组织及不定芽分化率高，能结合转基因技术大大缩减海马齿优良新种质创制周期。
[0017] 附图说明：
[0018] 图1 海马齿再生体系建立过程。（A）海马齿无菌苗培养；（B‑C）利用叶盘诱导愈伤组织；（D‑E）愈伤组织分化产生不定芽；（F）不定芽在生根培养基上生长成苗。
[0019] 图2 海马齿再生苗移栽炼苗。
具体实施方式
[0020] 为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 实施例1
[0022] 一种高效的海马齿再生体系建立方法，包括以下步骤：
[0023] （1）海马齿无菌苗的准备：
[0024] 首先配置播种培养基：2.22 g/L MS培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值在6.0，经高压灭菌后在超净工作台中倒入无菌罐头瓶中备用。
[0025] 在超净工作台中，将采集的海马齿的成熟种籽表面消毒后播种于播种培养基中，在24℃恒温光照培养箱中培养1个月，获得海马齿无菌幼苗待用；
[0026] 所述的种籽表面消毒是采用75vol%的乙醇消毒90s，随后10vol%的NaClO消毒5 min，消毒期间不断摇晃使种籽得到充分的清洗，最后用无菌水冲洗5次。
[0027] （2）海马齿不定芽的诱导及成苗：首先配置分化培养基：4.43 g/L MS基础培养基+1.5 mg/L ZT+30 g/L蔗糖+3g/L 植物凝胶，经高压灭菌后在超净工作台中倒入无菌培养皿
和罐头瓶中备用。
和罐头瓶中备用。
[0028] 在超净工作台中取步骤（1）海马齿无菌幼苗的叶片，切除叶片两端，将叶片中间部分切成0.5 cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上。在24℃培养箱中避光培养10天，
然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养90天，诱导叶盘分化愈伤组织。期间，切
下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养90天，诱导叶盘分化愈伤组织。期间，切
下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
[0029] 将不定芽从愈伤上切下后转入生根培养基（4.43 g/L MS基础培养基+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂）上，培养20天，至不定芽长大后切取单株茎段，插入生根培养
基诱导不定芽生根成苗。
基诱导不定芽生根成苗。
[0030] （3）再生苗的移栽与管理：将步骤(2）中生根的再生苗，从培养基中取出，用自来水把根系表面的培养基冲洗干净后种植在穴盘中，浇透水后盖上保鲜膜进行保湿炼苗。一周
后逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔
一周用营养液浇灌一次。
后逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔
一周用营养液浇灌一次。
[0031] 上述移栽穴盘中的栽培用土是将基质和沙子以2：1混合后，铺于穴盘中待用。
[0032] 浇灌用的营养液的配方为：大量元素：0.10 g/L KNO3，0.03 g/L MgSO4，0.23 g/L Ca(NO3)2·4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA；以及微量元素：3 μmol /L
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.8。
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.8。
[0033] 本实施例海马齿愈伤组织诱导率达到100%，不定芽分化率达到73.66%。
[0034] 实施例2
[0035] 一种高效的海马齿再生体系建立方法，包括以下步骤：
[0036] （1）海马齿无菌苗的准备：
[0037] 首先配置播种培养基：2.22 g/L MS培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂，经高压灭菌后在超净工作台中倒入无菌罐头瓶中备用。
[0038] 在超净工作台中，将采集的海马齿的成熟种籽表面消毒后播种于播种培养基中，在24℃恒温光照培养箱中培养1个月，获得无菌的海马齿幼苗待用；
[0039] 所述的种籽表面消毒是采用75vol%的乙醇消毒30s，随后10vol%的NaClO消毒15 min，消毒期间不断摇晃使种籽得到充分的清洗，最后用无菌水冲洗3次。
[0040] （2）海马齿不定芽的诱导及成苗：首先配置分化培养基：4.43 g/L MS基础培养基+2 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+3g/L 植物凝胶，经高压灭菌后在超净工作台中倒
入无菌培养皿和罐头瓶中备用。在超净工作台中取海马齿的无菌苗的叶片，切除叶片两端，
将叶片中间部分切成0.5 cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上。在24℃培养箱中
避光培养10天，然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养60天，诱导叶盘分化愈
伤组织。随后，切下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
入无菌培养皿和罐头瓶中备用。在超净工作台中取海马齿的无菌苗的叶片，切除叶片两端，
将叶片中间部分切成0.5 cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上。在24℃培养箱中
避光培养10天，然后在16h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养60天，诱导叶盘分化愈
伤组织。随后，切下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
[0041] 将不定芽从愈伤上切下后转入生根培养基（4.43 g/L MS基础培养基+0.4mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂）上，培养25天，至不定芽长大后切取单株茎段，插入生根培养
基诱导不定芽生根成苗。
基诱导不定芽生根成苗。
[0042] （3）再生苗的移栽与管理：将步骤2中生根的再生苗，从培养基中取出，用自来水把根系表面的培养基冲洗干净后种植在穴盘中，浇透水后盖上保鲜膜进行保湿炼苗。一周后
逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔一
周用营养液浇灌一次。
逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，每隔一
周用营养液浇灌一次。
[0043] 上述移栽穴盘中的栽培用土是将基质和沙子以2：1混合后，铺于穴盘中待用。
[0044] 浇灌用的营养液的配方为：大量元素：0.10 g/L KNO3，0.03 g/L MgSO4，0.23 g/L Ca(NO3)2·4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA；以及微量元素：3 μmol /L
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.4。
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.4。
[0045] 本实施例海马齿愈伤组织诱导率达到96.3%，不定芽分化率达到56.7%。
[0046] 实施例3
[0047] 一种高效的海马齿再生体系建立方法，包括以下步骤：
[0048] （1）海马齿无菌苗的准备：
[0049] 首先配置播种培养基：2.22 g/L MS培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值在6.0，经高压灭菌后在超净工作台中倒入无菌罐头瓶中备用。
[0050] 在超净工作台中，将采集的海马齿的成熟种籽表面消毒后播种于播种培养基中，在24℃恒温光照培养箱中培养1个月，获得海马齿无菌幼苗待用；
[0051] 所述的种籽表面消毒是采用75vol%的乙醇消毒60s，随后10vol%的NaClO消毒10 min，消毒期间不断摇晃使种籽得到充分的清洗，最后用无菌水冲洗4次。
[0052] 海马齿不定芽的诱导及成苗：首先配置分化培养基：4.43 g/L MS基础培养基+2.5 mg/L ZT+0.75 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+3g/L 植物凝胶，经高压灭菌后在超净工作台中倒入
无菌培养皿和罐头瓶中备用。
无菌培养皿和罐头瓶中备用。
[0053] 在超净工作台中取步骤（1）海马齿无菌幼苗的叶片，切除叶片两端，将叶片中间部分切成0.5 cm长的小段，叶被面朝上放置在分化培养基上。在24℃培养箱中避光培养10天，
然后在16 h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养90天，诱导叶盘分化愈伤组织。期间，
切下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
然后在16 h光照和8小时黑暗的培养箱进行光照培养90天，诱导叶盘分化愈伤组织。期间，
切下愈伤组织在分化培养基上继代培养，直至产生不定芽。
[0054] 将不定芽从愈伤上切下后转入生根培养基（4.43g/L MS基础培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂）上，培养30天，至不定芽长大后切取单株茎段，插入生根培养基诱导不定芽生
根成苗。
根成苗。
[0055] （3）再生苗的移栽与管理：将步骤(2）中生根的再生苗，从培养基中取出，用自来水把根系表面的培养基冲洗干净后种植在穴盘中，浇透水后盖上保鲜膜进行保湿炼苗。一周
后逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，，每
隔一周用营养液浇灌一次。
后逐渐揭开保鲜膜，在光照充足，温度为24℃，湿度为75%的人工气候室进行正常培养，，每
隔一周用营养液浇灌一次。
[0056] 上述移栽穴盘中的栽培用土是将基质和沙子以2：1混合后，铺于穴盘中待用。
[0057] 浇灌用的营养液的配方为：大量元素：0.10 g/L KNO3，0.03 g/L MgSO4，0.23 g/L Ca(NO3)2·4H2O，0.02 g/L NH4H2PO4，0.007 g/L Na2FeEDTA；以及微量元素：3 μmol /L
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.6。
H3BO3，0.5 μmol/L MnCl2·4H2O，0.2 μmol/L CuSO4·5H2O，0.3 μmol/L ZnSO4· 7H2O，PH值
为5.6。
[0058] 本实施例海马齿愈伤组织诱导率达到96 %，不定芽分化率达到30 %。