基因TaPT16在提高植物对白粉菌抗性方面的应用

摘要

本发明属于农业生物领域，具体涉及基因TaPT16在提高植物对白粉菌抗性方面的应用。本发明的丛枝菌根诱导的磷转运蛋白基因TaPT16可用于提高植物抗病性，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明确定TaPT16基因为一种丛枝菌根诱导的磷转运蛋白基因，过表达TaPT16基因的纯合植株幼苗接种白粉菌后，植物的抗病性增强，大田盆栽过表达TaPT16基因的纯合植株成熟期小麦接种白粉菌，结果与幼苗期结果一致，提高了植物对白粉病的抗病性。因此，TaPT16基因可用于提高小麦对白粉菌的抗性，在植物育种、栽培具有广阔的应用空间。

权利要求

1.基因TaPT16在提高植物对小麦白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）抗性方面的应用，其中，磷转运蛋白基因TaPT16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为小麦、水稻、玉米、大麦或高粱。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达基因TaPT16提高植物对小麦白粉菌抗性。

说明书

基因TaPT16在提高植物对白粉菌抗性方面的应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物领域，具体涉及基因TaPT16在提高植物对白粉菌抗性方面的应用。

背景技术

[0002] 磷是植物生长发育所必需的第二大元素，它广泛参与了能量的转移、信号转导、大分子的生物合成、光合作用以及调控呼吸和其他的代谢过程，对植物生长具有重要作用。磷在土壤中主要以复合体、不溶物及有机形式存在，而植物主要以无机磷形式获取磷，因而土壤中的磷难以被植物吸收利用。植物应对低磷环境的胁迫进化出了一系列有效的策略来促进磷的吸收和利用，包括改变根系结构、根系分泌有机酸和磷酸酶、改变生物膜结构及代谢途径，以及与丛枝菌根建立共生关系促进磷的吸收等。

[0003] 丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)是自然界中最古老且分布最广泛的植物共生体。作为活体共生菌，AM真菌从植物体内吸收碳源维持自身的生长，同时AM真菌促进植物吸收矿质元素，植物根系获取的磷几乎都是通过菌根吸收。AM真菌促进植物对磷的吸收和利用有以下三个原因：第一，菌根的根外菌丝扩大了磷的吸收范围；第二，AM真菌在生长过程中可分泌质子和酸性磷酸酶，加快土壤中有机磷的酸化，提高有机磷的含量；第三，AM真菌在低磷条件下激发了菌根特异性植物高亲和力磷转运蛋白的表达，从而提高植物对磷的吸收。

[0004] 植物为了适应低磷的环境，进化出了低亲和力磷转运系统和高亲和力磷转运系统。低亲和力转运蛋白在高磷浓度时发挥作用，高亲和力转运蛋白在低磷浓度时发挥作用，已发现的磷转运蛋白基因主要分为4个家族：PHT1、PHT2、PHT3、PHT4。PHT2、PHT3和PHT4的大部分家族成员为低亲和力磷转运蛋白，而PHT1大部分成员为高亲和力转运蛋白。目前，通过基因组测序和同源基因克隆的方法，已分离鉴定出多个PHT1蛋白。拟南芥的PHT1家族包括9个成员。在番茄、土豆、辣椒和茄子等茄科植物也分别已经分离到了5个成员，其中，PHT1；3受菌根诱导增强表达，PHT1；4和PHT1；5是菌根特异的磷转运蛋白基因，马铃薯的StPT3在菌根共生的根系表达量显著升高，该基因是第一个被克隆并进行功能验证的菌根诱导磷转运蛋白。在单子叶模式植物水稻的13个PHT1家族成员中，OsPT11是第一个鉴定的菌根特异磷转运蛋白，主要在丛枝细胞中表达且蛋白定位在围丛枝膜上；OsPT13是菌根诱导的磷转运蛋白，它参与了菌根共生水稻磷的吸收。双子叶植物苜蓿中发现了OsPT11的同源基因MtPT4，它定位在围丛枝膜上，是AM共生所必需的。

[0005] 以往对磷转运蛋白的研究主要集中在植物对无机磷酸盐的吸收和再分配中的作用，磷转运蛋白在植物防御中的作用鲜有报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基因TaPT16的应用。

[0007] 本发明的再一目的在于提供蛋白TaPT16的应用。

[0008] 根据本发明具体实施方式的丛枝菌根诱导的磷转运蛋白基因TaPT16的应用，可提高小麦对白粉菌抗性。根据本发明具体实施方式的基因TaPT16，其为植物丛枝菌根诱导的磷转运蛋白，来源于普通面包小麦(Triticum aestivum)，在NCBI的Genbank中登录号为KX154221.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

[0009] ATGTTCACGACCTGGCCTGCGAGGAGGCACGCGTGCAGCTCCCTCTTCTGCCACCTCCATGGCGCCGGGAGCGCCTTGCTGTACCGCGTGCTGGACGCGGTGACGTCGGTGAAATGCGAGACGCGGCGGGCTCGCAAGCAGGTCAAGGTGCTCGAGGCCCTCGACGTCGCCGGGACGCAGCTGTACCACTTCACCACCATCGTCATCGCCGGCATGGGCTTCTTCACGGACGCCTACGACCTGTTCTCGGTCTCCCTCATCGCCGACCTCCTGGGCCGCATCTACTACCACTCGGCGGATGGCAGGCTCCCCGGTAACGTTGCCGGCGCCGTCAGCGGCGTGGCGCTCTGCGGCACGGTCCTGGGGCAGCTCTTCTTCGGCTGGCTCGGCGACAGGATGGGGCGGAAGCTGATCTATGGCGTCACGCTCAAGCTCATGGTGGTGTGCTCGCTCGCGTCCGGCCTCTCCTTCCACAACAAGCCCAAGTGCGTCGTAGCCACGTTGTGCTTCTTCCGCTTCTGGCTCGGCTTCGGCGTCGGCGGCGACTACCCGCTTTCGGCCACCATCATGTCTGAGTATGCCAACAAGAGGACTCGCGGAGCCTTCATAGCAGCAGTCTTCGCTATGCAGGGTCTTGGGAACCTGGCTGCTGGGGCTGTTGTTCTGGTGCTCTCTGCGAGCTTCAAGAACACGGCCGCGTACGATACCGACCAGCTCGGGCAAGCAGACTACGTGTGGCGCATAGTACTCATGCTCGGCGCCGTTCCTGCCCTGCTCACCTACTACTGGCGCATGAAGATGCCTGAGACGGCGCGCTACACCGCGCTCATCGCCAAGAACCTCAAGCTAGCGGCATCTGACATGGCCGCGGTCCTCGAAATCGACTTTGTGTCCGACATGGATGCGGAGGCCGTCGTTAAGCAAGACGAGTTTGGCCTCTTCTCCATGGAGTTCCTTCACAAGCATGGCCGCCAGCTCCTCGGAACYACCGTGTGCTGGTTCGTCCTYGACGTCGTCTTCTACTCCCTCAACCTCTTCATGAAGGACATCTTCAGCGGCATCGGCTGGTTTGGAGACGCGGCCGAGATGAGCCCTCTCGAGCAGACCTACAAGATAGCCCGCACGCAGGCCATCATCGTGGTCGGCGGTTCCCTGCCAGGGTACTTCCTCACTGTCCTCTTCGTTGACCGCATCGGCCGCATCAAGATCCAGCTCATGGGGTTCATCATGATGACCATCTTCATGATCGGGCTTGCCGCGCCCTACAAGTTATGGTCCAAACCCAGCATGCACGCAGGCTTCGCCATCATGTATGCATTGATCCTCTTCTTCGCAAACTTCGGCCCCAACTCCACCACCTTCATCCTGCCCACCGAGATATTCCCGACGCGGCTGCGGTCGACGTGCAACGGCATATCGGCTGCCGGGGGTAAGTGTGGTGCCATCATCGGTGTTCTCTGGTTCCAGTATTCTCATGCGAGCATCCGGAGCTCTCTCCTTCTTCTGGCAGGGTGCAACCTGGTTGGGGTCATGTTCACTCTTGCCTTGCCGGAATCCAAAGGGATGTCACTCGAGGATATCACCGGGAAAATGGAGGAAGAAAGCGAACCATCTCAAGAATCTGCAACGGTTGCTGAAGTTGAGTTCATCCACAGCATGGAAATTTTGTAA

[0010] 磷转运蛋白基因TaPT16编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2：

[0011] MFTTWPARRHACSSLFCHLHGAGSALLYRVLDAVTSVKCETRRARKQVKVLEALDVAGTQLYHFTTIVIAGMGFFTDAYDLFSVSLIADLLGRIYYHSADGRLPGNVAGAVSGVALCGTVLGQLFFGWLGDRMGRKLIYGVTLKLMVVCSLASGLSFHNKPKCVVATLCFFRFWLGFGVGGDYPLSATIMSEYANKRTRGAFIAAVFAMQGLGNLAAGAVVLVLSASFKNTAAYDTDQLGQADYVWRIVLMLGAVPALLTYYWRMKMPETARYTALIAKNLKLAASDMAAVLEIDFVSDMDAEAVVKQDEFGLFSMEFLHKHGRQLLGTTVCWFVLDVVFYSLNLFMKDIFSGIGWFGDAAEMSPLEQTYKIARTQAIIVVGGSLPGYFLTVLFVDRIGRIKIQLMGFIMMTIFMIGLAAPYKLWSKPSMHAGFAIMYALILFFANFGPNSTTFILPTEIFPTRLRSTCNGISAAGGKCGAIIGVLWFQYSHASIRSSLLLLAGCNLVGVMFTLALPESKGMSLEDITGKMEEESEPSQESATVAEVEFIHSMEIL

[0012] 现有技术在磷转运蛋白OsPT8过表达的水稻植株上接种稻瘟病菌(半活体寄生真菌)和白叶枯病菌(腐生真菌)，发现抑制了正调控抗病基因的转录水平，表明过表达OsPT8降低了对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病性。研究发现，在拟南芥中敲除定位于高尔基体膜的PHT1基因AtPT4；6可增加拟南芥对致病细菌丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)菌株DC3000的抗性，同时AtPT4；1也是假单胞杆菌的负调控因子。本发明的研究结果与以上研究结果不同。

[0013] 本发明确定TaPT16基因为一种丛枝菌根诱导的磷转运蛋白基因，在小麦植株中过表达TaPT16基因的幼苗和成熟期植株均可显著增强对小麦白粉菌的抗性。所述植物为禾本科植物，包括小麦、水稻、玉米、大麦或高粱等。因此，TaPT16基因可用于提高小麦对白粉病的抗性，在植物育种、栽培中具有广阔的应用空间。

附图说明

[0014] 图1显示在不同磷浓度下野生型小麦根系与丛枝菌根共生后TaPT16基因的表达量分析情况。

[0015] 图2显示过表达TaPT16基因纯合株系幼苗增强了对白粉菌的抗病性，其中，A为对照植株和TaPT16过表达植株接种白粉菌的显微分析；B为对照植株和TaPT16过表达植株接种白粉菌发病部位的表型分析；C为对照植株和TaPT16过表达植株接种白粉菌的微菌落统计。

[0016] 图3显示过表达TaPT16基因纯合株系大田盆栽增强了白粉菌的抗病性，其中，A为对照植株和TaPT16过表达植株成熟期接种白粉菌的宏观表型；B为对照植株和TaPT16过表达植株成熟期叶片接种白粉菌表型分析；C为对照植株和TaPT16过表达植株接种白粉菌后的真菌生物量分析。

具体实施方式

[0017] 植物材料和病原菌培养

[0018] 供试的小麦品种为周麦26；丛枝菌根AM为摩西球囊霉(Glomus mosseae,GM)和地表球囊霉(Glomus versiforme,GV)；病原菌为白粉菌。

[0019] 载体：植物过表达载体IPK003。

[0020] 将小麦种子置于放有吸水纸的培养皿上，加入适量蒸馏水，4℃春化处理1w，然后将其放入25℃恒温光照培养箱中，光/暗周期：16h/8h，生长至三叶期。

[0021] 摩西球囊霉和地表球囊霉在宿主植物苜蓿和三叶草中培养生长。

[0022] 白粉菌培养在感病小麦周麦22上，在光照培养箱中培养(光周期16h/8h，温度22℃/20℃，湿度80％)。

[0023] 实施例1

[0024] 菌根及低磷处理

[0025] 将三叶期小麦移植到分别添加了摩西球囊霉和地表球囊霉两种菌根的细沙、蛭石与珍珠岩1：1：1比例混合的培养基质中，菌根接种量为200个孢子/15g。在光周期为16h/8h，温度为18℃/15℃的光照培养箱中生长，所有接种和对照植株每周浇两次1/2的Hoagland营养液、5μMKH2PO4低磷处理、500μMKH2PO4高磷处理，6w后取小麦根部，清水洗净，收获根部样本，液氮速冻后‑80℃保存备用。

[0026] 将菌根及低磷处理、高磷处理的样品采用TRIzol Reagent(invitrogen)分别提取总RNA。

[0027] 以1μg总的RNA做模板，利用cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA，并将提取的RNA反转录为cDNA。

[0028] 以上述不同处理材料的cDNA为模板，进行实时定量PCR反应。用相对定量2‑ΔΔCt法对表达量进行相对定量分析，以小麦的Actin(Gene Bank登录号KC775780)基因作为参照基因。

[0029] TaPht‑myc为已知的丛枝菌根特异的小麦磷转运蛋白，在不接种菌根时(+P‑M)，几乎不表达，接种菌根后表达量显著升高。与TaPht‑myc类似，在低磷没有菌根共生的条件下(‑P‑M)，TaPT16和TaPht‑myc基因表达受到抑制，在不同磷浓度(低磷和高磷浓度)下接种摩西球囊霉和地表球囊霉两种不同菌根后表达量显著升高，如图1所示，与对照相比，TaPT16基因在菌根后表达量升高了约9‑16倍，因此，TaPT16可能为丛枝菌根诱导的小麦磷转运蛋白基因。

[0030] 实施例2在小麦中过表达TaPT16对小麦白粉病的抗性分析

[0031] 为进一步分析TaPT16的功能，克隆TaPT16的全长1671bp构建至以玉米ubiquitin启动子启动的植物载体IPK003中，获得过表达重组载体IPK003‑TaPT16，分别将重组载体和空载体通过热激法转化农杆菌GV3101，通过农杆菌介导的转化法转化至周麦26中，经过筛选获得了5个单拷贝纯合的转基因株系，在野生型周麦26和5个转基因植株三叶期叶片上同时接种新鲜小麦白粉菌孢子，放置于添加85μM苯并咪唑的1％琼脂板上，将平板放置于20℃2
的气候培养箱中孵育4h，然后采用抖落法以适当的密度(约250个分生孢子/cm)轻轻摇动白粉菌新鲜分生孢子接种到叶片上，分别进行接种白粉菌60h和7d取样。TaPT16转基因植株和对照植株叶片在22℃的气候培养箱中培养60h后，将叶段在脱色液(乙醇/乙酸＝1:1(v/v))中脱色12h，之后在考马斯亮蓝R250染液(0.6％，w/v，溶于甲醇)中染色10s，在去离子水冲洗数次后置于BX61显微镜下观察微菌落数指数(每个植株叶片上萌发的孢子大于1000)。
同时，用Canon EOS 600D对接种Bgt7dpi的叶片表型进行观察拍照。

[0032] 在IPK003‑TaPT16和对照植株的叶片接种白粉菌60h后，显微镜下观察发现IPK003‑TaPT16过表达植株叶片上的白粉菌的菌丝数明显少于对照植株叶片，如图2中A所示；对微菌落指数统计分析发现，TaPT16过表达植株显著低于对照植株，如图2中C所示；与显微观察结果一致，接种白粉菌7d后的表型分析表明TaPT16过表达植株叶片上的白色白粉菌丝少于对照植株，如图2中B所示。

[0033] 将TaPT16过表达的5个单拷贝纯合的转基因株系采用盆栽方法在大田种植，进一步分析成熟期转基因植株对白粉菌的抗病性。约在次年四五月份，分别在对照和TaPT16过表达转基因株系叶片接种新鲜的白粉菌孢子，7‑10天后表型结果分析表明与幼苗期接种白粉菌结果一致，与对照相比，TaPT16过表达植株叶片、茎秆和小穗等部位的白粉菌明显少于对照植株，如图3中A和B所示；同时利用荧光定量PCR试验分析对照和TaPT16过表达植株叶片上白粉菌的生物量，提取接种白粉菌叶片的DNA，小麦白粉菌的参照基因选用Bgt的ef‑lα基因(HM538432)，每次定量实验中每个模板进行三次同步扩增与检测，且进行三次生物学重复，引物序列如下：

[0034] Bgt‑EF1a‑F：5’‑GTCGGATTTAACCCCAAGGT‑3’，

[0035] Bgt‑EF1a‑R：5’‑TTTATCGGTAGGGCGACTTG‑3’。

[0036] qRT‑PCR结果表明，TaPT16转基因植株的白粉菌生物量显著低于对照植株，如图3中C所示。以上结果表明TaPT16是小麦白粉菌的正调控因子。

[0037] 实施例3在小麦中过表达TaPT16对小麦茎基腐病的抗性分析

[0038] 为进一步分析TaPT16在小麦与其他病原菌互作中的功能，在TaPT16的5个单拷贝纯合的转基因植株进行小麦茎基腐病致病性分析。首先在马铃薯葡萄糖培养基上接种‑80℃冰箱保存的引起小麦茎基腐病的优势病原菌‑假禾谷镰刀菌菌块，在25℃培养箱中培养3‑5天，挑选长势较好的假禾谷镰刀菌菌块4‑6块于100mL的CMC产孢培养基(羧甲基纤维素
15g/L，硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，酵母提取物1g/L，121℃高压灭菌
20min)，25℃，180rpm摇床培养5‑6天后；在超净台中用三层纱布过滤除去菌饼，倒入50mL离心管中5000rpm离心15min，弃上清，无菌水清洗两次，用2mL的无菌水重悬沉淀，用血球计数
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板计算孢子的数目，将悬浮液稀释至1×10 ，放入4℃冰箱备用或直接接种。分别将对照植
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株和TaPT16的5个转基因植株的种子发芽至1cm左右，将其浸泡入1×10 孢子液中1min，用水清洗种子表面后种入土中，期间控制浇水量，适当干早有利于发病，18‑20天后观察植株的发病情况。结果发现过表达植株与对照植株茎基部变褐腐烂程度相当，无明显差异，表明TaPT16过表达未能增强小麦对茎基腐病的抗性。