一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

摘要

本发明提供一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体的检测试剂盒。通过被检测血清样本与靶抗原peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D(肽基脯氨酰基顺反异构酶D)多肽或其结合片段相接触，发生免疫反应，形成抗原抗体复合物，通过对形成的抗原抗体复合物进行抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG自身抗体的检测。本发明首次在儿童肾病综合征中鉴定了针对抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体，并针对该抗体提供了检测试剂盒。为国内外针对与抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体有关的自身免疫性肾病综合征的鉴别提供一种较好的检测方法。

权利要求

1.一种肽基脯氨酰基顺反异构酶D抗原蛋白在制备用于自身免疫性肾病综合征检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒由肽基脯氨酰基顺反异构酶D抗原蛋白，标记抗体液，包被肽基脯氨酰基顺反异构酶D抗原的固相载体、样本稀释液、抗体稀释液、抗原稀释液、底物显色液、洗涤液、终止液、标准品、阳性质控品和阴性质控品组成；所述肽基脯氨酰基顺反异构酶 D抗原蛋白的序列如SEQ ID：1所示；所述标记抗体液为酶标记、化学发光剂标记或生物素标记的抗人IgG二抗；所述肽基脯氨酰基顺反异构酶D抗原蛋白带有具有生物学或物理功能的标签；所述标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G，或从血清中提取抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体，阴性质控品为健康体检者血清；通过检测患者血清样本中抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体来诊断自身免疫性肾病综合征。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标签为能够与配体特异性地结合的序列或结构域，选用His标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白和荧光标签中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肽基脯氨酰基顺反异构酶 D抗原蛋白经分子筛、亲和层析、离子交换柱或疏水柱纯化。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肽基脯氨酰基顺反异构酶 D抗原蛋白固定在固相载体上，所述固相载体选用硝酸纤维素膜、聚苯乙烯、材料微孔板、生物芯片或磁珠。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用物理吸附或化学结合将肽基脯氨酰基顺反异构酶D抗原蛋白通过直接的方式固定于固相载体上。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗原稀释液为：1xPBS，pH7.40；所述抗体稀释液为：0.15% BSA+0.01M PBS pH7.40；所述样本稀释液为：6%胎牛血清+0.01M PBS pH7.40；所述底物显色液为TMB、鲁米诺、过氧化氢、吖啶酯；所述终止液为：2M 硫酸。

说明书

一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体的检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学技术领域，涉及一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体的检测试剂盒。

背景技术

[0002] 原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是多种因素引起肾小球基底膜通透性增加，进而血浆蛋白滤出增多，从尿液中丢失，并由此造成一系列病理改变的
临床综合症。PNS是儿童常见的肾小球疾病，根据报道其年发病率为1.15～16.9/10,0000。
病理类型表现为微小病变性肾病综合征(minimal change nephrotic syndrome,MCNS)是
其中最常见的，依据PNS对于激素治疗的反应效果，分为激素敏感型(SSNS)、激素依赖型
(SDNS)、激素耐药型(SRNS)。尽管绝大多数患儿对激素治疗反应敏感，预后良好，但仍有约
10％～20％的患儿对激素治疗的反应为依赖或耐药，若不进行其他药物干预治疗，可进展
为肾小球硬化，最终进展为终末期肾病，严重影响患儿健康，家庭及社会难以承担沉重的经
济负担。且该病的发病机制目前尚不十分清楚。PNS其临床症状通常表现为水肿、大量蛋白
尿、低蛋白血症以及高脂血症等，然而引起这些临床表现的病因非常复杂，给明确PNS的诊
断带来困难。因此，若能够寻找到引起PNS确切的病因，那么就能够在病因上对PNS进行尽早
诊断，从而尽早干预与治疗，这将具有重要的临床意义。

[0003] 目前，临床上给予激素和免疫抑制剂进行治疗的绝大多数PNS患儿病情能有所好转，间接地提示了PNS与患者的自身免疫存在密切的联系。众所周知，B淋巴细胞在体液免疫
中发挥着最为重要的作用，然而PNS患儿肾脏的局部在过去数年间缺乏抗体的沉积，因此忽
视了B淋巴细胞介导的体液免疫在PNS疾病中的作用。近年来的研究发现，在复发的激素敏
感型肾病综合征患者中发现外周血中的B细胞的数量显著增加，被活化的B细胞在激素依赖
型肾病综合征患者体内大量增加，然而对于处在缓解期的激素依赖型肾病综合征患者体
内，其B细胞数量明显下降，提示B淋巴细胞功能异常在PNS中扮演着重要的作用。近些年，全
球多地的研究发现，利用特异性针对CD20+B细胞的利妥昔单抗治疗儿童难治性肾病综合征
中取得了显著的治疗效果。然而利用利妥昔单抗治疗SDNS的过程中发现，其清除B细胞的功
效能维持5个月左右，但是在6，7个月的时候，由于B细胞数量回升患者的病情随即复发。由
此提示PNS患者体内发生病理性的B细胞克隆，如果可以鉴别和精准的清除这些病理性的B
细胞克隆，那么对于PNS病情的恢复是有利的，同样也减少了利用利妥昔单抗等方法无差别
的清除B细胞造成体液免疫缺陷的风险。

[0004] 然而，迄今为止，PNS患儿体内病理性B细胞针对的靶抗原仍然不是很清楚。从病理特征上来说，微小病变型肾病或局灶节段性肾小球硬化被认为是由于足细胞功能丧失或改
变，导致大量蛋白尿的足细胞病。足细胞为肾脏肾小球上皮细胞，附着在肾小球的基底膜的
外侧。它是阻止蛋白质丢失的最后屏障，足细胞损伤通常会引起大量的蛋白尿。

[0005] Peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D由肽基脯氨酰异构酶F基因编码的线粒体基质蛋白质，是线粒体通透性转换孔的调控开关。既往通过小鼠的动物实验发现，当敲
低peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D基因，小鼠表现出抵抗缺血再灌注诱导的心
肌损伤；过表达，则表现出心肌肥大，心肌细胞功能下降，可能是通过线粒体途径调控细胞
坏死或通过抗氧化途径发挥作用。Peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D敲除小鼠对
高脂肪饮食诱导的肥胖或肝脂肪变性具有抵抗力(Wang X，et al.Cyclophilin D 
deficiency attenuates mitochondrial perturbation and ameliorates hepatic 
steatosis.Hepatology,2018Jul；68(1):62‑77.)。此外，peptidyl‑prolyl cis‑trans 
isomerase D在人类卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等肿瘤细胞中均出现特异性的表
达。

[0006] 目前peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D与肾脏疾病的关系多集中于急性肾损伤方面的研究。比如，在一项环孢菌素A诱导的急性肾损伤研究中，peptidyl‑prolyl 
cis‑trans isomerase D通过抵抗氧化应激产生肾脏保护作用(Jelena Klawitter，et 
al.Cyclophilin D knockout protects the mouse kidney against cyclosporin A‑
induced oxidative stress.Am J Physiol Renal Physiol，2019Sep；317(3)：F683‑
F694)。在另一项，顺铂诱导的急性肾损伤研究中，peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase 
D通过调节脂肪酸β‑氧化起到保护肾脏的作用。脂肪酸氧化是肾脏的首选能量来源，在急性
肾损伤期间被抑制。Peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D可能在调节整体细胞代谢
(包括葡萄糖和脂肪酸代谢)以及线粒体生物能量学(包括三羧酸循环、电子转运体链和以
组织/器官特异性方式在细胞中的氧化磷酸化)方面发挥关键作用(Hee‑Seong Jang,et 
al.Proximal tubule cyclophilin D regulates fatty acid oxidation in cisplatin‑
induced acute kidney injury.Kidney Int,2020Feb；97(2):327‑339.)。

[0007] 然而，关于peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D与肾病综合征的关系未见报道。在现有技术中，通过检测血清抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体
鉴别出自身免疫性肾病综合征的研究目前也是空白的。

发明内容

[0008] 本发明提供一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体的检测试剂盒，即检测血清抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG自身抗体的检测试剂盒，所述试剂盒
通过与peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D(肽基脯氨酰基顺反异构酶D)抗原蛋白
(特别根据序列识别号SEQ ID NO.1所示)的免疫反应，对被检测样品中的抗体进行检测。

[0009] 本发明所述试剂盒包括：peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白，标记抗体液(酶标记或化学发光剂标记的抗人IgG溶液)，包被peptidyl‑prolyl cis‑trans 
isomerase D抗原的固相载体、样本稀释液，抗体稀释液，抗原稀释液，底物显色液，洗涤液，
终止液，标准品，阳性质控品，阴性质控品。

[0010] 所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示：FADIVPKTAENFRALCTGEKGIGHTTGKPLHFKGCPFHRIIKKFMIQGGDFSNQNGTGGESIYGEKFEDEN
FHYKHDREGLLSMANAGRNTNGSQFFITTVPTPHLDGKHVVFGQVIKGIGVARILENVEVKGEKPAKLCVIAECGE
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IAPEDKAIQAELLKVKQKIKAQKDKEKAVYAKMFA。

[0011] 根据本发明，所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白经分子筛、凝胶过滤层析、亲和层析、离子交换柱、疏水柱纯化。

[0012] 本发明所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白可以是融合蛋白，使用具有生物学或物理功能的标签，特别是N‑末端或C‑末端标签，优选C‑末端标签。这
些标签有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀。优选实施方案中，所述标签为能够与配体特异性
地结合的序列或结构域，所述的标签肽选自：His标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋
白和荧光标签或生物素标签。

[0013] 根据本发明，所述抗原蛋白peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D可表达于细菌如大肠杆菌、真菌酵母、哺乳动物细胞中。

[0014] 在一个优选的实施方案中，本发明所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白是以固定化的形式呈现，术语“经固定化的”是指在水溶液中与不可溶的固体载
体相结合。优选的，通过静电相互作用、疏水相互作用、共价键结合。所述固相载体优选的，
聚苯乙烯、材料微孔板、硝酸纤维素膜、磁珠。

[0015] 所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白固定方式包括可逆的固定方式或不可逆的固定方式。例如，分子通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂
解的二硫键)结合，这种固定是可逆的。另外，如分子通过在水性溶液中不会裂解的共价键
(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，
则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式固定蛋白质：如固定对所述分子具有特异性亲
和力的抗体，然后形成复合物以达到固定分子‑抗体复合物的效果。

[0016] 本发明所述peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白固定方法为直接包被法：(1)抗原通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；
(2)带有羧基功能团的磁微粒带与蛋白质氨基结合，抗原通过化学偶联方式结合在磁微粒
上。

[0017] 所述底物显色液为TMB、鲁米诺、过氧化氢、吖啶酯；所述抗原稀释液为：1xPBS，pH7.40；所述抗体稀释液为：0.15％BSA+0.01M PBS(pH7.40)；所述样本稀释液为：6％胎牛
血清+0.01M PBS(pH7.40)；所述洗涤液为：1xPBS(pH7.40)+0.1Tween‑20；所述终止液为：2M
硫酸。

[0018] 本发明一个实施方案中，所述标准品和阳性质控品，优选的从与人同源的抗原中制备得到，为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗peptidyl‑
prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体作为阳性质控品和标准品，阴性质控品为健康体
检者血清。

[0019] 本发明所述标记抗体液可以是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记抗人IgG、生物素标记抗人IgG、吖啶酯标记抗人IgG。

[0020] 根据本发明，所述被检测样品是含有抗体的液体样品，优选的，胸水、腹水、尿液、全血、血浆，最优选的，血清。所述血清为哺乳动物血清，优选的，人血清。在检测之前，可以
对被检测样品进一步的加工，包括分级分离、离心或富集。

[0021] 本发明是一种将利用基因重组的方法表达并纯化得到的重组蛋白peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D作为试剂盒中的抗原蛋白，然后包被于固相载体上，加入
阳性质控品或标准品或待检血清进行孵育，再加入标记二抗反应后，通过与血清中的抗
peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体结合形成包被抗原peptidyl‑prolyl 
cis‑trans isomerase D‑待检血清抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗
体‑标记抗人IgG抗体复合物，通过光学方法如光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光
信号，进行定性或定量分析血清中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体
浓度的检测试剂盒。

[0022] 应用本发明试剂盒，首次在部分自身免疫性肾病综合征患者体内检测到了一种抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶
抗原为肾小球足细胞上peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D。因此，本发明的试剂盒
可用于抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG自身抗体的检测，为研究自身免
疫性肾病综合征提供依据。

[0023] 与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：

[0024] (1)本发明首次鉴定了针对自身免疫性肾病综合征患者体内抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG自身抗体的存在，并针对该抗体发明了检测试剂盒。目前，国
内外与peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体有关的研究仅限于分子机制研
究，该发明填补了国内外针对peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体检测的
空白。

[0025] (2)本发明试剂盒涉及定性检测血清中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体，其中固相膜免疫定性检测操作简便，试剂用量较少，微量的抗原能
被NC膜极强的吸附能力所吸附，吸附的NC膜可长期保存(‑20℃可保存半年)，且不影响其活
性。适用于大规模筛选。

[0026] (3)本发明涉及磁微粒化学发光免疫分析定量检测试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速
度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂
直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过
起动发光试剂(H2O2、NaOH)0.4s后发射强度即可达到最大，半衰期为0.9s，2s内基本结束，便
于快速检测。

[0027] (4)本发明首次发现在肾病综合征中存在peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG自身抗体，明确了自身免疫性的病因。本发明使该自身免疫性肾病综合征
有了一种无创性的检测方法，相比于现有的肾活检检测方法来说，本发明试剂盒的应用填
补了空白，将会减轻患者的痛苦及经济负担。

附图说明

[0028] 图1：足细胞上的peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D蛋白是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原。图1A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；图
1B：一抗为自身免疫性肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；图1C：靶抗原peptidyl‑
prolyl cis‑trans isomerase D蛋白的质谱鉴定。

[0029] 图2：表达的重组peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白的SDS‑PAGE鉴定图。

[0030] 图3：固相膜免疫试剂盒检测自身免疫性肾病综合征患者血清中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体膜条图。

[0031] 图4：磁微粒化学发光试剂盒检测抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体原理图。

[0032] 图5：抗原蛋白peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D的包被羧基磁微粒示意图。

[0033] 图6：不同肾病病人抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的检出情况，其中NC：健康者；HP：过敏性紫癜；HPN：紫癜性肾炎；IgAN：IgA肾病；NS：自身免疫性肾
病综合征。

[0034] 图7：ROC曲线评估抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体用于检出自身免疫性肾病综合征的应用价值。

具体实施方式

[0035] 以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于阐述本发明而非用于限制本发明的范围。

[0036] 实施例1足细胞上的peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原

[0037] (1)肾小球足细胞总蛋白的提取：培养足细胞株(MPC5)，用PBS洗涤2‑3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris‑HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制
剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心
机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的肾小球足细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓
度测定试剂盒测定收集到的肾小球足细胞总蛋白浓度。(2)二维电泳：提取肾小球足细胞总
蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用自身免疫性肾病综合征病人和健康人的
血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1A，1B。(3)基质辅助激光解吸/电离
飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合
征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上剪下选中的蛋白点，将干燥后
的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μL)进行消化，然后向反应混合物中加入10μL的25mM碳酸氢铵，
37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行
时间质谱分析(MALDI‑TOF‑MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为
peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D蛋白，见图1C。

[0038] 实施例2重组peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白的表达及纯化

[0039] 利用基因工程的方法以编码peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有
His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进
行纯化，最后利用SDS‑PAGE鉴定重组蛋白peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D的分
子量为41KDa，结果见图2。

[0040] 实施例3本发明采用正交试验设计对试剂盒反应条件的优化根据抗原peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D包被浓度(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL四个包
被浓度)、各反应时间(30min、45min)和温度(25℃、35℃)、酶标二抗最佳稀释度(1：100、1：
500、1：1000、1：1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳
性血清和标准阴性血清。选择阳性血清的最高发光值(P)和阴性血清的最低发光值(N)的比
值(P/N)。重复测定的平均P/N值，经统计处理确定最佳包被条件及二抗的最佳稀释度进行
正交优化条件，显著提高了标准阳性血清的阳性检出率。通过正交设计我们得到了本试剂
盒最佳抗原包被浓度为100μg/mL、最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间
45分钟及最佳标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。

[0041] 实施例4用于检测抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

[0042] 4.1用于检测抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG的固相膜免疫试剂盒的组成：

[0043] 1、包被peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白的硝酸纤维素膜，

[0044] 2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，

[0045] 3、抗体稀释液，

[0046] 4、抗原稀释液，

[0047] 5、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，

[0048] 6、洗涤液，

[0049] 7、TMB显色剂，

[0050] 8、终止液。

[0051] 4.2检测步骤如下：

[0052] 4.2.1包被、封闭：抗原用pH7.4的0.01M PBS稀释取10微升点在硝酸纤维素膜上，放置于37℃温箱，30分钟，将硝酸纤维素膜置于板槽中，加入150微升3％BSA放于37℃温盒
中封闭15分钟，吸去封闭液后，用洗涤液洗膜2次。

[0053] 4.2.2血清温育(第一次温育)：取100微升经抗原释液稀释的标准品与被检测血清标本加样于反应槽内，同时做阴性对照与阳性对照，加样器管嘴勿碰触膜表面，注意每加一
份血清更换一个管嘴。将加完样品的反应槽置于摇床上，室温(20‑25℃)孵育45分钟。

[0054] 4.2.3清洗(第一次清洗)：倾倒掉反应槽内的液体，用稀释好的洗涤液冲洗约10秒钟；冲洗时，使洗涤液充分的流过反应槽。重复清洗5次，倾倒液体及冲洗时注意让液体顺着
反应槽流下，避免交叉污染。清洗完后将反应槽甩干。

[0055] 4.2.4二抗工作液温育(第二次温育)：用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，经然后在反应槽内加入6滴(300微升)二抗工作液，置于摇床上室温(20‑25
℃)孵育45分钟。

[0056] 4.2.5清洗(第二次清洗)：过程同步骤3。

[0057] 4.2.6.显色温育(第三次温育)：在试剂条内加入6滴(300微升)显色溶液，置于摇床上室温(20‑25℃)孵育20分钟。

[0058] 4.2.7.终止反应：流水冲洗反应槽，终止反应。

[0059] 4.2.8.判读结果：取出测试条用电吹风吹干(约5分钟)或置于37℃‑50℃烘箱内烘干20分钟以上。进行肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性，(见图3)或将膜条置于显
影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作
为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG水平
进行半定量分析。

[0060] 实施例5用于检测抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的化学发光免疫试剂盒的制备

[0061] 5.1用于检测抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG的化学发光免疫试剂盒的组成：

[0062] 1、包被peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D抗原蛋白的磁微粒溶液，

[0063] 2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，

[0064] 3、样本稀释液，

[0065] 4、吖啶酯标记抗人IgG溶液，

[0066] 5、质控品，

[0067] 6、预激发液，

[0068] 7、激发液，

[0069] 8、洗涤液。

[0070] 5.2检测原理：本试剂盒采用间接法，对人血清中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体检测，整个过程包含两步反应：第一步，将磁珠液与稀释样本混合，特
异性抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体结合到磁珠上，洗涤去除残留
液。第二步，加入吖啶酯标记抗人IgG抗体，形成磁珠‑抗原‑抗peptidyl‑prolyl cis‑trans 
isomerase D‑IgG抗体‑吖啶酯抗体复合物，洗涤去除残留液后，加入预激发液(H2O2)和激发
液(NaOH)进行发光反应，记录发光值，抗体浓度与发光值成正比，通过校准曲线计算浓度测
值(见图4)。

[0071] 5.3本试剂盒固相载体为含羧基官能团的磁微粒。

[0072] 5.4本试剂盒抗原包被方式是羧基磁微粒经过EDC/Sulfo‑NHS活化，与抗原(氨基残基)共价结合，形成磁微粒溶液。包被步骤为：

[0073] a)400微升0.05M磷酸盐缓冲液中加入40微升磁珠原液，混匀8分钟后磁铁分离，弃去上清；

[0074] b)取200微升2％葡聚糖溶液，加入200微升10mg/mL高碘酸钠发生反应；

[0075] c)反应结束后加磷酸盐缓冲液配制的10mg/mL EDC溶液与10mg/mLSulfo‑NHS溶液，混匀60分钟；

[0076] d)磁铁分离，弃去上清，取400微升0.05M磷酸盐缓冲液洗涤磁珠后加入400微升封保液定容保存。

[0077] 将上述活化后的磁珠弃上清，加入预冷的1ml 20mM MES继续清洗磁珠2次；取200μL2mg/mL的抗原蛋白peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D加入到活化好的磁珠中，充
分混匀，室温静置反应16小时；反应结束后，加入含有0.2％Tween20的pH 7.4PBS缓冲液，重
复清洗磁珠2次；然后再加入含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液，至磁珠终
浓度为10mg/mL，充分混匀，室温静置反应30min；反应结束后，弃上清，并用含有0.2％
Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液重悬磁珠，活化磁珠与抗原蛋白peptidyl‑prolyl 
cis‑trans isomerase D交联完成(见图5)。

[0078] 5.5吖啶酯标记抗人IgG溶液，步骤为：

[0079] a)利用二甲基甲酰胺配制2mg/mL吖啶酯溶液；

[0080] b)利用0.2M(PH8.0)碳酸盐缓冲液配制1mg/mL抗人IgG抗体；

[0081] c)取摩尔比为4:1的吖啶酯与抗人IgG抗体混匀搅拌，反应40分钟；

[0082] d)加入20微升含有5％赖氨酸的碳酸盐缓冲液30分钟终止反应；

[0083] e)通过脱盐除杂，得到吖啶酯标记抗人IgG溶液。

[0084] 5.6检测步骤如下：

[0085] 5.6.1将样本按一定比例稀释；

[0086] 5.6.2取稀释后的样本，加入磁微粒液，和样本稀释液，37℃反应12min；

[0087] 5.6.3洗涤液洗涤3次；

[0088] 5.6.4加入吖啶酯标记抗人IgG溶液，37℃反应12min；

[0089] 5.6.5洗涤液洗涤3次；

[0090] 5.6.6加预激发液(H2O2)、激发液(NaOH)进行反应，收集发光测值；

[0091] 5.6.7通过校准曲线计算浓度测值。

[0092] 实施例6各类肾病患者中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的检测情况

[0093] 6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月诊断为自身免疫性肾病综合征的患者，健康对照组选自同时期就诊的健康体检者。血清样本取自肾病综合征患者和健康对照组。
所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。

[0094] 6.2不同肾病病人血清抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者血清中
抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体水平，包括466例肾病综合征、168例
过敏性紫癜、137例紫癜性肾炎、133例IgA肾病及同时期195例健康儿童，结果显示部分自身
免疫性肾病综合征病人中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体阳性，而
紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病病人以及健康儿童中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans 
isomerase D‑IgG抗体为阴性(见图6)。

[0095] 实施例7ROC曲线评估抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体作为一种血清学标志物用于检出自身免疫性肾病综合征患者的价值对实施例6的6.2中的肾病
综合征患者中抗peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体的检测结果采用ROC
曲线进行分析，以判断该抗体检出自身免疫性肾病综合征的价值。结果显示抗peptidyl‑
prolyl cis‑trans isomerase D‑IgG抗体作为一种血清标志物对自身免疫性肾病综合征
患者的检出具有很好的价值，当诊断界值定为大于41.1时，其诊断的敏感性为63.6％，特异
性为68.1％，曲线下面积为0.701(见图7)。