一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型转让专利
申请号 : CN202110146404.1
文献号 : CN113475463B
文献日 : 2023-02-24
发明人 : 孟志鹏 , 刘静 , 童飞 , 胡四平 , 何焕钟
申请人 : 湖州市中心医院
摘要 :
本发明涉及实验动物模型领域，一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型，建立方法包含：（1）COVID‑19刺突蛋白S基因序列构建质粒；（2）质粒转染或原核表达；（3）制备COVID‑19肺损伤动物模型；（4）评估COVID‑19肺损伤动物模型；其中，所述COVID‑19刺突蛋白S基因序列中RBD区域的152位点为一个甘氨酸G。本发明使用RBD区域的152位点为一个甘氨酸G的COVID‑19刺突蛋白S基因序列进行质粒的构建，直接从基因序列的层面针对性地提供了制备新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法，为基础研究和动物实验研究增加了内容，为进一步病理研究、药物和疫苗的研制等提供了更具特异性的动物模型选择。
权利要求 :
1.一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包含以下步骤：（1）COVID‑19刺突蛋白S基因序列构建质粒；
（2）质粒转染或原核表达；所述转染采用磷酸钙转染法；
（3）制备COVID‑19肺损伤动物模型：以BALB/c雄性小鼠作为实验动物，尾静脉注射以原核表达纯化获得的重组RBD蛋白，纯度>0.8；所述重组RBD蛋白的注射剂量为120ug，并使用PBC作为缓冲液；
（4）待步骤（3）完成24小时后，评估COVID‑19肺损伤动物模型；所述评估COVID‑19肺损伤动物模型内容包含炎症因子及乳酸水平、肺损伤评分、肺组织湿干比W/D值；
其中，所述COVID‑19刺突蛋白S基因序列中RBD区域的152位点为一个甘氨酸G；所述RBD区域的125、155、163、171位点分别为亮氨酸L、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q、天冬酰胺N。
2.一种如权利要求1所述的一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法建立的新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型，其特征在于，95ng/L≤IL‑6水平≤120ng/L，且8mmol/L≤乳酸水平≤13.5mmol/L。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型的肺损伤评分不小于2，且不大于4。
4.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型的右肺符合：3≤W/D值≤7。
说明书 :
一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠
模型
技术领域
[0001] 本发明属于实验动物模型领域，具体涉及一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型。
背景技术
[0002] 2019新型冠状病毒肺炎(CoronaVirus Disease 2019,COVID‑19)是由一种新的β冠状病毒‑新型冠状病毒 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS‑CoV‑2)引起的传染病。患者均存在不同程度肺损伤，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和急性致死性肺衰竭，晚期多并发多脏器功能障碍综合征(MODS)以及多脏器功能衰竭(MOF)，是导致COVID‑19患者死亡的重要因素。COVID‑19患者肺部病理学表现为弥漫性肺泡损伤和肺透明膜形成，这些病理改变与SARS极为相似。
[0003] COVID‑19属β冠状病毒（coronavirus），与前coronavirus基因组85%以上同源，含：Orf1ab(复制酶)、S（刺突蛋白）、E（包膜）、M、N等基因。核酸疫苗是将coronavirus蛋白S、M、N、E用基因工程技术连到质粒载体或减毒株中构建。S基因是高度可变基因组热点,使coronavirus有独特的尖峰，呈日冕外观，与宿主ACE2受体强作用介导病毒包膜与靶细胞膜融合，刺激IL‑8上调，以COVID‑19刺突蛋白S为基础的核酸疫苗是研究热点和理想靶标。
[0004] COVID‑19肺部感染造模仍是难点，研究表明S蛋白和质粒可诱导C57BL/6小鼠coronavirus样肺炎，该模型有助于研究COVID‑19发病机制、加快核酸疫苗和药物研制。
[0005] Sirt1是一种依赖NAD的组蛋白去乙酰化酶。为特异性细胞保护蛋白，参与炎症、凋亡等，是调节炎症的重要因子。当sirt1被化学或遗传抑制时，MERS‑CoV的复制减少，表明SIRT1是coronavirus前驱因子，找到其作用靶点，作为核酸诊断标记，在蛋白质水平揭示COVID‑19肺炎机制，对疫苗和药物的开发有极其重要的意义。同时研究表明，冠状病毒包膜棘突蛋白（spike protein，S protein ）决定病毒的宿主趋向性,是介导SARS‑CoV‑2 跨物种入侵宿主细胞的主要抗原蛋白，感染宿主细胞的关键环节是S蛋白的RBD与细胞膜上的人类受体结合，在COVID‑19早期诱导的免疫反应中可能起重要作用,RBD结构是预防和治疗药物开发的重要靶点，是COVID‑19研究的热点，基于RBD结构的疫苗研究也备受关注。RBD蛋白及RBD抗体有望在将来应用于针对SARS‑COV‑2的特异性预防和治疗，在临床上有很好的应用前景。基于此提出本发明，可用于新型冠状病毒所致肺损伤相关领域的基础研究，为探索其致病机理奠定实验动物基础，并且为研究COVID‑19肺损伤的治疗药物以及疫苗的研究奠定一定的基础。
[0006] 在苗晋鑫、宋韶鹤、王峥、苗明三在《中国比较医学杂志》发表的《COVID‑19 动物模型研究进展》一文就2020年上半年COVID‑19动物模型制备情况及各种动物模型的特征与使用范围进行总结分析，其中指出在严重呼吸综合症（SARS）研究中，已经开发出多种hACE2转基因小鼠模型，而Perlman 利用重组 hACE2 的腺病毒载体感染小鼠使小鼠肺细胞表达 hACE2 基因，然后再用 SARS‑CoV‑2 感染该小鼠模型，发现小鼠体重减轻 20%，并出现翘毛症状，但没有小鼠死亡。可见由于疫情所限，小鼠模型开发并不完全，小鼠在遗传水平可操作和完备的免疫学试剂有助于对未来病毒发病机理研究，还有待于进一步的开发。而在申请号为CN202010741718.1中公开了一种急性肺损伤动物模型的建立方法，其中步骤包含：麻醉保定实验动物；盐酸结合机械通气诱导实验动物急性肺损伤；评估急性肺损伤程度，该方法通过盐酸结合机械通气的方法诱导实验动物肺部发生急性病理性损伤，该动物模型表现出急性肺损伤的典型特征：呼吸困难，肺组织水肿和肺组织纤维化等，虽然COVID‑19所致肺损伤的表现不具有特异性，但是为研究新型冠状病毒肺炎的预防、治疗需采用COVID‑19为致病微生物的动物模型，以此使得后续关于COVID‑19的基础研究具有特异性。
发明内容
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的不足，故提供一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型，以解决现有技术中COVID‑19动物模型开发不完全、不具有特异性的问题。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法，所述建立方法包含以下步骤：
[0009] （1）COVID‑19刺突蛋白S基因序列构建质粒；
[0010] （2）质粒转染或原核表达；
[0011] （3）制备COVID‑19肺损伤动物模型；
[0012] （4）评估COVID‑19肺损伤动物模型；
[0013] 其中，所述COVID‑19刺突蛋白S基因序列中RBD区域的152位点为一个甘氨酸G。
[0014] COVID‑19属β冠状病毒（coronavirus），与前coronavirus基因组85%以上同源，含：Orf1ab(复制酶)、S（刺突蛋白）、E（包膜）、M、N等基因。核酸疫苗是将coronavirus蛋白S、M、N、E用基因工程技术连到质粒载体或减毒株中构建。S基因是高度可变基因组热点,使coronavirus有独特的尖峰，呈日冕外观，与宿主ACE2受体强作用介导病毒包膜与靶细胞膜融合，刺激IL‑8上调，以COVID‑19刺突蛋白S为基础的核酸疫苗是研究热点和理想靶标。
[0015] 而COVID‑19肺部感染造模仍是难点，研究表明S蛋白和质粒可诱导C57BL/6小鼠coronavirus样肺炎，该模型有助于研究COVID‑19发病机制、加快核酸疫苗和药物研制。
[0016] 严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS‑CoV）与2019新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS‑CoV‑2)受体结合结构域（Receptor Binding Domain，RBD）的序列、构象和功能，都被相关研究证实有着重要的关系。在SARS‑COV和SARS‑COV‑2两段氨基酸序列（NP_828851.1、 YP_009724390.1）的对比过程中，其中SARS‑COV的 RBD区域对应318‑569区段，SARS‑COV‑2 的RBD区域对应331‑583区段，研究表明SARS‑CoV的S蛋白442、472、479、487以及491位点的残基位于受体复合物界面，对于冠状病毒的跨物种和人与人之间的传播至关重要，而这这5个位点均位于RBD区域。在使用BioEdit软件对RBD区域序列进行比较的过程中发现，这5个重要位点分别对应着SARS‑CoV的RBD区域中的125、155、163、171、175位点和SARS‑CoV‑2的RBD区域中的125、156、164、172、176位点，在SARS‑CoV的RBD区域原基因序列的基础上，SARS‑CoV‑2的152位点插入一个甘氨酸G，导致152位点前后基因序列发生变化，从而出现引起SARS‑CoV‑2与SARS‑CoV重要位点的差异，这些重要位点出现疏水性、三维构象等差异，这也成为SARS‑CoV与SARS‑CoV‑2致病性和致病特点产生差异的重要原因之一。故使用RBD区域的152位点为一个甘氨酸G的COVID‑19刺突蛋白S基因序列进行质粒的构建，直接从基因序列的层面出发制备模型，大大提高了COVID‑19动物模型的特异性，为后续对于新型冠状病毒的基础研究和动物实验研究、以及药物和疫苗的研制提供了更具针对性的选择。
[0017] 作为优选，所述RBD区域的125、155、163、171位点分别为亮氨酸L、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q、天冬酰胺N。
[0018] 在上述的技术方案中，由于RBD区域受到152位点插入的甘氨酸G的影响，五个重要位点以及152位点前后的基因序列受到影响而产生变化，同时虽然RBD结构域为相对保守区域，但研究发现5个重要位点中的前4个都发生了显著变化，125位点的氨基酸由酪氨酸Y转为亮氨酸L，155位点的亮氨酸L转为苯丙氨酸F，163位点的天冬氨酸N转为谷氨酰胺Q，171位点的苏氨酸T转为天冬酰胺N。分析SARS‑COV‑2的RBD区域的艾森伯格疏水性图谱，发现125、155两处位点对应区域的疏水性与SARS‑COV的RBD区域的艾森伯格疏水性图谱所显示的差别很大，SARS‑CoV‑2的125、155位点的疏水性很强，提示更有可能与外界结合，故这段区域的疏水性区别可能是造成造成两者传染能力显著差异的主要因素，故使用RBD区域125、
155、163、171位点分别为亮氨酸L、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q、天冬酰胺N的COVID‑19刺突蛋白S基因序列，来制备动物模型，提高COVID‑19动物模型的特异性和完善性。
155、163、171位点分别为亮氨酸L、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q、天冬酰胺N的COVID‑19刺突蛋白S基因序列，来制备动物模型，提高COVID‑19动物模型的特异性和完善性。
[0019] 作为优选，所述转染采用磷酸钙转染法。
[0020] 作为优选，所述步骤（3）具体步骤为以BALB/c雄性小鼠作为实验动物，尾静脉注射以原核表达纯化获得的重组RBD蛋白,纯度>0.8。
[0021] 基因表达是指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。从基因序列得到蛋白序列的过程中，需要经过转录、RNA剪接、翻译和翻译后修饰等步骤，而此过程可以通过原核细胞亦可通过真核细胞进行。
[0022] 转染是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程，而一般使用的化学方法有：DEAE‑葡聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法，而在上述技术方案中使用磷酸钙法进行转染。磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，首先其试剂易取得，价格便宜，成本较低，而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，另外磷酸钙还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解，从而使用磷酸钙法进行转染能够提高转染的成功率。
[0023] 也可以使用原核表达的方式进行质粒的表达，广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中，是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。直接采用原核表达纯化获得的重组RBD蛋白，简单方便，可以直接购买获得，时间和人力成本降低。
[0024] 进一步优选，所述重组RBD蛋白的注射剂量为50‑200ug。
[0025] 更进一步优选，所述重组RBD蛋白的注射剂量为120ug，并使用PBC作为缓冲液。
[0026] 通过实验发现以7周龄，20‑28g的 BALB／c雄性小鼠作为动物模型，重组RBD蛋白的注射剂量控制在50‑200ug/只，能够达到肺损伤的致病效果，并且小鼠出现明显的SARS‑CoV‑2致病的病理表现，在该剂量下，小鼠的生存率较高，而当重组RBD蛋白的注射剂量为120ug时，小鼠的生存率和转染率最佳，并且出现理想的病理表现和相应的症状表现。
[0027] 作为优选，待所述步骤（3）24小时后，进行所述步骤（4），所述评估COVID‑19肺损伤动物模型内容包含炎症因子及乳酸水平、肺损伤评分、肺组织湿干比W/D值。
[0028] 在尾静脉注射24h后需摘眼球放血处死小鼠，进行小鼠模型的评估，采集血液，分离血清检测炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸水平；分离右肺下叶、肝、肾组织制备病理标本，4%的多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，切片，HE 染色，行组织病理学，光镜下观察病理学结果，并参照文献（S. Crunkhom撰写的《Metabolic disease:exercise hormone fights metabolic disease》）中介绍的方法进行肺组织病理学损伤DAD评分，包括肺泡及间质炎症、水肿、肺泡及间质出血、坏死、肺不张、透明膜形成各0‑4分评分:0分=无损伤，1分=损伤面积的25%;2分= 50%区域受伤;3分= 75%的整个区域;4分=受伤整个区域。右肺中叶计算W/D值，余肺组织置液氮中冻存备用。从多个维度评估动物模型，使得建模更完善。
[0029] 另外还提供一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法建立的新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型，所述动小鼠模型的相关指标满足：95ng/L≤IL‑6水平≤120ng/L，且8mmol/L≤乳酸水平≤13.5mmol/L，8mmol/L≤乳酸水平≤13.5mmol/L。
[0030] 作为优选，所述小鼠模型的肺损伤评分不小于2，且不大于4。
[0031] 作为优选，所述小鼠模型的肺组织符合：3≤W/D值≤7。
[0032] 小鼠作为常用的哺乳类实验动物，由于小鼠体小，饲养管理方便，易于控制，生产繁殖快，研究最深，有明确的质量控制标准，已拥有大量的近交系、突变系和封闭群，因此在各种实验研究中，用量最大，用途最多，成本也较低。而IL‑6 是固有免疫系统对损伤和感染最初反应所表达的重要细胞因子，可用来评价感染严重程度和判断预后。国内专家对COVID‑19的研究中，发现IL‑6高于正常值在重症组的比例（76.19%）明显高于轻症组（30.39%），他们认为IL‑6 是引发2019‑nCoV感染患者炎症风暴中的关键炎症因子之一，故在对于新型冠状病毒致肺损伤动物模型动物评价中将IL‑6水平作为评估的指标之一，控制新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型的IL‑6水平在95ng/L‑120ng/L之间时，此时小鼠表现出肺损伤呼吸急促、困难、少动、耸毛等症状表现及弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合，中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞浸润等病理征，同时其他生命体征较为平稳，适合作为动物模型进行更多研究性实验。
[0033] 研究表明急性肺损伤病情进展及预后与血浆乳酸水平、炎症反应密切相关，其中乳酸作为无氧运动的产物，在肺损伤导致血氧含量不足的情况下，有氧运动的强度不足以将机体内产生的乳酸进一步分解为水和二氧化碳，而导致过度的乳酸在体内堆积，故将乳酸水平作为肺损伤动物模型的重要评估指标之一，当新型冠状病毒致肺损伤小鼠模型的乳酸水平在8mmol/L‑13.5mmol/L之间时，小鼠往往具有肺损伤呼吸急促、困难、少动、耸毛等症状表现及弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合，中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞浸润等病理征，同时其他生命体征较为平稳。
[0034] S. Crunkhom撰写的《Metabolic disease: exercise hormone fights metabolic disease》中介绍了一种肺组织病理学损伤评分的方法，即肺组织病理学损伤评分（DAD），包括肺泡及间质炎症、水肿、肺泡及间质出血、坏死、肺不张、透明膜形成各0‑4分评分:0分=无损伤，1分=损伤面积25%，2分= 50%区域受损，3分= 75%的区域，4分=整个区域。
该评分方法操作简单，广泛应用，在本技术方案中，将肺损伤小鼠模型的DAD评分控制在2‑4之间，此时小鼠表现出持续的轻微或严重的肺损伤的呼吸道症状，表现出与SARS‑CoV‑2致病类似的症状和病理表现，适用于相关动物实验。
该评分方法操作简单，广泛应用，在本技术方案中，将肺损伤小鼠模型的DAD评分控制在2‑4之间，此时小鼠表现出持续的轻微或严重的肺损伤的呼吸道症状，表现出与SARS‑CoV‑2致病类似的症状和病理表现，适用于相关动物实验。
[0035] 本发明的有益之处在于：
[0036] 1、使用RBD区域的152位点为一个甘氨酸G的COVID‑19刺突蛋白S基因序列进行质粒的构建，直接从基因序列的层面针对性地提供了制备新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法，为基础研究和动物实验研究增加了内容；
[0037] 2、本发明所提供的小鼠模型，具有明显的肺损伤症状和病理征，为进一步病理研究、药物和疫苗的研制等提供了更具特异性的动物模型选择。
[0038] 3、本发明制备方法操作简易、流程简单、成本较低；
[0039] 附图说明：
[0040] 图1为SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2的RBD序列比对图；
[0041] 图2为SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2的RBD疏水性结果比对图，其中箭头指向125、155（156）区域，A线为SARS‑CoV的RBD疏水性结果，B线为SARS‑CoV‑2的RBD疏水性结果；
[0042] 图3为实施例3各组炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸水平结果图；
[0043] 图4为实施例3各组DAD评分与右肺中叶W/D值结果图；
[0044] 具体实施方式：
[0045] 本发明公开了一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型，以下更详细地描述本发明。
[0046] 本发明的特征在于使用RBD区域的152位点为一个甘氨酸G的COVID‑19刺突蛋白S基因序列进行质粒的构建，直接从基因序列的层面出发制备动物模型。
[0047] 以下是对本发明的较佳实施例进行说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但下述实施例只是本发明中的较佳实施实例而非限制本发明。
[0048] 实施例1：
[0049] 在NCBI Conserved Domains中搜索SARS‑COV和SARS‑COV‑2两段氨基酸序列（NP_828851.1、 YP_009724390.1），SARS‑COV的 RBD区域对应318‑569区段，SARS‑COV‑2 的RBD区域对应331‑583区段。继续用BioEdit软件对RBD区域序列进行比较， SARS‑CoV的RBD区域中的125、155、163、171、175五个重要位点对应着SARS‑CoV‑2的RBD区域中的125、156、164、
172、176位点（SARS‑CoV‑2的152位点插入一个甘氨酸G）。同时我们也发现虽然RBD结构域为相对保守区域，但5个重要位点中的前4个都发生了显著变化，125位点的氨基酸由酪氨酸Y转为亮氨酸L，155位点的亮氨酸L转为苯丙氨酸F，163位点的天冬氨酸N转为谷氨酰胺Q，171位点的苏氨酸T转为天冬酰胺N，如图1所示。随后分析2个RBD区域的艾森伯格疏水性图谱，发现两者125 、155两处对应区域的疏水性差别很大，SARS‑CoV‑2的125/155位点的疏水性很强，提示更有可能与外界结合，这段区域的疏水性区别可能是造成造成两者传染能力显著差异的因素，而163 、171位置的氨基酸变化并未对疏水性造成影响，如图2所示。
172、176位点（SARS‑CoV‑2的152位点插入一个甘氨酸G）。同时我们也发现虽然RBD结构域为相对保守区域，但5个重要位点中的前4个都发生了显著变化，125位点的氨基酸由酪氨酸Y转为亮氨酸L，155位点的亮氨酸L转为苯丙氨酸F，163位点的天冬氨酸N转为谷氨酰胺Q，171位点的苏氨酸T转为天冬酰胺N，如图1所示。随后分析2个RBD区域的艾森伯格疏水性图谱，发现两者125 、155两处对应区域的疏水性差别很大，SARS‑CoV‑2的125/155位点的疏水性很强，提示更有可能与外界结合，这段区域的疏水性区别可能是造成造成两者传染能力显著差异的因素，而163 、171位置的氨基酸变化并未对疏水性造成影响，如图2所示。
[0050] 实施例2：
[0051] 克隆全长S‑6His Tag基因（RBD区域的125、152、155、163、171位点分别为亮氨酸L、甘氨酸G、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q、天冬酰胺N）至真核表达载体pCDNA3.4中，经过转化E.coil DH5α，去除内毒素的质粒提取试剂盒对重组的pCDNA3.4‑S‑6His Tag载体进行提取。将该重组质粒通过PEI瞬时转染的方式，转染悬浮的HEK‑293细胞，对目的蛋白S‑6His Tag进行表达，后续采用His 6FF的层析填料对表达在细胞上清中的S蛋白进行纯化，得到带His标签的S融合蛋白，将其通过小鼠（BALB／c雄性小鼠，7周龄，20‑28g，浙江省医学科学院提供[动物使用许可证号:SYXK(浙)2019‑0001]）尾静脉注射120ug/300uL（磷酸盐缓冲液），实验动物在25°C下7：00‑20：00的光照条件下维持一个明暗循环，并以标准的实验室饲料和自由饮水喂养，24h后处死。
[0052] 【症状观察】：小鼠注射S蛋白 24h 后，观察其有无咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等症状表现。
[0053] 【炎症因子和乳酸检测】：ELISA法检测细胞裂解液或血清中ROS；一氧化氮（NO）；COVID‑19特异性炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸含量（试剂盒购自江苏酶免实业有限公司），严格按试剂盒说明书进行操作，在酶标仪（wellscan Mk3，芬兰）上测出标准品吸光度后绘制标准曲线，根据测得的样品吸光度数值在标准曲线上读出样品含量。
[0054] 【肺组织病理形态学观察及DAD评分】：取右肺上叶置于10%甲醛中固定24～48 h ，常规冲洗、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋， 连续 5～6 μm厚切片；再将切片进行常规脱蜡、梯度脱水，HE 染色。染色后晾干在用中性树胶封片，采用光镜观察肺组织病理形态学变化。肺组织病理学损伤评分（DAD），包括肺泡及间质炎症、水肿、肺泡及间质出血、坏死、肺不张、透明膜形成各0‑4分评分:0分=无损伤，1分=损伤面积25%，2分= 50%区域受损，3分= 75%的区域，4分=整个区域。
[0055] 【免疫组织化学法检测肺组织蛋白表达】：右肺上叶组织连续 5～6 μm切片，常规脱蜡处理，PBS清洗。S或Cav‑1蛋白单克隆抗体（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）按照1:200稀释，阴性对照选用0.01M PBS液代替一抗染色。每张切片任选5个视野，以细胞胞浆或胞质、胞核中出现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应。
[0056] 小鼠出现呼吸急促、困难、少动、耸毛等症状表现。得到IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸含量的检测结果分别为：65.33±3.39ug/L，110.09±5.28ug/L，38.26±1.44ug/L，56.73±4.92ug/L，121.95±1.17ug/L，9.34±2.06mmol/L，小鼠肺上皮细胞胞质内可见棕色颗粒（以细胞胞浆或胞质、胞核中出现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应），表示重组RBD蛋白在肺组织内分布，肺组织均出现不同程度的病理损伤,大体观察可见点状、片状出血，镜下则表现为弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞浸润；肝组织病理学损伤较重，条索状排列紊乱，肝细胞明显肿胀，细胞核较大，染色质增粗、边集合、细胞水肿、区域弥漫程度广，其他各组小鼠均无异常表现。小鼠DAD评分为：3.4±0.52,并计算右肺中叶W/D值，结果为5.66±1.04。
[0057] 实施例3：
[0058] 选用BALB／c雄性小鼠(7周龄，20‑28g，浙江省医学科学院提供[动物使用许可证号:SYXK(浙)2019‑0001])30只，分笼饲养于清洁、恒温、恒湿、避免强光环境中，标准饲料适应性喂养1周后，进行实验。按随机数字表法分为3组（n=10）：磷酸盐缓冲液空白对照C组，尾静脉注射重组RBD蛋白SRBD组和尾静脉注射重组白蛋白对照RA组。
[0059] C组尾静脉注射PBS液300uL，SRBD组尾静脉注射重组RBD蛋白（购自Raybiotech，230‑01103，Gene ID:QHD43416，纯度>80%）120ug/300uL，RA组尾静脉注射重组白蛋白（购自Raybiotech，268‑11133‑1，Gene ID:213）120ug/300uL，24h后处死。
[0060] 【症状观察】、【炎症因子和乳酸检测】、【肺组织病理形态学观察及DAD评分】、【免疫组织化学法检测肺组织蛋白表达】采用如实施例2所述的具体方法。
[0061] 得到结果如下：SRBD组小鼠出现呼吸急促、困难、少动、耸毛等症状表现，C组和RA组均正常。炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸水平，结果如图3所示。SRBD组肺上皮细胞胞质内可见棕色颗粒。发现C组和RA组肺组织结构均匀完整，肺泡腔结构清晰，间质血管无明显充血，间质及肺泡腔内未见中性粒细胞浸润；SRBD组小鼠肺组织均出现不同程度的病理损伤,大体观察可见点状、片状出血，镜下则表现为弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞浸润。同时C组、RA组小鼠肝细胞呈现索状排列，肝小叶结构清晰可见，可见肝窦畅通。SRBD组肝组织病理学损伤较重，条索状排列紊乱。肝细胞明显肿胀，细胞核较大，染色质增粗、边集合、细胞水肿、区域弥漫程度广，其他各组小鼠均无异常表现。DAD评分结果，右肺中叶W/D值，如图4所示。
[0062] 实施例4：
[0063] 与实施例3的不同之处在于，尾静脉注射重组RBD蛋白的剂量为50ug/300uL。
[0064] 得到结果如下：小鼠出现咳嗽、少动、耸毛等症状表现。炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸水平，结果为42.67±2.33ug/L，65.16±4.92ug/L，31.28±0.76ug/L，30.94±2.64ug/L，101.58±1.19ug/L，5.36±2.19mmol/L。小鼠肺上皮细胞胞质内可见棕色颗粒。小鼠肺组织均出现不同程度的病理损伤,大体观察可见点状、片状出血，镜下则表现为出血，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞浸润。进行DAD评分，结果为：1.4±0.27。右肺中叶计算W/D值，结果为：3.96±0.07。
[0065] 实施例5：
[0066] 与实施例3的不同之处在于，尾静脉注射重组RBD蛋白的剂量为200ug/300uL。
[0067] 得到结果如下：小鼠出现呼吸困难、少动，甚至出现濒死状态等症状表现。炎症因子IL‑2、IL‑6、IL‑8、IL‑10、TNF‑α及乳酸水平，结果为： 74.65±4.44ug/L，125.00±5.16ug/L，47.22±1.32ug/L，67.88±3.02ug/L，133.09±2.60ug/L，13.99±3.17mmol/L。
小鼠肺上皮细胞胞质内可见棕色颗粒。小鼠肺组织均出现不同程度的病理损伤,大体观察可见点状、片状出血，镜下则表现为弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合严重，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞明显浸润。肝组织病理学损伤严重，条索状排列紊乱。肝细胞肿胀严重，细胞核较大，染色质增粗、边集合、细胞水肿、区域弥漫程度广，镜下则表现为出血，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞明显浸润。进行DAD评分，结果为：3.9±0.06。右肺中叶计算W/D值，结果为：6.29±0.70。
小鼠肺上皮细胞胞质内可见棕色颗粒。小鼠肺组织均出现不同程度的病理损伤,大体观察可见点状、片状出血，镜下则表现为弥漫性出血，肺泡塌陷肺间隔断裂、融合严重，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞明显浸润。肝组织病理学损伤严重，条索状排列紊乱。肝细胞肿胀严重，细胞核较大，染色质增粗、边集合、细胞水肿、区域弥漫程度广，镜下则表现为出血，可见中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞、巨噬和组织细胞明显浸润。进行DAD评分，结果为：3.9±0.06。右肺中叶计算W/D值，结果为：6.29±0.70。
[0068] 本文中所描述的具体实施例仅是对本发明作举例说明，而非对本发明的限制，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效组成或等效流程变换，或者直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。