氧烷酰基克林沙星衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一类结构新颖的氧烷酰基克林沙星衍生物，具有以下结构式，n为1或2或3，R为乙酰基、丙酰基、丁酰基或H；抗结核活性实验证实，所有分子都显示较好的活性，其中化合物TM2的活性与活性超强的阳性对照药物克林沙星和莫西沙星相当，化合物TM1的活性甚至是克林沙星的2倍、接近莫西沙星的2倍，TM1和IM1共用具有协同增效的作用；研究还发现，化合物TM1的作用靶点与常规氟喹诺酮类药物的作用靶点不同；研究结果显示，高活性分子有进一步开发的极大潜力，可用于制备抗结核药物。

权利要求

1.氧烷酰基克林沙星衍生物，其特征在于：具有以下结构式：式中，n为1，R为乙酰基或丙酰基。

2.权利要求1所述的氧烷酰基克林沙星衍生物的制备方法，其特征在于：采用液相法或固相法制备氧烷酰基克林沙星衍生物；

所述液相法是将原料IMn与RONa在溶剂中、NaI作用下于40‑70 ℃反应制得氧烷酰基克林沙星衍生物，所述溶剂为丙酮、乙腈或N,N‑二甲基甲酰胺，化学反应式如下：；

所述固相法是将原料IMn与RONa于120‑180 ℃油浴或空气浴加热反应制得氧烷酰基克林沙星衍生物，化学反应式如下：；

原料IMn结构式中n为1，原料RONa化学式中R为乙酰基或丙酰基。

3.权利要求1所述的氧烷酰基克林沙星衍生物在制备抗结核药物中的应用。

4.权利要求1所述的氧烷酰基克林沙星衍生物和N‑氯乙酰基克林沙星即IM1联合用于制备抗结核药物的应用，其特征在于，IM1具有如下结构式：。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述氧烷酰基克林沙星衍生物的结构式中，n为1，R为乙酰基。

说明书

氧烷酰基克林沙星衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物合成技术领域，涉及一类新型克林沙星衍生物、其制备方法、以及在制药中的应用。

背景技术

[0002] 喹诺酮类药物是一类高效、低毒、选择性好且与抗生素无交叉耐药性的药物，长期以来作为一线抗菌药物应用于临床。克林沙星(CLX)为第四代喹诺酮抗菌药物中的“超广谱”候选分子，在国外于1990年代完成III期临床评价，但因存在光毒性及商业原因，最终未申请上市。近10年杨大成等对克林沙星进行结构改造，获得了多种类型的克林沙星新分子，发现了活性非常好、稳定性提高、光毒性减弱或几乎没有的众多先导分子；所研究分子的生物活性，既包括抗菌活性也涉及抗结核活性。前期的研究经验表明，对克林沙星结构进一步改变，有可能继续发现高活性新分子。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于设计合成一类新型克林沙星衍生物，并对其生物活性进行研究，以期获得具有较好生物活性的先导分子，为药物研究提供新品种。

[0004] 经研究，本发明提供如下技术方案：

[0005] 1.氧烷酰基克林沙星衍生物，具有以下结构式：

[0006]

[0007] 式中，n为1或2或3；

[0008] R为乙酰基、丙酰基、丁酰基或H。

[0009] 优选的，式中，n为1，R为乙酰基、丙酰基或丁酰基；n为2或3，R为乙酰基、丁酰基或H。

[0010] 更优选的，式中，n为1，R为乙酰基或丙酰基。

[0011] 2.氧烷酰基克林沙星衍生物的制备方法：当R为乙酰基、丙酰基、丁酰基时，采用液相法或固相法制备氧烷酰基克林沙星衍生物；

[0012] 所述液相法是将原料IMn与RONa在溶剂中、NaI作用下于40‑70℃反应制得氧烷酰基克林沙星衍生物，所述溶剂为丙酮、乙腈或N,N‑二甲基甲酰胺，化学反应式如下：

[0013]

[0014] 所述固相法是将原料IMn与RONa于120‑180℃油浴或空气浴加热反应制得氧烷酰基克林沙星衍生物，化学反应式如下：

[0015]

[0016] 当R为H时，将原料IMn与NaOH在溶剂中反应制得氧烷酰基克林沙星衍生物，所述溶剂为丙酮与水，化学反应式如下：

[0017]

[0018] 原料IMn结构式中n的定义与氧烷酰基克林沙星衍生物结构式中n的定义相同；原料RONa化学式中R的定义与氧烷酰基克林沙星衍生物结构式中R的定义相同。

[0019] 3.氧烷酰基克林沙星衍生物在制备抗结核药物中的应用。

[0020] 4.氧烷酰基克林沙星衍生物和N‑氯乙酰基克林沙星(IM1)联合在制备抗结核药物中的应用。

[0021] 优选的，所述氧烷酰基克林沙星衍生物的结构式中，n为1，R为乙酰基。

[0022] 本发明的有益效果在于：本发明合成了一类结构新颖的氧烷酰基克林沙星衍生物；抗结核活性实验证实，所有分子都显示较好的活性，其中化合物TM2的活性与活性超强的阳性对照药物克林沙星(CLX)和莫西沙星(MOX)相当，化合物TM1的活性甚至是克林沙星的2倍、接近莫西沙星的2倍(MOX是WHO推荐的治疗耐药结核患者的“金标准”之一)，TM1和IM1共用具有协同增效的作用；研究还发现，化合物TM1的作用靶点与常规氟喹诺酮类药物的作用靶点不同。研究结果显示，高活性分子有进一步开发的极大潜力，可用于制备抗结核药物。

附图说明

[0023] 图1为化合物TM1处理下耻垢分枝杆菌谷氨酸降解途径中相关基因表达情况。GabD：MS_5538编码的NADP+琥珀酸半醛脱氢酶；GabT：MSMEG_6685编码的γ‑氨基丁酸酯转氨酶；TM1处理浓度：0.029μg/mL，0.058μg/mL；WT：野生型耻垢分枝杆菌；内参基因:MS_2758(sigA)。

[0024] 图2为化合物TM1抑制细菌生长潜在分子机理示意图。GabD：NADP+琥珀酸半醛脱氢酶；GabT：γ‑氨基丁酸酯转氨酶；GadB：谷氨酸脱羧酶；GABA：γ‑氨基丁酸。

具体实施方式

[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

[0026] 实施例1、中间体N‑氯乙酰基克林沙星(IM1)的制备

[0027]

[0028] 100mL圆底烧瓶中加入克林沙星盐酸盐1mmol和二氯甲烷(DCM)2mL，冰浴冷却，磁力搅拌，加入NaHCO3 3.5mmol，20min后用恒压滴液漏斗滴加2‑氯乙酰氯2.5mmol的DCM溶液2mL，滴毕，‑5℃搅拌反应，薄层层析(TLC)监测至反应完全，加入H2O 15mL和DCM 20mL，用2N HCl调节pH＝2‑3，分液，水相用DCM萃取(15mL×2)，合并有机相，饱和NaCl溶液(15mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸得粗产物，柱层析分离纯化得到粘稠纯品，加乙酸乙酯(EA)5mL溶解，搅拌下加入石油醚(PE)10mL，有大量白色固体析出，抽滤，干燥，得到白色固体即中间体IM1 
0.370g，收率83.6％。其它合成实验结果见表1。

[0029] 表1化合物IM1的其它合成实验结果

[0030]

[0031] 实施例2、中间体N‑氯丙酰基克林沙星(IM2)的制备

[0032]

[0033] 100mL圆底烧瓶中加入CLX盐酸盐1mmol和DCM 2mL，冰盐浴冷却，磁力搅拌，加入NaHCO3 4mmol，20min后用恒压滴液漏斗滴加3‑氯丙酰氯2.5mmol的DCM溶液2mL，滴毕，冰浴搅拌反应，TLC监测至反应完全，加入冰冷的饱和NaCl溶液15mL和DCM 20mL，用2N HCl调节pH＝2‑3，分液，水相用DCM萃取(20mL×2)，合并有机相，0.5N HCl洗涤(10mL×3)、饱和NaCl溶液洗涤(20mL×2)、水洗涤(10mL×1)，无水Na2SO4干燥，旋蒸得粗产物，加EA 5mL溶解，搅拌下加入PE 10mL，有大量白色固体析出，抽滤，干燥，得到白色固体即中间体IM2 0.4g，收率81％。IM2的其它合成实验结果见表2。

[0034] 表2化合物IM2的其它合成实验结果

[0035]

[0036] 实施例3、中间体N‑氯丁酰基克林沙星(IM3)的制备

[0037]

[0038] 100mL圆底烧瓶中加入CLX盐酸盐10mmol和DCM 25mL，‑5℃搅拌，15min后加入NaHCO3 40mmol，10min后用恒压滴液漏斗滴加4‑氯丁酰氯2.8mL与DCM 6mL的混合液，滴毕，‑5℃搅拌反应，TLC监测至反应完全，加入50mL冰冷的饱和NaCl溶液，室温搅拌，用2N HCl调节pH约为2，分液，收集有机相，水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压旋蒸得黄色油状物，加入EA 20mL，搅拌，20min后加入PE 50mL，有白色固体析出，静置，抽滤，干燥，得到黄白色固体即中间体IM3 4.132g，收率88.08％。其它合成实验结果见表3。

[0039] 表3化合物IM3的其它合成实验结果

[0040]

[0041] 实施例4N‑(乙酰氧基)烷酰基克林沙星(TM1,TM4,TM7)的制备‑‑‑‑‑液相法[0042]

[0043] 100mL圆底烧瓶中加入中间体IMn、溶剂和NaI(用量为IMn的5％～10％)，室温搅拌，加入乙酸钠，控温搅拌反应，TLC监测反应进程，反应完全后，加入饱和NaCl溶液，有固体析出，静置，抽滤，柱层析分离纯化(洗脱剂PE:EA＝5:1～1:3,v/v)，旋蒸得黄色固体，真空1 13
干燥，称重，计算收率，以核磁共振氢谱(H NMR)、核磁共振碳谱( C NMR)和高分辨质谱(HR MS)表征结构。结果见表4。

[0044] 表4 IMn与乙酸钠反应的液相法合成结果

[0045]

[0046] 对中间体IMn与乙酸钠的反应溶剂进行了研究，结果显示，在丙酮、乙腈、DCM、四氢呋喃(THF)、N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)这5种溶剂中，丙酮和乙腈的反应效果较好，其中又以丙酮的反应效果最好(见表4)，其它溶剂或是反应不完全(TLC显示有新点生成但主点为原料点)，或是完全不反应(TLC显示原料点未消失且没有新点生成)，因而最终选择丙酮作溶剂。

[0047] 实施例5N‑(丙酰氧基)烷酰基克林沙星(TM2,TM5,TM8)的制备‑‑‑‑‑液相法[0048]

[0049] 100mL圆底烧瓶中加入中间体IMn、溶剂和NaI(用量为IMn的5％～10％)，室温搅拌，加入丙酸钠，控温搅拌反应，TLC监测反应进程，反应完全后，加入饱和NaCl溶液，有固体析出，静置，抽滤，柱层析分离纯化(洗脱剂PE:EA＝5:1～1:3,v/v)，旋蒸得黄色固体，真空1 13
干燥，称重，计算收率，以 H NMR、C NMR和HR MS表征结构。结果见表5。

[0050] 表5 IMn与丙酸钠反应的液相法合成结果

[0051]

[0052] 中间体IMn与丙酸钠的反应，在用丙酮作溶剂时，IM1与IM2的反应效果较好，反应能够完全发生，并且能够以较高的收率得到较纯的目标化合物(见表5)，但IM3的反应差不多不发生；将IM3为原料的反应溶剂改为DMF，虽然反应存在杂点且收率较低，但反应能够完全发生(见表5)。

[0053] 实施例6N‑(丁酰氧基)烷酰基克林沙星(TM3,TM6,TM9)的制备‑‑‑‑‑液相法[0054]

[0055] 100mL圆底烧瓶中加入中间体IMn、溶剂和NaI(用量为IMn的5％～10％)，室温搅拌，加入丁酸钠，控温搅拌反应，TLC监测反应进程，反应完全后，加入饱和NaCl溶液，有固体析出，静置，抽滤，柱层析分离纯化(洗脱剂PE:EA＝5:1～1:3,v/v)，旋蒸得黄色固体，真空1 13
干燥，称重，计算收率，以 H NMR、C NMR和HR MS表征结构。结果见表6。

[0056] 表6 IMn与丁酸钠的液相法合成结果

[0057]

[0058] 中间体IMn与丁酸钠的反应，当用丙酮作溶剂时，原料在较长时间内(>8h)都没有反应(TLC显示原料点未消失且没有新点生成)；将反应溶剂改为DMF，虽然反应存在杂点且收率不高，但反应能够完全发生(见表6)。

[0059] 实施例7N‑(乙酰氧基)烷酰基克林沙星(TM1,TM4,TM7)的制备‑‑‑‑‑固相法[0060]

[0061] 将乙酸钠放入研钵中碾细，然后加入IMn研磨，研细且均匀后，转移至100mL圆底烧瓶中，油浴或空气浴加热反应，TLC监测反应进程，反应完全后，加入饱和NaCl溶液40mL，用2N HCl调节pH至3，加入EA 20mL，分液，水相用EA萃取(20mL×3)，合并有机相，无水Na2SO4干
1 13
燥，旋蒸得黄色固体，真空干燥，称重，计算收率，以 H NMR、C NMR和HR MS表征结构。结果见表7。

[0062] 表7 IMn与乙酸钠反应的固相法合成结果

[0063]

[0064] 实施例8N‑(丙酰氧基)烷酰基克林沙星(TM2,TM5,TM8)的制备‑‑‑‑‑固相法[0065]

[0066] 将丙酸钠放入研钵中碾细，然后加入IMn研磨，研细且均匀后，转移至100mL圆底烧瓶中，油浴或空气浴加热反应，TLC监测反应进程，反应完全后，室温冷却，加入冰冷的饱和NaCl溶液25mL，室温搅拌，加入EA 25mL，分液，水相用EA萃取(20mL×3)，合并有机相，无水1 13
Na2SO4干燥，旋蒸得黄色固体，真空干燥，称重，计算收率，以 H NMR、C NMR和HR MS表征结构。结果见表8。

[0067] 表8 IMn与丙酸钠反应的固相法合成结果

[0068]

[0069] 实施例9N‑(丁酰氧基)烷酰基克林沙星(TM3,TM6,TM9)的制备‑‑‑‑‑固相法[0070]

[0071] 将丁酸钠放入研钵中研细，然后加入IMn研磨，研细且均匀后，转移至100mL圆底烧瓶中，油浴或空气浴加热反应，TLC监测反应进程，反应完全后，室温冷却，加入冰冷的饱和NaCl溶液25mL，室温搅拌，加入EA 25mL，分液，水相用EA萃取(20mL×3)，合并有机相，无水1 13
Na2SO4干燥，旋蒸得黄色固体，真空干燥，称重，计算收率，以 H NMR、CNMR和HR MS表征结构。结果见表9。

[0072] 表9 IMn与丁酸钠反应的固相法合成结果

[0073]

[0074] 实验发现，IMn与乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠的反应，相较于液相法，固相法的反应时间较短、操作较为简便，缺点在于后处理时萃取乳化现象较为严重，破乳需要花费一定的时间且损失产品，导致纯品收率降低。

[0075] 实施例10N‑羟烷酰基克林沙星(TM10,TM11,TM12)的制备

[0076]

[0077] 向100mL圆底烧瓶中加入IMn 0.5mmol和丙酮1mL，溶解，冰浴冷却，加入30％NaOH0.5mL，室温搅拌反应，pH＝13，逐渐析出白色固体，TLC监测反应进程，反应完全后，加入饱和NaCl溶液8mL，用2N HCl调节pH＝3，有固体析出，静置，抽滤，柱层析分离纯化(洗脱1 13
剂PE:EA＝1:3～0:1,v/v)，旋干得淡黄色固体，真空干燥，称重，计算收率，以 H NMR、C NMR和HR MS表征结构。结果见表10。

[0078] 表10 N‑羟烷酰基克林沙星的制备结果

[0079]

[0080] 在N‑羟烷酰基克林沙星(TM10,TM11,TM12)的制备中，还研究了氢氧化锂法(将IMn与LiOH在丙酮和THF中反应)，结果发现，该方法生成杂质较多且收率低，效果不理想。化合物TM1～TM12的结构表征数据如下：

[0081]

[0082] 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ14.20(s,1H),8.85(s,1H),8.00(d,J＝11.4Hz,1H),4.72(s,2H),4.37‑4.31(m,1H),3.84‑3.74(m,1H),3.53(s,2H),3.36‑3.33(m,4H),2.14(s,3H),1.26‑1.23(m,2H),0.92‑0.90(m,2H).

[0083] 13C NMR(151MHz,CDCl3)δ176.63,170.39,165.62,165.54,155.31,153.31,143.84,138.42,123.63,120.37,(111.16,111.03),108.20,61.85,51.07,51.24,45.17,
42.51,42.05,20.98,11.33(2C).

[0084] HR MS calcd for C21H21ClFN3O6,[M+H]+:466.1175,found:466.1175.

[0085]

[0086] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.28(s,1H),8.92(s,1H),8.06(d,J＝11.4 Hz,1H),4.80(s,2H),4.37‑4.34(m,1H),4.16‑4.13(m,1H),3.73(s,2H),3.44‑3.31(m,4H),2.51(q,J＝7.56 Hz,2H),1.33(t,J＝6.24 Hz,3H),1.23‑1.20(m,2H,),1.01‑0.97(m,2H).[0087] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.66,173.66,165.64,165.42,156.97,153.31,(143.91,143.31),138.42,123.68,120.40,(111.18,111.03),108.22,61.72,51.24,
45.15,42.49,42.03,40.61,27.16,11.30(2C),9.44.

[0088] HR MS calcd for C22H23ClFN3O6,[M+H]+:480.1332,found:480.1336.

[0089]

[0090] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.28(s,1H),8.92(s,1H),8.08(d,J＝11.4 Hz,1H),4.80(s,2H),4.37‑4.34(m,1H),4.16‑4.12(m,1H),3.60(s,2H),3.32‑3.43(m,4H),2.47(t,J＝7.4 Hz,2H),1.77‑1.74(m,2H),1.32(t,J＝7.4Hz,3H),1.02‑0.99(m,2H),1.00‑0.94(m,2H).

[0091] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.77,173.22,165.81,165.44,157.27,155.59,152.17,137.84,124.45,120.59,111.93,108.80,61.08,(50.99,50.96),45.31,(42.76,
42.51),41.29,40.77,35.82,18.37,13.63,11.46(2C).

[0092] HR MS calcd for C23H25ClFN3O6,[M+H]+:494.1490,found:494.1496.

[0093]

[0094] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.30(s,1H),8.92(s,1H),8.06(d,J＝11.46 Hz,1H),4.39‑4.32(m,1H),4.17‑4.03(m,1H),3.77(t,J＝7.4 Hz,2H),3.41‑3.38(m,4H),3.07(t,J＝7.4 Hz,2H),2.09(s,3H),1.72‑1.69(m,2H),1.29‑1.22(m,2H),1.01‑0.98(m,J＝7.0 Hz,2H).

[0095] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.78,165.73,157.27,155.59,152.11,143.79,137.88,128.28,127.33,120.46,111.85,108.77,60.50，51.11,46.53,42.58,41.29,+
32.36，29.67，20.99，11.45(2C).HR MS calcd for C22H23ClFN3O6,[M+H] :480.1332,found:480.1338.

[0096]

[0097] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.25(s,1H),8.85(s,1H),8.00(d,J＝11.46 Hz,1H),4.32‑4.25(m,1H),4.15‑4.11(m,1H),3.95‑3.49(m,4H),3.34‑3.30(m,4H),2.22(q,J＝8.0 Hz,2H),1.89‑1.86(m,2H),1.26‑1.20(t,J＝8.0 Hz,3H),0.92‑0.89(m,2H),0.87‑0.80(m,
2H).

[0098] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.79,167.71,165.85,165.76,152.13,132.49,130.85,128.79,128.37,127.29,111.88,108.79,68.17,41.28,38.77,30.39,28.93,
23.78,22.96,14.00,11.45(2C),10.94(s).

[0099] HR MS calcd for C23H25ClFN3O6,[M+H]+:494.1490,found:494.1503.

[0100]

[0101] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.31(s,1H),8.92(s,1H),8.07(d,J＝11.4 Hz,1H),4.39‑4.32(m,1H),4.15‑4.11(m,1H),3.88‑3.64(m,4H),3.36‑3.43(m,2H),2.31(t,J＝7.4 Hz,2H),2.25(t,J＝8.0 Hz,2H),1.89‑1.86(m,2H),1.72‑1.69(m,2H),1.26‑1.20(t,J＝
8.0 Hz,3H),0.92‑0.88(m,2H),0.87‑0.80(m,2H).

[0102] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.78,168.47,165.85,165.76,157.26,155.58,143.89,137.87,128.34,120.45,111.84,108.74,61.05,51.07,46.53,42.61,42.36,
41.31,39.85,36.08,18.37,13.63,11.45(2C).

[0103] HR MS calcd for C24H27ClFN3O6,[M+H]+:508.1645,found:508.1661.

[0104]

[0105] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.33(s,1H),8.94(s,1H),8.06(d,J＝11.4 Hz,1H),4.39‑4.35(m,1H),4.13‑4.11(m,1H),3.72‑3.67(m,4H),3.40(t,J＝7.8 Hz,2H),2.30(t,J＝7.4 Hz,2H),2.12(s,3H),1.87‑1.85(m,2H),1.72‑1.70(m,2H),1.03‑0.99(m,2H),0.89‑
0.86(m,2H).

[0106] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.79,170.43,165.72,157.23,155.61,152.12,143.88,137.87,124.29,120.17,111.86,108.75,51.23,51.17,46.10,44.82,42.28,+
41.30,32.80,11.45(2C).HR MS calcd for C23H25ClFN3O6,[M+H] :494.1488,found:
494.1486.

[0107]

[0108] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.32(s,1H),8.94(s,1H),8.09(d,J＝11.4 Hz,1H),4.42‑4.37(m,1H),4.20‑4.10(m,1H),3.80‑3.61(m,4H),3.41(t,J＝7.8 Hz,2H),2.61(t,J＝7.0 Hz,2H),2.24(q,J＝7.4 Hz,2H),1.87‑1.85(m,2H),1.73‑1.70(m,2H),1.35(t,J＝
7.0 Hz,3H),1.00‑0.97(m,2H),0.80‑0.91(m,2H).

[0109] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.79,170.48,165.82,157.27,155.60,152.12,143.90,137.88,124.31,120.49,111.88,108.79,63.34,51.22,51.14,46.18,44.82,
42.27,41.29,29.81,27.86,18.32,11.45(2C).

[0110] HR MS calcd for C24H28ClFN3O6,[M+H]+:508.1645,found:508.1645.

[0111]

[0112] 1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ14.31(s,1H),8.91(s,1H),8.03(d,J＝11.4 Hz,1H),4.39‑4.34(m,1H),4.15‑4.13(m,1H),3.73‑3.70(m,2H),3.68‑3.66(m,2H),3.41(t,J＝7.2 Hz,2H),2.59(t,J＝7.02 Hz,2H),2.34(t,J＝7.4 Hz,2H),1.87‑1.84(m,2H),1.74‑1.71(m,2H),1.36‑1.30(m,2H),1.03‑0.98(t,J＝7.2 Hz,3H),0.98‑0.94(m,2H),0.90‑0.82(m,
2H).

[0113] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.78,170.50,165.84,157.26,155.58,152.13,143.81,137.87,124.27,112.01,111.85,108.75,63.54,51.16,46.16,44.82,42.26,
41.30,36.20,29.80,24.41,18.45,13.68,11.46(2C).

[0114] HR MS calcd for C25H30ClFN3O6,[M+H]+:522.1801,found:522.1802.

[0115]

[0116] 1H NMR(600 MHz,DMSO)δ14.51(s,1H),8.85(d,J＝4.4 Hz,1H),8.01‑7.94(m,1H),4.44‑4.38(m,1H),4.35‑4.31(m,1H),4.22(s,2H),3.50‑3.35(m,4H),1.87‑1.84(m,
2H),1.26‑1.16(m,2H),1.03‑0.98(m,2H).

[0117] 13C NMR(151 MHz,CDCl3)δ176.62,170.83,165.50,155.29,153.27,143.86,138.41,123.56,120.31,111.15,108.21,60.73,51.32,51.12,44.97,42.54,42.02,11.30(2C).

[0118] HR MS calcd for C19H19ClFN3O5,[M+H]+:424.1070,found:424.1060.

[0119]

[0120] 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ14.31(s,1H),8.91(s,1H),8.04(d,J＝11.4Hz,1H),4.41‑4.33(m,1H),4.35‑4.31(m,1H),3.79(t,J＝7.4Hz,2H),3.43‑3.39(m,4H),2.08(t,J＝
7.4Hz,2H),1.86‑1.84(m,2H),1.37‑1.30(m,2H),1.21‑0.97(m,2H).

[0121] 13C NMR(151MHz,CDCl3)δ176.67,165.53,165.09；153.31,138.44,132.02,129.12,128.71,127.96,(111.18,111.03),108.23；67.93,42.03,38.60,30.30,28.84,+
23.76,22.84,11.30(2C).HR MS calcd for C20H21ClFN3O5,[M+Na]:460.1046,found:
460.1046.

[0122]

[0123] 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ14.30(s,1H),8.91(s,1H),8.04(d,J＝11.4Hz,1H),4.41‑4.33(m,1H),4.35‑4.31(m,1H),3.87(t,J＝7.4Hz,2H),3.77‑3.62(m,4H),2.60(t,J＝
7.02Hz,2H),2.20‑2.13(m,2H),1.86‑1.84(m,2H),1.37‑1.30(m,2H),1.03‑1.97(m,2H).[0124] 13C NMR(151MHz,CDCl3)δ176.75,170.47,165.79,157.25,155.58,152.10,
143.88,137.85,124.30,111.84,108.75,65.51,51.16,46.16,44.80,42.26,41.29,29.80,+
27.86,11.45(2C).HR MS calcd for C21H23ClFN3O5,[M+H]:452.1383,found:452.1382.[0125] 实施例11化合物TM1～TM12的抗结核活性测试

[0126] 本研究测试了化合物TM1‑TM12以及中间体IM1‑IM3的抗结核活性。

[0127] 测试方法如下：试验菌株为耻垢分枝杆菌Mycolicibacterium smegmatis(strain ATCC700084/mc(2)155)；所用培养基为7H9培养基。准确称取待测样品10.0mg，用适宜的溶剂及稀释剂配成浓度为1.0μg/μL的待测液，取1.0μg/μL的待测液，用一次性过滤器(过滤直径为13～30mm)过滤得待测液C。取培养好的野生型耻垢分枝杆菌菌液，在96孔板的第1列加入200μL菌液，第2‑12列分别加入100μL菌液；在第1列的首孔加入待测液C10μL，用移液枪充分吹打使待测物与菌液充分混匀后，吸取100μL加至第2列第一孔，充分吹打使之混匀，再从第2列第一孔吸取100μL加至第3列第一孔，照此重复直至第11列；第12列为100μL菌液的阴性对照。此时每孔待测物浓度从左到右依次为50,25,12.5,6.25,3.12,1.56,0.78,0.39,0.19,0.09,0.05μg/mL，每一块板的最后一列为阴性对照。将接种好的96孔板放入37℃恒温培养箱培养3d，观察孔内细菌生长情况，确定空白无药对照孔的耻垢分枝杆菌正常生长、阴性对照孔无菌生长。将肉眼观察到的没有耻垢分枝杆菌生长的孔中的待测样品最低浓度作为该样品对该细菌的最低抑菌浓度(MIC)。每株菌做3个重复。

[0128] 测试结果见表11。

[0129] 表11化合物TM1‑TM12以及中间体IM1‑IM3对耻垢分枝杆菌的MIC

[0130]

[0131] 分析表11可知，化合物TM1～TM12都具有抗结核活性，其中：TM1的活性最强，是阳性对照药物CLX的2倍、接近MOX的2倍(MIC按摩尔浓度计，后同；MOX是WHO推荐的治疗耐药结核患者的“金标准”之一)，单独测试时TM1的MIC还曾达到0.03906μg/mL(0.084μM)；TM2的活性次之，与CLX和MOX相当；由于CLX和MOX本身抗菌活性很强，而TM1与TM2能比它们的活性更强或相当，显示出进一步开发的极大潜力。

[0132] 构效关系分析发现，TM1～TM3中，含有乙酰氧基的分子(TM1)，其活性强于含有丙酰氧基(TM2)及丁酰氧基(TM3)的分子；同样的，TM4～TM6中，含有乙酰氧基的分子(TM4)，其活性强于含有丙酰氧基(TM5)及丁酰氧基(TM6)的分子；TM7～TM9中，含有丁酰氧基的分子(TM9)活性最强；TM10～TM12中，TM11与TM12的活性相当，强于TM10；中间体IM1～IM3也显示很好活性，其中IM1活性最强，亦即氯代酰基中碳链最短的分子其活性最强。

[0133] 研究还发现，TM1和IM1按照摩尔比1:1共用，具有协同增效的作用。

[0134] 实施例12化合物TM1耐药耻垢分枝杆菌的筛选与靶点基因的鉴定

[0135] (1)耐药耻垢分枝杆菌初筛

[0136] 在本研究中我们利用包含Tn7转座子的噬菌体构建了包含10000株基因突变菌株的耻垢分枝杆菌突变库，将耻垢分枝杆菌突变库中所有突变菌株分别按2.5％接入装有200μL7H9培养基的96孔板中，在7H9培养基中培养2天至OD600≈0.8时，将所有菌株分别按2.5％接种于含有TM1(终浓度为0.08mmol/L)和Tween 80的7H9培养基中，培养1天后，每孔取10μL滴在7H9固体培养基上，37℃恒温培养2天，筛选出生长量较多的耻垢分枝杆菌。

[0137] 7H9培养基：硫酸铵0.5000g，磷酸二氢钾1.0000g，磷酸二钠2.5000g，柠檬酸钠0.1000g，硫酸镁0.0500g，氯化钙0.0005g，硫酸锌0.0010g，硫酸铜0.0010g，谷氨酸
0.5000g，柠檬酸铁铵0.0400g，吡哆醇0.0010g，生物素0.0005g，终溶液浓度为4.7g/L。25℃时的最终pH值为6.6±0.2。

[0138] (2)耐药耻垢分枝杆菌复筛

[0139] 将初筛选出的耻垢分枝杆菌按2.5％接入1mL 7H9培养基中，加入氨苄青霉素(Amp)或卡那霉素(Kan)，以及Tween 80溶液(将Tween 80用去离子水按照体积比1:4稀释制得)，加入比例均为500:1(体积比)，在10mL试管中37℃恒温培养1天至OD600≈0.8，再将菌株按2.5％接种于加有TM1(终浓度为0.08mmol/L)和Tween 80的7H9培养基中，37℃恒温培养2 3 4
0h、4h、8h、12h后，取10μL菌液梯度稀释后滴板(稀释倍数分别为10,10 ,10 ,10)，将平板置于37℃恒温培养箱中培养两天后观察生长情况。结果见表12。

[0140] 表12化合物TM1对耻垢分枝杆菌不同菌株的MIC(μg/mL)

[0141]

[0142] 表12结果显示，无论对敏感菌株(WT，即野生型菌株)还是耐药菌株(M713、M714、M717)，化合物TM1的抑菌活性最强，是超强抗菌药物克林沙星和莫西沙星的5倍或2.5倍，是常用抗结核药物异烟肼的320倍或160倍，活性非常强，值得进一步开发。

[0143] (3)靶点基因的鉴定

[0144] 采用交错式热不对称PCR(TAIL‑PCR)法鉴定已筛选出的3株耐药耻垢分枝杆菌的具体作用靶点基因，设计1种上游引物和4种不同的下游引物(至少有1种引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR)，TAIL‑PCR扩增含有转座子的基因片段。对于每一对引物，TAIL‑PCR反应体系为：菌液2μL；上游引物1μL；下游引物3μL；dNTP 1μL；GC buffer 12.5μL；Taq酶0.5μL；DMSO 1μL；ddH2O 5μL。

[0145] 鉴定结果见表13。

[0146] 表13耐药耻垢分枝杆菌靶点基因鉴定表

[0147]

[0148] 同时，转录组和代谢组数据表明，GabT在化合物TM1的压力下转录水平上调，TM1可以通过上调表达GabT介导谷氨酸降解途径(见图1)。

[0149] 上述鉴定结果表明，化合物TM1的靶点可能为GabT和GabD，TM1可能通过促进谷氨酸降解来抑制细菌生长(见图2)，而常规氟喹诺酮类药物的靶点主要是DNA消旋酶和拓扑异构酶，因此TM1的作用靶点与常规氟喹诺酮类药物的作用靶点不一致。

[0150] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。