本发明公开了聚酮类化合物及其制备方法和应用。本发明所述的聚酮类化合物是从变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的发酵培养物中分离制备得到。经试验证明，化合物对肝癌细胞（SMMC‑7721）、人早幼粒白血病细胞（HL‑60）和人结肠癌细胞（SW480）具有较强的抑制活性，可以用于制备抗肝癌、抗急性早幼粒白血病或抗结肠癌药物。
2.一种权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物是从变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的发酵培养物中分离制备得到，具体包括以下步骤：
（1）制备变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵培养物，将固体发酵培养物用95%乙醇水溶液提取，浓缩提取液得到粗浸膏；
（2）将该粗浸膏与水混合均匀，分别用乙酸乙酯、正乙醇萃取该粗浸膏，得到的乙酸乙酯萃取液经过硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯以体积比为50:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，乙酸乙酯，乙酸乙酯‑甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1依次作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比1:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以二氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf=0.3‑0.4的组分Fr.4；
将组分Fr.4经C‑18反相硅胶柱层析分离，用甲醇‑水按体积比20:80，40:60，55:45，70:
30，85:15，100:0进行梯度洗脱，收集甲醇：水体积比40:60洗脱获得的且经TLC薄层层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf=0.35‑0.45的组分Fr.4C；
将组分Fr.4C经Sephadex LH‑20分离，用二氯甲烷‑甲醇按体积比1:1作为洗脱剂洗脱，收集TLC薄层层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf=0.4的组分Fr.4C‑4；
将组分Fr.4C‑4用HPLC分离纯化得到化合物1，经进一步的手性拆分得到化合物(+)‑1和(‒)‑1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的组分Fr.4C‑4用HPLC分离纯化具体为：将组分Fr.4C‑4经半制备HPLC分离，使用Welch Ultimate XB‑C18柱，流动相为体积比52:48的甲醇‑水，水溶液中含有0.05%的三氟乙酸，流速为2 mL/min，收集保留时间为41 min的洗脱组分，得到化合物1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的手性拆分的具体条件为：手性柱为DAICEL CHIRALPAK IG手性柱，洗脱溶剂正己烷‑异丙醇的体积比为88:12，制备时流速为1 mL/min，(−)‑1和(+)‑1的保留时间分别为21.0 min和30.5 min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）制备变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵培养物具体步骤为：挑取变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在282
℃、120 r/min条件下培养5天，然后取约1×1 cm带有菌丝的琼脂块接种于大米培养基中，
25℃条件下培养30天，制得固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每升通过以下方法配制：将300 g马铃薯去皮切块，加1000 mL蒸馏水，煮沸10 20 min，用纱布过滤，补~
加蒸馏水至1000 mL，加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，加热溶化，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每200 g大米与200 mL水混合灭菌制得。
6.权利要求1所述的聚酮类左旋化合物(+)‑1或其药用盐在制备抗肝癌药物中的应用。
7.权利要求1所述的聚酮类右旋化合物(−)‑1或其药用盐在制备抗肝癌、抗急性早幼粒白血病或抗结肠癌药物中的应用。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1所述的聚酮类化合物或其药用盐作为活性成分。
9.变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958在制备权利要求1所述的聚酮类化合物中的应用。
聚酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，具体涉及聚酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 变灰青霉是一种广泛存在于自然界的青霉属真菌，主要来源有土壤、植物、海洋等。其可产生大量结构多样且具有良好生物活性的次生代谢产物，包括芳香聚酮、杂萜、多
肽、生物碱等各种类型的复杂结构。对其基因组数据分析发现含有大量设计合成聚酮类化
合物的PKS基因，意味着可能产生大量的聚酮类化合物，而到目前为止，从该真菌的发酵物
中被提取分离得到的聚酮类化合物数量还非常有限，因此，对其次生代谢产物的进一步研
究具有很大的潜力。
发明内容
[0003] 本发明的第一个目的是提供具有抑制肿瘤活性的聚酮类化合物。
[0004] 本发明的化合物，其结构如式（І）所示：
[0005] 式（І）。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述聚酮类化合物的制备方法，所述的化合物是从变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的发酵培养物中分离制备得到，具体包
括以下步骤：
[0007] （1）制备变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵培养物，将固体发酵培养物用95%乙醇水溶液提取3‑5次，浓缩提取液得到粗浸膏；
[0008] （2）将该粗浸膏与水混合均匀，分别用乙酸乙酯、正乙醇萃取该粗浸膏3‑5次，合并乙酸乙酯萃取液，将得到的乙酸乙酯萃取液经过硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯以体积比
为50:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，乙酸乙酯，乙酸乙酯‑甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1依次
作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比1:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以二
氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf=0.3‑0.4（硫酸显色剂显色为紫色）的组分Fr.4；
[0009] 将组分Fr.4经C‑18反相硅胶柱层析分离，用甲醇‑水按体积比 20:80，40:60，55:45，70:30，85:15，100:0进行梯度洗脱，收集甲醇：水体积比40:60洗脱获得的且经TLC薄层
层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf=0.35‑0.45（硫酸显色剂显色为紫色）的组分
Fr.4C；
[0010] 将组分Fr.4C经Sephadex LH‑20分离，用二氯甲烷‑甲醇按体积比1:1作为洗脱剂洗脱，收集TLC薄层层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf=0.4（硫酸显色剂显色为紫
色）的组分Fr.4C‑4；
[0011] 将组分Fr.4C‑4用HPLC分离纯化得到化合物1，经进一步的手性拆分得到化合物(+)‑1和(‒)‑1。
[0012] 进一步的，所述的组分Fr.4C‑4用HPLC分离纯化具体为：将组分Fr.4C‑4经半制备HPLC分离，使用Welch Ultimate XB‑C18柱（5 μm, 10 × 250 mm），流动相为体积比52:48
的甲醇‑水，水溶液中含有0.05%的三氟乙酸，流速为2 mL/min，收集保留时间为41 min的洗
脱组分，得到化合物1。
[0013] 进一步的，所述的手性拆分的具体条件为：手性柱为DAICEL CHIRALPAK IG手性柱，洗脱溶剂正己烷‑异丙醇的体积比为88:12，制备时流速为1 mL/min，(−)‑1和(+)‑1的保
留时间分别为21.0 min和30.5 min。
[0014] 进一步的，所述的步骤（1）制备变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵培养物具体步骤为：挑取变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC
3.7958的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，在28℃、120 r/min条件下培养5
2
天，然后取约1×1 cm带有菌丝的琼脂块接种于大米培养基中，25℃条件下培养30天，制得
固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每升通过以下方法配制：将300 g马铃
薯去皮切块，加1000 mL蒸馏水，煮沸10 20 min，用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL，加入
~
20 g葡萄糖和20 g琼脂，加热溶化，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：
按每200 g大米与200 mL水混合灭菌制得。
[0015] 本发明的第三个目的是提供聚酮类左旋化合物(+)‑1或其药用盐在制备抗肝癌药物中的应用。
[0016] 本发明的第四个目的是提供聚酮类右旋化合物(−)‑1或其药用盐在制备抗肝癌、抗急性早幼粒白血病或抗结肠癌药物中的应用。
[0017] 本发明通过实验发现，化合物1对肝癌细胞（SMMC‑7721），人早幼粒白血病细胞（HL‑60）和结肠癌细胞（SW480）具有较强的抑制活性，而且具有对映选择性。其右旋化合物
(−)‑1对人早幼粒白血病细胞（HL‑60）和结肠癌细胞（SW480）显示出较强的抑制活性，而左
旋化合物(+)‑1对这两种癌症细胞抑制效果非常弱。
[0018]
[0019] 本发明的第五个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含上述聚酮类化合物中的至少一种，或其药用盐作为活性成分。
[0020] 本发明的第六个目的是提供变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958在制备聚酮类化合物中的应用。
[0021] 与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0022] 1、经活性研究表明，本发明化合物具有细胞毒活性，右旋化合物(−)‑1对人急性早幼粒白血病细胞和结肠癌细胞具有较强的抑制活性。
[0023] 2、本发明从变灰青霉真菌Penicillium canescens CGMCC 3.7958中分离制备得到聚酮类化合物，该类化合物具有比较显著的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研
究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物。
[0024] 本发明的Penicillium canescens CGMCC 3.7958购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
附图说明
[0025] 图1是化合物1的1H NMR谱；
[0026] 图2是化合物1的13C NMR谱；
[0027] 图3是化合物 1的HR‑ESIMS谱。
具体实施方式
[0028] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0029] 实施例1
[0030] 1、本发明的Penicillium canescens CGMCC 3.7958购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0031] 2、Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵
[0032] 将Penicillium canescens CGMCC 3.7958菌株接种于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）平2
板培养基中，在28℃、120 r/min条件下培养5天，然后取约1×1 cm 带有菌丝的琼脂块接种
于大米培养基（该培养基是通过以下方法配制的：将200 g大米与200 mL水混合，121℃高压
灭菌20 min，冷却制得）中，25℃条件下培养30天，制得Penicillium canescens CGMCC
3.7958的固体发酵培养物。
[0033] 3、化合物的制备
[0034] （1）用95%乙醇水溶液提取Penicillium canescens CGMCC 3.7958的固体发酵培养物，提取24小时，重复提取3‑5次，提取液合并后经回收溶剂，浓缩得到粗浸膏约2 kg；
[0035] （2）将该粗浸膏与水按体积比1:1混合均匀，分别乙酸乙酯、正乙醇萃取该粗浸膏5次，得到乙酸乙酯萃取液350 g，乙酸乙酯萃取液经过硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯以体
积比为50:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，乙酸乙酯和乙酸乙酯‑甲醇以体积比为10:1，5:1，0:
1依次作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比1:1洗脱获得的且经TLC薄层层
析以二氯甲烷：甲醇=20:1 v/v展开得Rf值=0.3‑0.4（硫酸显色剂显色为紫色）的组分Fr.4；
[0036] 将组分Fr.4经C‑18反相硅胶柱层析分离，用甲醇‑水按体积比 20:80，40:60，55:45，70:30，85:15，100:0进行梯度洗脱，收集甲醇：水体积比40:60洗脱获得的且经TLC薄层
层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf值=0.35‑0.45（硫酸显色剂显色为紫色）的组分
Fr.4C；
[0037] 将组分Fr.4C经Sephadex LH‑20分离，用二氯甲烷‑甲醇按体积比1:1作为洗脱剂洗脱，收集TLC薄层层析以二氯甲烷：甲醇=12:1 v/v展开得Rf值约为0.4（硫酸显色剂显色
为紫色）的组分Fr.4C‑4；
[0038] 将组分Fr.4C‑4经半制备HPLC分离（Welch Ultimate XB‑C18，5 μm, 10 × 250 mm），流动相为体积比52:48的甲醇‑水，水溶液中含有0.05%的三氟乙酸，流速为2 mL/min，
等度洗脱约50 min，收集保留时间为41 min的洗脱组分，得到化合物1约16 mg，旋光度和电
子圆二色谱测试分析发现，该化合物1可能为对映体。经进一步的手性拆分，手性拆分的具
体条件为：手性柱为DAICEL CHIRALPAK IG手性柱，洗脱溶剂正己烷‑异丙醇的体积比为88:
12，制备时流速为1 mL/min，等度洗脱约35 min，(−)‑1和(+)‑1的保留时间分别为21.0 min
和30.5 min，得到(−)‑1和(+)‑1。
[0039] 4、化合物的结构鉴定
[0040] 1H‑NMR、13C‑NMR核磁共振谱图用Bruker AscendTM 600M核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷（TMS）为内标；ESI‑MS数据用Thermo Fisher LC‑LTQ‑Orbitrap XL
spectrometer型质谱仪测定；旋光数据用Rudolph Autopol IV automatic polarimeter型
旋光仪测定；紫外光谱用PerkinElmer LAMBDA 35 UV/Vis spectrophotomer分光光度计测
定，其结构鉴定如下：
[0041] 如图1‑3所示，图1是化合物1的1H NMR谱；图2是化合物1的13C NMR谱；图3是化合物1的HR‑ESIMS谱。
[0042] 化合物1的表征数据如下：
[0043] 化合物1的HR‑ESI‑MS（m/z）：411.0680 [M+Na]+，计算值为411.0687。
[0044] 化合物1的旋光数据：(+)‑1: [α]D25 +38.2 (c 0.11, MeOH); (−)‑1: [α]D25 −33.5 (c 0.05, MeOH)。
[0045] 化合物1的结构式及其NMR数据归属如下：
[0046] 表1. 化合物1H‑NMR和13C‑NMR数据（δ in ppm, J in Hz, pyridine‑d5）
[0047]
[0048] 经过上述方法分离的目标化合物1的结构式如式（I）所示：
[0049] 式（I）。
[0050] 实施例2
[0051] 测试化合物1的体外抗肿瘤活性。
[0052] 本实验所检测的人类细胞如下：人早幼粒白血病细胞HL‑60、人结肠癌细胞SW480、肺癌紫杉醇耐药株A549、人肝癌细胞SMMC‑7721、人乳腺癌细胞MCF‑7。
[0053] 1、实验方法
[0054] （1）接种细胞：用含10%胎牛血清的培养液（DMEM）配成单个细胞悬液，以每孔3000~
15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，贴壁细胞提前12 24小时接种培养。
~
[0055] （2）加入待测化合物溶液：化合物1用DMSO溶解，化合物以40 μM浓度初筛，每孔终体积200 μL，每种处理均设3个复孔（MTS溶液20 μL和培养液100 μL的混合液），继续孵育2
~
4 h，使反应充分进行后测定光吸收值。
[0056] （3）显色：37℃培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20 μL和培养液100 μL；悬浮细胞弃100 μL培养上清液，每孔加20 μL的MTS溶液；设3个空白复孔（MTS
溶液20 μL和培养液100 μL的混合液），继续孵育2 4小时，使反应充分进行后测定光吸收
~
值。
[0057] （4）对于抑制率超过50%的肿瘤细胞，以20 μM、4 μM、0.8 μM、0.16 μM、0.032 μM浓度复筛，每孔终体积200 μL，每种处理均设3个复孔，再测定化合物对该肿瘤细胞的IC50值。
[0058] （5）阳性对照化合物：每次实验均设顺铂（DDP）和紫杉醇（Taxol）两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法（Reed and Muench
法）计算化合物的IC50值。
[0059] 2、实验结果如表2所示：
[0060] 表2. 化合物1细胞毒活性测试数据（IC50, in µM）
[0061]
[0062] 由表2所示结果可知，本发明提出的化合物1对肝癌细胞（SMMC‑7721）、人早幼粒白血病细胞（HL‑60）和结肠癌细胞（SW480）具有较强的抑制活性，而且具有对映选择性。其右
旋化合物(−)‑1对人早幼粒白血病细胞（HL‑60）和结肠癌细胞（SW480）显示出较强的抑制活
性，而左旋化合物(+)‑1对这两种癌症细胞抑制效果非常弱。
[0063] 此结果表明：本发明提出的化合物 (+)‑1和(‑)‑1对部分肿瘤细胞有比较显著的细胞毒活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物。
[0064] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改
进和润饰也应视为本发明的保护范围。
