一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽及其应用转让专利
申请号 : CN202110938735.9
文献号 : CN113480626B
文献日 : 2022-06-24
发明人 : 夏庆友 , 孙悦婷 , 林忠英 , 赵萍
申请人 : 西南大学
摘要 :
本发明公开了一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽及其应用，抗氧化多肽含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的多肽，该抗氧化多肽使用5kDa的超滤膜进行分离，得到的抗氧化多肽渗透速率更快，能更好的透过皮肤，并且具有更忧的抗氧化能力和促进细胞增殖作用，具有作为化妆品原料的潜力。
权利要求 :
1.一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽组合物，其特征在于：所述抗氧化多肽组合物由氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的多肽组成。
2.权利要求1所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽组合物在制备抗氧化剂中的应用。
3.权利要求1所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽组合物作为抗氧化剂在制备保护H2O2氧化损伤的化妆品原料中的应用。
4.权利要求1所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽组合物作为抗氧化剂在制备减少细胞内ROS的堆积的化妆品原料中的应用。
5.权利要求1所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽组合物作为抗氧化剂在制备增加细胞内抗氧化酶的水平的化妆品原料中的应用。
说明书 :
一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及多肽领域，具体涉及具有皮肤渗透性的抗氧化多肽，还涉及该丝胶多肽的应用。
背景技术
[0002] 皮肤是具有高代谢活性的组织，具有一些系列的防御机制，为机体提供物理和生化保护，对机体稳态的维持起关键作用。随着年龄的增长，人体皮肤抗氧化防御系统的能力减弱，加之外源环境因素恶化，大量活性氧自由基(ROS)的生成，导致蛋白质、核酸和脂质的氧化损伤，破坏重要的细胞生理过程并诱发突变形成。ROS与抗氧化防御系统之间的不平衡，使皮肤易处于氧化应激状态，从而导致皮肤问题，包括皮肤炎症、红斑、皱纹、痤疮、黑色[109]素等病理性影响等 。抗氧化剂可保护皮肤免受ROS的氧化损伤，现作为化妆品抗氧化剂添加的维生素C、维生素E、烟酰胺以及熊果苷等一系列传统抗氧化剂，具有显著的ROS清除能力，然而仍存在刺激性、弱稳定性以及皮肤渗透性等问题。
[0003] 由于丝胶蛋白具有保湿、美白、抗氧化以及抗炎等诸多功效，因此在化妆品领域备受重视。然而由于丝胶蛋白的分子质量较大，不易透过皮肤，因此其抗氧化性价值的应用有所限制。因此，急需制备渗透性好的丝胶蛋白肽，提高在丝胶蛋白在化妆品领域的应用。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽；本发明的目的之二在于提供所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽在制备抗氧化剂中的应用。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽，所述抗氧化多肽含有的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的多肽。
[0007] 优选的，所述抗氧化多肽的分子量小于5kDa.。
[0008] 2、所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽在制备抗氧化剂中的应用。
[0009] 优选的，所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽作为抗氧化剂在制备保护H2O2氧化损伤的化妆品原料中的应用。
[0010] 优选的，所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽作为抗氧化剂在制备减少细胞内ROS的堆积的化妆品原料中的应用。
[0011] 优选的，所述具有皮肤渗透性的抗氧化多肽作为抗氧化剂在制备增加细胞内抗氧化酶的水平的化妆品原料中的应用。
[0012] 本发明的有益效果在于：本发明公开了一种具有皮肤渗透性的抗氧化多肽，丝胶蛋白多肽组合物的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6所示序列组成，该多肽组合物使用5kDa的超滤膜进行分离，得到的丝胶蛋白多肽组合物渗透速率更快，能更好的透过皮肤，并且具有更忧的抗氧化能力和促进细胞增殖作用，具有作为化妆品原料的潜力。
附图说明
[0013] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0014] 图1为超滤成分示意图。
[0015] 图2为各组分的含量分布。
[0016] 图3为各组分的累积渗透量。
[0017] 图4为各组分的体外抗氧化能力分析(A：FRAP总抗氧化能力；B：·OH清除能力；C：ABTS+·清除能力；D：DPPH·清除能力)。
[0018] 图5为温度对S‑3组分和VC的稳定性影响(A：S‑3组分；B：VC)。
[0019] 图6为pH对S‑3组分(A)和VC(B)的稳定性影响(A:S‑3组分；B:VC)。
[0020] 图7为光照对S‑3组分和VC的稳定性影响。
[0021] 图8为不同浓度的蛋白组分对细胞的毒性测定。
[0022] 图9为H2O2对HaCaT细胞存活率的影响。
[0023] 图10为各组分对H2O2氧化损伤的HaCaT细胞的存活率影响。
[0024] 图11为各组分对H2O2氧化损伤的HaCaT细胞的细胞形态影响。
[0025] 图12为各组分对H2O2氧化损伤的HaCaT细胞的ROS影响。
[0026] 图13为各组分对H2O2氧化损伤的HaCaT细胞的ROS影响。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0028] 实施例1、丝胶蛋白抗氧化肽的分离
[0029] 为了获得抗氧化肽，将蚕茧降解过后过0.2μm滤膜的分子量大于30kDa，分子量介于5kDa到30kDa之间，分子量低于5kDa的丝胶蛋白肽，分别命名为S‑1，S‑2和S‑3组分(图1)。同时，将高压水提丝胶蛋白SS设置为对照组。
[0030] 将分离得到的各组分进行冷冻干燥，经计算，各组分含量在总质量中的占比如图2所示，其中S‑1组分占总体的35％，S‑2组分占总体的13％，S‑3组分含量最多占52％，表明蚕茧中的大部分组分分子量较小(图2)。
[0031] 实施例2、人工膜累积渗透量测定
[0032] 使用广东博溪生物科技有限公司提供的人工膜进行皮肤渗透试验，向Franz扩散池的接受室中加入接受液7.0mL(磷酸盐缓冲液pH 7.2‑7.4)，将人工膜固定于供给室和接受室之间，光面朝向供给室，粗糙面朝向接受室；用取样器通过取样管将1mL接受液注入接受室，排净空气，使人工膜与接受液紧密接触，记录实际体积；向供给室中人工膜上加入5002
μL样品，有效渗透面积S约为1.77cm ，采用一次性枪头将样品自膜中心部位辐射状向边缘均匀涂开，样品设置3个平行；开启电磁搅拌器以300rpm的速度搅拌，保持(32±1)℃恒温水浴，并确保水浴夹层无气泡；分别取2h、4h、8h、24h时间点的样液，采用一次性注射器通过取样管抽取接受液2mL，然后将其置于2mL离心管中，另外每次取样后均补加等量的接受液(磷酸盐缓冲液)。24h渗透结束后，分别对不同实验组各个时间点人工膜上以及膜下所含待测样品的含量进行检测，累积渗透量Q根据以下公式计算：
μL样品，有效渗透面积S约为1.77cm ，采用一次性枪头将样品自膜中心部位辐射状向边缘均匀涂开，样品设置3个平行；开启电磁搅拌器以300rpm的速度搅拌，保持(32±1)℃恒温水浴，并确保水浴夹层无气泡；分别取2h、4h、8h、24h时间点的样液，采用一次性注射器通过取样管抽取接受液2mL，然后将其置于2mL离心管中，另外每次取样后均补加等量的接受液(磷酸盐缓冲液)。24h渗透结束后，分别对不同实验组各个时间点人工膜上以及膜下所含待测样品的含量进行检测，累积渗透量Q根据以下公式计算：
[0033] Q＝Cn×V+∑Ci×V0(i＝1…n‑1)
[0034] 注：Q：累积渗透量；V：接收室中接收液体积；V0：每次取样的体积；Ci：第1次至上次取样时接收液中药物浓度；Cn：第n个取样点测得的样品浓度，透过Franz扩散池原理在体外使用人工膜模拟各组分在人体皮肤上的渗透情况。结果如图3所示，通过对各个时间点的累积渗透量统计发现，随着分子量的减小，各组分透过人工膜的量也随之增加，相比SS，各低分子量组分渗透量明显更多，说明分子量越小的物质越容易透过皮肤；并且组分S‑3的累积渗透量明显比其他组分多，渗透量曲线的斜率也更大，说明组分S‑3的渗透速率更快，进一步表明S‑3组分能更好的透过皮肤，具有作为化妆品原料的潜力。
[0035] 采用质谱检测S‑3组分的氨基酸序列如下：TDGVRSGNFAGF(SEQ ID NO.1)；SASSSKNDNVFVY(SEQ ID NO.2)；FPNGVVASLDNQF(SEQ ID NO.3)；LNSETSNVSQTSK(SEQ ID NO.4)；SVIAGALEYHGVPAY(SEQ ID NO.5)；EADCDPNCRR(SEQ ID NO.6)。
[0036] 实施例3、丝胶蛋白抗氧化肽的抗氧化性和稳定性
[0037] 1)抗氧化性
[0038] 检测S‑1、S‑2、S‑3组分的总抗氧化能力、羟自由基(·OH)清除率、ABTS自由基(ABTS+·)清除率以及DPPH自由基(DPPH·)清除率等4种体外抗氧化能力的检测，进而分析各组分的抗氧化活性，结果如图4所示。结果显示，分别将组分S‑1、S‑2、S‑3和对照SS配制成0.1％、0.5％、1％、2％、和3％(w/v)的浓度，然后分别进行体外抗氧化能力的测定。其中，图
4中A表示的是FRAP总抗氧化能力测定结果，如图所示，随着组分浓度的增加，总抗氧化能力也随之增加，三个组分在3％浓度下的总抗氧化能力相差不大且明显高于SS。图4中B表示的是·OH清除率的测定结果，三个组分的·OH清除率随其浓度增加而增加，其中S‑3的·OH清除率平均值达到87.6633％，明显高于S‑1(mean＝73.5188％)和S‑2(mean＝72.2156％)。而SS清除·OH的能力则随其浓度的增加反而略有降低。图4中C和图4中D分别表示的是ABTS+·清除率和DPPH·清除率的测定结果，随着各组分浓度的增加，ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力也随之增加，三个组分的ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力相差不大，但均明显高于SS。
4中A表示的是FRAP总抗氧化能力测定结果，如图所示，随着组分浓度的增加，总抗氧化能力也随之增加，三个组分在3％浓度下的总抗氧化能力相差不大且明显高于SS。图4中B表示的是·OH清除率的测定结果，三个组分的·OH清除率随其浓度增加而增加，其中S‑3的·OH清除率平均值达到87.6633％，明显高于S‑1(mean＝73.5188％)和S‑2(mean＝72.2156％)。而SS清除·OH的能力则随其浓度的增加反而略有降低。图4中C和图4中D分别表示的是ABTS+·清除率和DPPH·清除率的测定结果，随着各组分浓度的增加，ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力也随之增加，三个组分的ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力相差不大，但均明显高于SS。
[0039] 通过4种体外抗氧化能力的测定，其结果表明高压水提的丝胶蛋白的体外抗氧化活性明显低于各组分，说明经过得到的多肽其抗氧化活性增加；并且分子量相对较小的组分S‑3，其体外抗氧化能力相较于其他组分更加优异，说明随着水解程度的增加，丝胶蛋白多肽的抗氧化能力也随之提高。
[0040] 2)稳定性
[0041] S‑3组分具有人工膜高渗透性、在混合多肽中的高占比、以及优异的抗氧化活性，使得其具有作为化妆品抗氧化剂生产的潜力。然而生物活性肽容易发生脱酰胺、氧化、水解、消旋以及变性等反应。从而导致多肽的不稳定性，以及相关生物活性降低。因此本部分通过检测温度、pH和光照对S‑3组分稳定性的影响，以及研究S‑3组分对化妆品体系稳定性的影响，从而探究了丝胶蛋白抗氧化肽S‑3组分的稳定性。
[0042] (1)温度对S‑3组分稳定性的影响
[0043] 将S‑3组分与对照VC溶液分别置于4℃、25℃、40℃、50℃以及60℃中处理2h、4h以及6h，测得的ABTS+·清除活性保持率如图5所示，其中图5中A表示的是温度对S‑3组分ABTS+·清除活性保持率的影响，5中B表示的是温度对VC ABTS+·清除活性保持率的影响。在不同温度下，随着时间的延长，VC的ABTS+·清除活性逐渐降低，S‑3组分的ABTS+·清除活性则相对更稳定。并且随着温度的增加，VC的ABTS+·清除活性逐渐降低，而S‑3组分的ABTS+·清除活性逐渐升高，推测温度升高可能有利于多肽清除自由基的氨基酸侧链基团暴露。由以上结果可知，温度对S‑3组分的影响比对VC的影响更小，说明S‑3组分在不同温度下具有一定稳定性。
[0044] (2)pH对S‑3组分稳定性的影响
[0045] 在不同pH条件下，S‑3组分与VC的ABTS+·清除活性保持率如图6所示，其中图6中A表示的是pH对S‑3组分ABTS+·清除活性保持率的影响，图6中B表示的是pH对VC ABTS+·清除活性保持率的影响。在强酸强碱条件下，S‑3组分的ABTS+·清除活性相差不大；而VC的ABTS+·清除活性随着pH逐渐增大而逐渐降低，说明pH对S‑3组分的稳定性影响较小。
[0046] (3)光照对S‑3组分稳定性的影响
[0047] 通过对S‑3组分和VC进行光照处理24h及48h后，测得的ABTS+·清除活性保持率如图7所示，在24h内，S‑3组分和VC的ABTS+·清除活性基本无明显变化；48h后，VC的抗氧化性开始下降，而S‑3组分仍保持较稳定的抗氧化性，说明在化妆品使用暴露时间范围内(24h‑48h)，S‑3组分的稳定性基本不受影响。
[0048] 3)细胞毒性实验
[0049] 为检测各组分对皮肤的刺激性，在细胞对数生长期时，取密度为2×105个/mL的HaCaT细胞100μL，加入96孔板的各细胞孔中，在细胞培养箱中培养12h，以确保细胞贴壁后达到一个相对稳定的状态。将2％的各组分以2倍稀释的方式配成8个浓度梯度的受试组，以完全培养基为细胞对照组，每孔上样100μL，培养24h后，用新鲜的PBS将细胞清洗一遍，加入含10％的CCK‑8无血清培养基，置于细胞培养箱中孵育半小时，酶标仪测定OD450，按照以下公式计算细胞存活率：
[0050] 细胞存活率(％)＝[A(加药)‑A(空白)]/[A(0加药)‑A(空白)]×100
[0051] A(加药)：含细胞、药物和CCK‑8的吸光值；
[0052] A(空白)：不含细胞，含培养基和CCK‑8的吸光值；
[0053] A(0加药)：不含药物，含细胞、培养基和CCK‑8的吸光值。
[0054] 检测结果如图8所示。结果显示，三个组分随着浓度的增加，均对细胞的成长产生一定的抑制作用，且各组分对HaCaT细胞的毒性大小为：S‑1>S‑2>S‑3，组分S‑3在较高浓度下才会对HaCaT细胞的生长造成抑制作用，在低浓度(0.125％‑0.0156％)下，S‑3组分还具有促进细胞增殖的作用。
[0055] IC50是药物的半抑制浓度，即在该浓度下有50％的细胞死亡率，IC50越高，表明该药物毒性越低。将图8的数据代入GraphPad Prism 7.04，可计算出三个组分在各浓度下的抑制率。根据该结果，选取细胞存活率为90％(IC10)对应下的浓度进行后续实验，其中S‑1的IC10是0.01％，S‑2的IC10是0.13％，S‑3的IC10是0.42％。
[0056] 为进一步考察各组分在细胞水平上的抗氧化活性，选择使用H2O2处理HaCaT细胞来建立皮肤细胞氧化损伤模型，进一步通过该细胞模型来检测各组分对细胞的抗氧化损伤作用，结果如图9所示。结果显示，用200‑1000μM的H2O2处理HaCaT细胞12h后，细胞存活率随H2O2浓度增加而降低，当H2O2的浓度为600μM时，细胞存活率与对照组相比显著降低，并且该浓度的H2O2对细胞造成的损伤是稳定适中的，因此，我们选用600μM的H2O2来建立细胞氧化损伤模型。
[0057] 丝胶蛋白抗氧化肽各组分预处理对H2O2氧化损伤HaCaT细胞的生存率影响：将不同组分预先加入细胞中共培养，之后再进行氧化损伤，通过对存活率的测定进而反应各组分的抗氧化活性。其结果如图10所示，与H2O2损伤组相比，不同组分以及SS均能显著提高HaCaT细胞的存活率，表现出对H2O2氧化损伤的HaCaT细胞的保护作用；除此之外，通过不同组分处理组与正常细胞组相比发现，S‑3组分相较于其他组分对细胞的保护作用更能使氧化损伤状态下的细胞趋向于正常细胞状态。并进一步通过显微镜观察细胞数量和形态(图11)，其中H2O2损伤组中的细胞数量明显减少且细胞触角回缩；SS与S‑1组分处理组中的细胞数量和形态也明显发生变化；S‑2和S‑3组分处理组中的细胞数量相对更多，与正常细胞组相比，S‑3组分处理组中的细胞在数量和形态上都十分接近，说明S‑3组分能够有效保护HaCaT细胞免受氧化损伤。
[0058] 丝胶蛋白抗氧化肽各组分预处理减少细胞内ROS的堆积：H2O2能够在细胞内产生ROS进而损伤细胞，本部分通过对细胞内的活性氧水平进行测定，进而反应各组分的抗氧化活性。使用各组分和SS预处理细胞12h后，再加入H2O2进行氧化损伤，之后用DCFH‑DA荧光探针装载细胞。检测得到的ROS水平结果如图12所示。结果显示，与H2O2损伤组相比，S‑3组分相较于其他组分显著减少了细胞内ROS的堆积，说明组分S‑3能够通过降低HaCaT细胞内的活性氧堆积，进而保护皮肤免受氧化损伤。
[0059] 丝胶蛋白抗氧化肽各组分预处理对MDA、SOD、CAT的影响：ROS能引起细胞发生脂质氧化，其产物丙二醛(MDA)对皮肤伤害性大。通过检测HaCaT细胞中MDA的水平，进而比较各组分的抗氧化活性。图13中A反应了各处理组中细胞脂质氧化的情况，其中H2O2损伤组中的MDA水平远远高于正常细胞组；各组分处理组与H2O2损伤组相比，MDA含量明显降低，说明各组分能够有效地抑制细胞内的脂质氧化，且S‑1与S‑3组分的抑制作用更加显著。
[0060] 皮肤自身存在一系列的抗氧化酶以抵御氧化损伤。本部分通过检测HaCaT细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)以及过氧化氢酶(CAT)的水平，进而比较各组分的抗氧化活性。图13中B和C分别表示的是SOD和CAT的水平，在氧化应激状态下，S‑3组分相较于其他组分能够显著地增加细胞内抗氧化酶的水平，以减少H2O2带来的氧化损伤。
[0061] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。