抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用

摘要

本发明公开了抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用，属于基因工程技术领域。所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区如SEQ ID NO：2所示。所述单克隆抗体特异性识别的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。所述单克隆抗体或包含所述单克隆抗体的试剂盒在制备检测或者辅助诊断非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的试剂中的应用。本发明公开的单克隆抗体能够特异性的识别并结合CD2v蛋白的线性B细胞表位区域，这为进一步研究CD2v蛋白的生物学功能提供了有价值的工具。

权利要求

1.一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区如SEQ ID NO：2所示。

2.编码如权利要求1所述的单克隆抗体的基因，其特征在于，编码所述单克隆抗体重链可变区基因序列如SEQ ID NO：3所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区基因序列如SEQ ID NO：4所示。

3.包含权利要求2所述的基因的表达载体。

4.包含权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。

5.一种如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的宿主细胞，表达抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体的步骤。

6.一种包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的单克隆抗体作为包被抗体或标记抗体。

8.如权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求7所述的试剂盒在制备检测或者辅助诊断非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。

9.如权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求7所述的试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的试剂中的应用。

说明书

抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。

背景技术

[0002] 非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种巨大而复杂的DNA病毒，是非洲猪瘟(ASF)的病原体，是Asfarviridae属的唯一已知的成员。ASF是家猪中高度传染性的出血性疾病，其发病率和死亡率高达100％。ASFV具有多个天然宿主和贮存库，这进一步加大了ASF的潜在威胁性。鉴于这种跨界动物疾病的巨大风险和威胁，它已被列入世界动物卫生组织(OIE)陆生动物卫生法典，且被定为必须向OIE报告的动物疾病。

[0003] 由于ASFV在全球范围内的经济重要性，自1960年代末以来，一直在尝试开发一种有效，安全的疫苗来保护猪免受ASFV感染。然而，由于ASFV的复杂结构和对病毒蛋白功能的了解有限，世界上尚未开发出针对ASF的安全有效的疫苗，对非洲猪瘟的控制严格依赖于动物检疫。因此，对ASFV的检测及防控至关重要。

[0004] ASFV拥有170‑194kb的大型线性双链DNA(dsDNA)基因组，编码150多种蛋白质。尽管已经从病毒体中鉴定出多达68种结构蛋白，但大多数蛋白的功能尚不清楚。ASFV病毒体具有独特的多层结构，细胞内病毒体由核苷(第一层)，内核壳(第二层)，内膜(第三层)和衣壳(第四层)构成。细胞外病毒体具有额外的外部包膜(第五层)。细胞内和细胞外ASFV病毒体都具有传染性。构成病毒颗粒的结构蛋白分布在这些多层结构中，并在病毒感染中发挥各种作用。病毒结构蛋白抗原特性的鉴定对于理解病毒与宿主之间的相互作用是必不可少的，对于改进ASFV血清学诊断和设计亚单位疫苗或病毒载体疫苗是至关重要的。目前，ASFV具有25个基因型，某些基因的遗传多样性和抗原多样性是造成缺乏针对这种致死性猪疾病的交叉保护疫苗这种情况的主要原因之一。抗原性结构蛋白的多样性也可能会对ASFV感染的可靠诊断产生巨大影响。

[0005] 为了深入研究抗原性结构蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对ASFV病毒感染的准确诊断，本领域仍需要更多能够识别ASFV不同结构蛋白、不同抗原表位的单克隆抗体，为防治ASF提供新方向和新思路。CD2v蛋白由ASFV EP402R基因编码，为ASFV晚期表达跨膜蛋白，具有N端信号肽和单个跨膜结构域。在受感染的动物细胞中能引起红细胞吸附现象，在病毒的传播和复制过程发挥重要作用。因此，ASFV CD2v蛋白是一个良好的靶点，用于ASFV的检测和疫苗的研发都具有良好的应用前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该单克隆抗体能够特异性的识别并结合CD2v蛋白的线性B细胞表位区域，这为进一步研究CD2v蛋白的生物学功能提供了有价值的工具。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0008] 本发明提供一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区如SEQ ID NO：2所示。

[0009] 上述抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体能特异性识别糖基化的CD2v蛋白，进一133 150
步地，其能特异性识别 VKYTNESILEYNWNNSNI 线性B细胞表位区域。

[0010] 本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的线性B细胞表位基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，而仍能保持与非洲猪瘟病毒CD2v蛋白上的具有VKYTNESILEYNWNNSNI序列的肽段特异性结合。

[0011] 本发明还提供一种所述的单克隆抗体特异性识别的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

[0012] 本发明还提供编码所述的单克隆抗体的基因，编码所述单克隆抗体重链可变区基因序列如SEQ ID NO：3所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区基因序列如SEQ ID NO：4所示。

[0013] 本发明还提供包含所述的基因的表达载体。

[0014] 本发明还提供包含所述的表达载体的宿主细胞。

[0015] 本发明还提供一种所述的单克隆抗体的制备方法，包括培养所述的宿主细胞，表达抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体的步骤。

[0016] 本发明还提供一种包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

[0017] 优选的是，该试剂盒中的单克隆抗体作为包被抗体或标记抗体。

[0018] 本发明还提供所述的单克隆抗体或所述的试剂盒在制备检测或者辅助诊断非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。

[0019] 本发明还提供所述的单克隆抗体或所述的试剂盒在制备检测或者辅助诊断非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的试剂中的应用。

[0020] 本发明公开了以下技术效果：

[0021] 本发明公开的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体，是利用慢病毒表达系统在CHO细胞中表达CD2v蛋白，再将纯化的CD2v蛋白作为免疫原，通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备而成。该单克隆抗体能够特异性的识别并结合CD2v蛋白的133‑155位特定的线性B细胞表位区域，特异性强、稳定性好，这为进一步研究CD2v蛋白的生物学功能提供了有价值的工具。本发明公开的检测非洲猪瘟病毒或其CD2v蛋白的检测试剂或试剂盒，能特异性的检测出被ASFV感染的细胞，说明该试剂或者试剂盒特异性强，为临床应用提供实验基础。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0023] 图1为慢病毒包装的荧光检测结果；A：转染24h后pLVX‑CD2v/HEK293T的荧光检测结果；B：转染48h后pLVX‑CD2v/HEK293T的荧光检测结果；

[0024] 图2为稳定表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白CHO细胞系的筛选；A：倒置荧光显微镜下CHO/CD2v细胞；B：FACS检测CHO/CD2v细胞系的荧光率；

[0025] 图3为CD2v蛋白的纯化及鉴定；A:为CD2v蛋白的纯化结果，其中M：Marker；1：细胞培养上清；2：流穿；3：洗杂；4：洗脱；B和C分别为SDS‑PAGE及Western Blot鉴定纯化的CD2v蛋白的糖基化，其中M:Marker；1：重组ASFV‑CD2v蛋白；2：PNGase F处理后的CD2v蛋白；3～4：1～2对应的Western‑blot结果；

[0026] 图4为小鼠多抗血清效价结果；

[0027] 图5为单克隆抗体腹水纯化结果；M：Marker；1：4B11腹水纯化前；2：4B11腹水纯化后；3：5F7腹水纯化前；4：5F7腹水纯化后；5：5H4腹水纯化前；6：5H4腹水纯化后；7：8D5腹水纯化前；8：8D5腹水纯化后；9：12B4腹水纯化前；10：12B4腹水纯化后；

[0028] 图6为纯化后不同单克隆抗体效价测定结果；

[0029] 图7为IFA鉴定单克隆抗体结果；

[0030] 图8为阻断ELISA鉴定单克隆抗体结果；

[0031] 图9为偶联多肽和阳性血清反应性的ELISA检测结果；A：偶联多肽和ASFV阳性猪血清反应性的ELISA检测结果；B：偶联多肽和CD2v阳性鼠血清反应性的ELISA检测结果；

[0032] 图10为偶联多肽和CD2v单克隆抗体反应性的ELISA检测结果。

具体实施方式

[0033] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0034] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0035] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0036] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0037] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0038] 实施例1免疫原的选择和制备

[0039] CD2v蛋白为ASFV的主要结构蛋白，在受感染的动物细胞中能引起红细胞吸附现象，在病毒的传播和复制过程发挥重要作用。抗ASFV CD2v蛋白单克隆抗体的制备以及CD2v蛋白抗原表位的鉴定，对该病的预防与检测具有重要意义。因此，本发明以CD2v蛋白作为免疫原。具体的，免疫原的制备包括如下步骤：

[0040] 1、参考GenBank上发表的China/2018/Anhui XCGQ株(GenBank:AYW34030.1)的序列信息，将信号肽，CD2v蛋白胞外区序列以及6×His标签对应编码区基因按照CHO细胞密码子偏爱性进行优化合成，并将其克隆到pLVX‑IRES‑ZsGreen1慢病毒载体中，构建真核重组表达pLVX‑CD2v‑IRES‑ZsGreen1，简称pLVX‑CD2v。慢病毒的包装在293T细胞进行，简言之：将293T细胞置于Opti‑MEM完全培养基中，37℃培养2h，将pLVX‑CD2v 0.4μg、pMD2.G 0.6μg、psPAX2 1μg加入到200μL jet‑ buffer中，涡旋5s，在超净台中放置10min，加入
293T细胞并轻轻混匀；在转染后6h，用Opti‑MEM培养基取代转染复合物，放置37℃继续培养；48h内观察荧光，从而确定此次转染的效果。继续观察细胞生长状态，待80％及以上细胞破裂脱落时收取培养上清即慢病毒悬液，12000r/min离心10min后备用。慢病毒包装结果如
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图1所示。将收集的慢病毒悬液以体积比为1:1加入到生长密度为1×10/mL的CHO细胞中，细胞培养基为无血清，含4mM L‑谷氨酰胺的SMM CHO‑SI表达培养基，混合培养24h，补加等体积培养基，并继续培养24h，观察荧光，以确认是否转导成功。转导CHO细胞并筛选CHO/CD2v阳性细胞，挑选绿色荧光蛋白表达较多，荧光强度较亮的孔，扩大培养，并1000r/min离心10min，弃上清，PBS重悬细胞。将PBS处理后的细胞通过尼龙网过滤，然后装载到BD FACS Aria III上，通过绿色荧光信号筛选阳性细胞，然后将ZsGreen1阳性(ZsGreen1+)细胞分类并收集在96孔细胞板中，每孔1个细胞，37℃培养。将获得的ZsGreen1阳性单克隆细胞进行3次亚克隆，直到ZsGreen1的阳性率接近100％，将得到的阳性克隆细胞命名为CHO/CD2v(如图2所示)。

[0041] 2、CD2v蛋白的表达及纯化

[0042] (1)细胞的大量培养：将CHO/CD2v细胞接种到50mL的摇瓶中，120rpm培养，通过细胞计数检测细胞的生长密度。当细胞培养密度保持不变时，将50mL摇瓶中的细胞扩大到500mL摇瓶中进行高密度培养，每天进行细胞计数，当细胞密度大于初始密度的1.5倍时开始加入SMS CHO‑SUPI培养基添加液，按1.5％的量加入，每天加入，当细胞密度保持不变，或者细胞的死亡率开始升高时，停止加入SMS CHO‑SUPI培养基添加液，收集细胞悬液，离心收取上清液体。

[0043] (2)收集表达CD2v蛋白的培养上清，12000r/min离心10min。将离心后的上清用0.45μm滤头过滤后，放入冰盒中备用。

[0044] (3)用移液器吸取2mL Ni‑NTA填料加入安装好的蛋白纯化柱上，待Ni填料沉降后，小心加入上垫片；打开控制阀，使20％乙醇流出，并继续用10mL去离子水清洗柱子；

[0045] (4)调节蛋白纯化装置的控制阀使其流速稳定，流速调节完毕后用10mL及以上体积的平衡缓冲液以1mL/min的速度冲洗柱子。

[0046] (5)将滤膜过滤的细胞培养上清分批次滴加到上述平衡好的柱子中，每次5mL，调节控制阀使流速不超过1mL/min，迅速收集穿出液并重复上样2～3次，收集最后一次穿出液，放置‑20℃备用。

[0047] (6)用洗涤缓冲液冲洗柱子，除去杂蛋白。

[0048] (7)最后向柱子中加入10mL洗脱缓冲液，洗脱目的蛋白；调节控制阀，尽量降低液体流穿的速度；将洗脱的液体收集到1.5mL的EP管中，每管1mL，用酶标仪测出每管蛋白的浓度并做好标记，放置‑20℃备用。

[0049] (8)纯化结束后，用20mL的ddH2O清洗镍柱，然后用NaOH溶液(0.1mol/L)再清洗一次柱子，用ddH2O又一次清洗镍柱，最后将镍柱存放在20％的乙醇中，4℃冰箱储存。

[0050] (9)向纯化前细胞培养上清液与纯化后收集的穿出液、洗杂液、洗脱液中加入5×Loading Buffer，并煮沸10min，经12％SDS‑PAGE分析纯化结果。

[0051] 结果如图3所示，洗脱获得的CD2v蛋白在55‑110KDa左右处出现弥散的目的条带，将CD2v蛋白在非变性条件下，用糖苷酶PNGase F在37℃下酶切1h，SDS‑PAGE和Western‑blot分析结果显示CD2v蛋白具有不同程度的糖基化，说明55‑110KDa左右处出现弥散的目的条带均为CD2v蛋白，其纯度较高。

[0052] 实施例2单克隆抗体的制备

[0053] 1、动物免疫

[0054] (1)将免疫原CD2v蛋白中加入弗氏完全佐剂，经乳化后用于首次免疫；

[0055] (2)通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，免疫剂量10μg/只；

[0056] (3)隔3周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；

[0057] (4)三周后，尾静脉采血测定针对CD2v蛋白的特异性抗体效价，选择效价较高的小鼠(如图4所示)，于细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是20μg/只。

[0058] 2、细胞融合及单克隆抗体制备

[0059] 采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；于融合后12天，以CD2v蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞。

[0060] 间接ELISA法步骤：

[0061] (1)用CBS液将CD2v蛋白稀释成浓度为2μg/mL的包被液包被酶标板，100μl/孔，4℃封闭过夜；

[0062] (2)将杂交瘤上清(一抗)用5％的脱脂奶2倍稀释，依次加入酶标板中，50μl/孔，阳性对照为ASFV猪阳性血清，37℃孵育30min；

[0063] (3)弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；

[0064] (4)将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)加入反应孔中，50μl/孔。37℃孵育30min；

[0065] (5)弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；

[0066] (6)每孔加入现配的TMB显色液100μl，暗室反应15min；

[0067] (7)每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应；

[0068] (8)酶标仪读取每孔的OD450值。

[0069] 3、通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆

[0070] 用含10％FBS的RPMI1640完全培养基(1640/10)稀释上述阳性杂交瘤细胞至约1.5cells/ml，每孔100μl加入到预铺有100μl饲养细胞的96孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养6～8天；进一步通过间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞；进行2～3次亚克隆，直至直到获得稳定分泌抗CD2V蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞，将
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筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×10/管进行冻存。

[0071] 4、单克隆杂交瘤细胞株稳定性鉴定

[0072] 将所建立的单克隆杂交瘤细胞株连续培养3个月并反复液氮冻存复苏，从而鉴定杂交瘤细胞的稳定性；结果显示单克隆杂交瘤细胞株稳定性良好。

[0073] 5、体内诱生腹水法制备单克隆抗体

[0074] 选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注5
射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×10个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。

[0075] 实施例3抗体的纯化及鉴定

[0076] 1、饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，操作方法如下：

[0077] (1)取5ml单克隆抗体腹水，加入5ml PBS缓冲液，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5ml，使成为终浓度为20％的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。

[0078] (2)8000r/min，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

[0079] (3)在上清液中加入12.5ml饱和硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。

[0080] (4)8000r/min，离心20min，弃去上清。

[0081] (5)于沉淀中加入10ml PBS缓冲液，使之溶解，再加入5ml饱和硫酸铵溶液，使之成为33％硫酸铵溶液，充分混匀后，静置30min。

[0082] (6)8000r/min，离心20min，弃去上清，以除去白蛋白。

[0083] (7)重复步骤5，2～3次。

[0084] (8)用5ml PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋，4℃下用PBS缓冲液透析，换液4次。

[0085] (9)8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清即为纯化抗体(如图5所示)，测抗体浓度，分装后，‑20℃保存。

[0086] 2、单克隆抗体效价测定

[0087] 间接ELISA测定方法参照实施例2进行，一抗略有不同：将纯化的单克隆抗体用5％的脱脂奶从1:1000开始进行2倍倍比稀释，依次加入酶标板中，50μl/孔，阳性对照为ASFV猪阳性血清，37℃孵育30min；其他步骤参照实施例2进行，ELISA检测结果(如图6所示)显示单5 5
克隆抗体4B11、8D5效价为1:2.56×10 ；单克隆抗体5H4、12B4效价为1:5.12×10，单克隆抗
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体5F7效价为1:1.024×10。

[0088] 本发明还对效价较高的单克隆抗体5F7进行了测序，其结果如下：

[0089] 重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示：

[0090] QESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSSYMPGTGSGNFQETNWNGWATYTTVVALTTTHLSKVESLSLETHPRTSSSCNGILGLLRIQPHITVQDMVTTALPIGAKGPRSPSPQ

[0091] 核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：

[0092] caggagtcaggacctgacctggtgaaaccttctcagtcactttcactcacctgcactgtcactggctactccatcaccagtagttatatgcctggcactggatccggcaatttccaggaaacaaactggaatggatgggctacatacactacagtggtagcactgactacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcaatggaattctgggactactgaggatacagccacatattactgtgcaagatatggtaactacggctttgcctattggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaa

[0093] 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

[0094] LPVRLLVLDVLDSGASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPVDVRWRHQAGNQTGWCCTNCIHLPT[0095] 核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

[0096] ttgcctgttaggctgttggtgctggatgttctggattccggtgcttccagcagtgatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacattaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttcctgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctggtgctgcaccaactgtatccatcttcccacc

[0097] 3、IFA鉴定单克隆抗体与CD2v蛋白的反应性的结果

[0098] 重新构建pTrip‑CD2v‑IRES‑puro重组载体转导HEK293T细胞，与五种不同的单克隆抗体孵育，再加入FITC结合的山羊抗小鼠IgG抗体。

[0099] 结果如图7所示，所有的细胞核都被DAPI染色液染成了蓝色。其中，所有与抗CD2v单克隆抗体孵育的细胞孔中均检测到荧光信号，在阴性对照与空白对照孔中未检测到荧光信号。IFA结果证实了筛选本实验筛选的单克隆抗体与293T细胞瞬时表达的ASFV CD2v蛋白有较好的反应性。

[0100] 4、阻断ELISA鉴定单克隆抗体与CD2v蛋白的反应性

[0101] 将纯化的CD2v蛋白包被在酶标板中，依据间接ELISA步骤进行封闭，洗板；在阻断ELISA中，ASFV阳性猪血清样本用PBS缓冲液稀释，加入上述酶标板中，37℃孵育30min；然后将纯化后的5株单克隆抗体用PBS缓冲液稀释后加入酶标板中，37℃孵育30min；最后加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG/HRP二抗，37℃孵育30min；加入显色液，显色5～10min，通过添加
2mol/L H2SO4停止反应；读取450nm处的吸光度值，记录并分析数据；结果判定：阻断率(percentage inhibition/PI)＝(阴性血清OD450值‑待检血清OD450值)/阴性血清OD450值×
100％。

[0102] 如图8所示，阴性和阳性血清获得的所有单克隆抗体的平均OD值显著不同，其中，单克隆抗体12B4的PI值大于80％，其它单克隆抗体的PI值在52.87％～72.99％之间。表明非洲猪瘟病毒多克隆血清能够阻断所有单克隆抗体的结合。

[0103] 实施例4单克隆抗体识别抗原表位的鉴定

[0104] 1、重叠多肽的设计

[0105] 采用重叠多肽法设计合成15段多肽，覆盖整个胞外区，相邻多肽重叠6个氨基酸。多肽段氨基酸序列如表1所示。

[0106] 表1多肽序列

[0107]

[0108] 2、偶联多肽和阳性血清反应性的ELISA检测结果

[0109] 用与BSA偶连的多肽包被于酶标板，用ASFV阳性猪血清、CD2v阳性小鼠血清与多肽进行间接ELISA检测鉴定单克隆抗体与多肽的反应性，结果如图9所示，多肽P2、P3、P4、P10和P12与ASFV阳性猪血清反应强烈，同也与CD2v阳性小鼠血清发生反应。

[0110] 3、单克隆抗体识别抗原表位鉴定

[0111] 用多肽包被于酶标板，用CD2v单克隆抗体与多肽进行间接ELISA检测，鉴定单克隆抗体与多肽的反应性，结果如图10所示，多肽P10可被单克隆抗体4B11识别；多肽P12(氨基酸序列SEQ ID NO：5，即VKYTNESILEYNWNNSNI)被单克隆抗体5H4、5F7识别。

[0112] 实施例6单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用

[0113] 该实施例提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂，该检测试剂包含本发明提供的抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体。

[0114] 非洲猪瘟病毒HLJ/18株感染猪原代肺泡巨噬细胞，经甲醇固定处理，制备成单层细胞反应板。该经ASFV HLJ/18株感染的单层细胞反应板由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所友情提供。

[0115] 1、IPMA方法检测非洲猪瘟感染的细胞，具体步骤如下：

[0116] (1)将上述制备的单层细胞反应板从冰箱取出，平衡至室温，用PBST洗涤1次。

[0117] (2)将上述检测试剂(包含本发明提供的抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体)作为一抗，用5％的脱脂奶1：1000进行稀释，同时设阳性对照为ASFV猪阳性血清，阴性对照为抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体，每孔加样量为50μl。置于37℃温箱中孵育30min。

[0118] (3)PBST洗涤3次，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗。阳性对照孔中加入HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗。置于37℃温箱中孵育30min。

[0119] (4)PBST洗涤3次，加入AEC底物显色液，室温显色10min，置光学显微镜下观察染色结果。

[0120] 结果判定：非洲猪瘟病毒感染的细胞可观察到典型的红棕色着色，未感染的细胞和阴性对照无红棕色着色。

[0121] 结果表明本发明的抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体可特异性的检测被ASFV感染的细胞。

[0122] 2、IFA检测方法可以参照IPMA检测方法进行，二抗略有不同，将FITC标记的羊抗鼠二抗以1：500稀释后加入相应孔中，其他步骤参照IPMA进行。无需显色底物，结果在荧光显微镜下进行观察。

[0123] 结果判定：非洲猪瘟病毒感染的细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞和阴性对照无荧光。

[0124] 结果如图9所示，表明本发明的抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体可特异性的检测被ASFV感染的细胞。

[0125] 同时，本发明的单克隆抗体还可以用于ELISA检测试剂或ELISA检测试剂盒中，如实施例2，或者将本发明的单克隆抗体经标记物标记后用于ELISA检测试剂或试剂盒中，检测ASFV或ASFV CD2v蛋白；本发明的单克隆抗体还可以作为一抗用于Westernblotting中，检测ASFV或ASFV CD2v蛋白，如实施例3；或者将本发明的单克隆抗体作为金标抗体或捕获抗体用于免疫层析试纸，检测ASFV或ASFV CD2v蛋白。

[0126] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。