一种邻近生物素连接酶及其应用

摘要

本发明涉及基因工程，进一步的说是基因工程改造的邻近生物素连接酶，具体的说一种用邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。邻近生物素连接酶为生物素连接酶中位于ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近定点插入非天然氨基酸。所得邻近生物素连接酶在未经过特定波长紫外照射或者未与特定化合物孵育时，抑制其邻近生物素连接酶的酶活性。而后对所得邻近生物素连接酶进行特定紫外波长照射或者加入特定化合物，将非天然氨基酸转化为天然氨基酸，恢复其酶活性。本发明邻近生物素连接酶可以消除以往生物素连接酶的非特异性背景，极大提高鉴定特定细胞器内蛋白质组的特异性。

权利要求

1.一种邻近生物素连接酶，其特征在于：邻近生物素连接酶为生物素连接酶中位于ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近定点插入非天然氨基酸；

所述邻近生物素连接酶为大肠杆菌来源的生物素连接酶BirA的突变体的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸，从而抑制该邻近生物素连接酶的酶活；

所述邻近生物素连接酶为生物素连接酶TurboID的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸；其中，非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或ONB‑赖氨酸或ONB‑酪氨酸；

所述邻近生物素连接酶为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第183位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸，即SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；

或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第132位酪氨酸突变为非天然氨基酸ONB‑酪氨酸，即SEQ ID NO:7所示氨基酸序列；

或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第172位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸，即SEQ ID NO:9所示氨基酸序列、SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述的邻近生物素连接酶的构建方法，其特征在于：对生物素连接酶TurboID的邻近ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近两个位点，利用正交的和吡咯烷基‑tRNA合成酶进行定点非天然氨基酸插入，获得邻近生物素连接酶；

所述生物素连接酶TurboID氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸或ONB‑酪氨酸。

3.一种权利要求1所述的邻近生物素连接酶的应用，其特征在于：所述邻近生物素连接酶在质谱鉴定中的应用。

4.按权利要求3所述的邻近生物素连接酶的应用，其特征在于：所述权利要求1中记载任意一个邻近生物素连接酶在特定紫外波长光照条件下，对邻近蛋白进行生物素标记及其在质谱鉴定中的应用。

5.一种利用邻近生物素连接酶进行生物素化标记进而进行质谱鉴定的方法，其特征在于：利用权利要求1中记载任意一个邻近生物素连接酶，与目的蛋白融合表达后，定位到特定细胞结构，而后特定紫外波长照射，使邻近生物素连接酶恢复酶活性，进而对目的蛋白的邻近蛋白进行生物素标记，被生物素标记的蛋白通过Streptavidin耦联磁珠富集，进行质谱鉴定。

说明书

一种邻近生物素连接酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程，进一步的说是基因工程改造的邻近生物素连接酶，具体的说一种用邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。

背景技术

[0002] 邻近标记已成为免疫沉淀和传统生化分离的替代方法，通过与蛋白质组学联合使用，已经被广泛用于大分子复合物组分鉴定、细胞器内蛋白质种类分析和蛋白质相互作用网络的构建。邻近标记技术的策略通常为将目的蛋白与邻近标记的酶融合表达，进而将目的蛋白靶向到细胞内特定的位置。通过加入生物素等小分子底物，该邻近标记的酶可以催化与目的蛋白空间位置邻近的蛋白质发生生物素化共价连接修饰，上述被生物素化修饰的蛋白质可以利用耦联链霉亲和素的珠子富集并进一步利用质谱鉴定。

[0003] 目前，研究人员成功开发了以下两大类酶用于邻近标记：(1)一类为大肠杆菌生物素连接酶BirA的邻近标记突变体，这其中主要包括BirA‑R118G(本文后面将该蛋白称为BioID)[1,2]和TurboID[3]；(2)另外一类为大豆抗坏血酸过氧化物酶的突变体，这主要包括APEX2[4]。

[0004] APEX2优点为对邻近蛋白的标记速度快，可以在1分钟左右完成，然而，APEX2对邻近蛋白质的生物素标记需要向培养基中添加双氧水(H2O2)，这对活细胞标记具有毒性同时也很难应用到活体组织中。

[0005] BioID优点为以生物素作为底物，无细胞毒性，目前已经有近100余项关于BioID的应用报道。但是，BioID的主要缺点为对邻近蛋白进行生物素标记的至少需要18个小时的反应时间才能积累足够用于质谱鉴定的蛋白质。TurboID与BioID类似，均来源于对大肠杆菌的生物素连接酶的突变，TurboID以生物素为底物，能将标记时间缩短到10分钟。因此，TurboID在哺乳动物细胞及模式生物上得到了广泛的应用[5,6]。

[0006] 然而，生物素为大多数哺乳动物细胞生长必须物质，而TurboID与BioID在细胞内表达逐渐积累的过程一般需要12个小时左右，逐渐累积的TurboID和BioID能够利用细胞培养基中的生物素对邻近蛋白产生较高的背景标记，从而影响质谱鉴定的特异性。

[0007] 与经典的的密码子不同，琥珀密码子UAG(TAG)在巴氏甲烷八叠球菌和詹氏甲烷球菌中分别可以作为编码吡咯赖氨酸(赖氨酸衍生物)[7]和酪氨酸的有义密码子[8]，而并非终止密码子。通过基因工程改造可以得到与哺乳动物正交的 和吡咯烷基‑tRNA合成酶，进而在哺乳动物细胞中将赖氨酸的衍生物或者酪氨酸的衍生物定点插入到目的蛋白中。

[0008] 如果能够使邻近生物素连接酶TurboID在积累表达的过程中不具有活性，而在接受物理或者化学的刺激条件下恢复其生物素连接酶的活性，这将有效降低标记背景，提高邻近标记的准确性和特异性，同时保留TurboID的时间和空间分辨率。

发明内容

[0009] 本发明目的在于一种用光控邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。

[0010] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

[0011] 一种邻近生物素连接酶，邻近生物素连接酶为在生物素连接酶的ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近，定点插入非天然氨基酸。

[0012] 所得邻近生物素连接酶在未经过特定波长紫外照射或者未与特定类型化合物孵育时，抑制其邻近生物素连接酶的酶活性。而后对该邻近生物素连接酶进行365纳米照射或者与特定化合物孵育，将非天然氨基酸转化为天然氨基酸，恢复其酶活性。

[0013] 所述邻近生物素连接酶为大肠杆菌来源的生物素连接酶BirA的突变体的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸，从而抑制该邻近生物素连接酶的酶活。

[0014] 所述邻近生物素连接酶为生物素连接酶TurboID的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸；其中，非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸。

[0015] 所述邻近生物素连接酶为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第183位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸，即SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；

[0016] 或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第132位酪氨酸突变为非天然氨基酸ONB‑酪氨酸，即SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。

[0017] 或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第172位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸，即SEQ ID NO:9所示氨基酸序列、SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

[0018] 一种邻近生物素连接酶的构建方法，对生物素连接酶TurboID的两个邻近ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近，利用正交的 和吡咯烷基‑tRNA合成酶进行定点非天然氨基酸插入，获得邻近生物素连接酶。

[0019] 所述生物素连接酶TurboID氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸或非天然氨基酸ONB‑赖氨酸或ONB‑酪氨酸。

[0020] 一种邻近生物素连接酶的应用，所述邻近生物素连接酶在质谱鉴定中的应用。

[0021] 所述邻近生物素连接酶在特定波长紫外光照条件下，对邻近蛋白进行生物素标记在质谱鉴定中的应用。

[0022] 一种利用邻近生物素连接酶进行生物素化标记进行质谱鉴定的方法，利用所述邻近生物素连接酶，与目的蛋白融合表达后，定位到特定细胞器，而后在365纳米照射，使邻近生物素连接酶恢复酶活性，进而对目的蛋白的邻近蛋白进行生物素标记，被生物素标记的蛋白通过Streptavidin耦联磁珠富集，进行质谱鉴定。

[0023] 本发明所具有的优点：

[0024] 已有的用于邻近标记的生物素连接酶会随着表达积累，利用培养基中的生物素对邻近蛋白产生较高的生物素化背景，本发明设计的光控邻近生物素连接酶，通过将已有邻近生物素连接酶的活性中心附近的氨基酸突变为非天然氨基酸，能够完全使邻近生物素连接酶失活，进而消除积累表达过程中产生的背景，大幅提高质谱鉴定的准确性和特异性。

附图说明

[0025] 图1为传统邻近生物素连接酶(A)与本发明中光控邻近生物素连接酶(B)的对比示意图。

[0026] 图2为不同处理条件下获得总蛋白样品，利用Streptavidin‑HRP检测总蛋白的生物素化的免疫印迹结果图。

[0027] 图3为利用本发明获得光控生物素连接酶PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK鉴定线粒体基质内蛋白质；其中，(A)SILAC鉴定线粒体基质内蛋白质示意图，(B)比较光控邻近生物素连接酶PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK(上半部分)和已发表的邻近生物素连接酶mito‑TurboID(下半部分)鉴定线粒体基质内蛋白质数目及特异性。

具体实施方式

[0028] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

[0029] 本发明涉及经过基因工程改造的邻近生物素连接酶。光控邻近生物素连接酶将特定位点的赖氨酸或者酪氨酸替分别换为相应的赖氨酸或者酪氨酸衍生物等非天然氨基酸，非天然氨基酸的定点插入能够消除邻近生物素连接酶的酶活；在特定波长的紫外照射下，光控邻近生物素连接酶中特定位点上的赖氨酸或者酪氨酸衍生物等非天然氨基酸转化成赖氨酸或者酪氨酸，进而恢复邻近生物素连接酶的活性，从而特异性对邻近蛋白进行生物素化反应。光控邻近生物素连接酶可以消除以往生物素连接酶的非特异性背景，极大提高鉴定特定细胞器内蛋白组的特异性。

[0030] 本发明所涉及序列和化学结构式如下：

[0031] 邻近生物素连接酶TurboID的蛋白质为大肠杆菌来源的生物素连接酶BirA的突变体，其序列和DNA序列源自[3]文献记载，具体来讲，

[0032] SEQ ID NO:1:TurboID的蛋白质序列如下：

[0033] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0034] SEQ ID NO:2:TurboID的DNA序列如下：

[0035] aaagacaatactgtgcctctgaagctgatcgctctcctggctaatggcgagttccatagtggcgaacagctgggagaaaccctgggcatgtccagggccgctatcaacaagcacattcagactctgcgcgactggggcgtggacgtgttcaccgtgcccggaaagggctactctctgcccgagcctatcccgctgctgaacgctaaacagattctgggacagctggacggcgggagcgtggcagtcctgcctgtggtcgactccaccaatcagtacctgctggatcgaatcggcgagctgaagagtggggatgcttgcattgcagaatatcagcaggcagggagaggaagcagagggaggaaatggttctctccttttggagctaacctgtacctgagtatgttttggcgcctgaagcggggaccagcagcaatcggcctgggcccggtcatcggaattgtcatggcagaagcgctgcgaaagctgggagcagacaaggtgcgagtcaaatggcccaatgacctgtatctgcaggatagaaagctggcaggcatcctggtggagctggccggaataacaggcgatgctgcacagatcgtcattggcgccgggattaacgtggctatgaggcgcgtggaggaaagcgtggtcaatcagggctggatcacactgcaggaagcagggattaacctggacaggaatactctggccgctacgctgatccgagagctgcgggcagccctggaactgttcgagcaggaaggcctggctccatatctgccacggtgggagaagctggataacttcatcaatagacccgtgaagctgatcattggggacaaagagattttcgggattagccgggggattgataaacagggagccctgctgctggaacaggacggagttatcaaaccctggatgggcggagaaatcagtctgcggtctgccgaaaag

[0036] MNPY‑赖氨酸(即MNPYK)的化学结构及插入非天然氨基酸MNPY‑赖氨酸(即MNPYK)所采用的 和MNPYK‑tRNA合成酶的DNA序列请参考文献[9]。

[0037] ONB‑赖氨酸(即ONBK)的化学结构及插入非天然氨基酸ONB‑赖氨酸(即ONBK)所采用的 和ONBK‑tRNA合成酶的DNA序列请参考文献[10]。

[0038] ONB‑酪氨酸(即ONBY)的化学结构及插入非天然氨基酸ONB‑酪氨酸(即ONBY)所采用的 和ONBY‑tRNA合成酶的DNA序列请参考文献[11]。

[0039] 实施例1

[0040] 表达及活化光控生物素连接酶PC‑TurboID‑183‑MNPYK的技术方案

[0041] 1)通过定点突变，将TurboID中第183位赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，得到如SEQ ID NO:3所示的TurboID‑183质粒；具体为：

[0042] 利用NEB公司的 Site‑Directed Mutagenesis Kit，以及NEB在线设计PCR引物NEBBaseChanger，设计如下两条引物：

[0043] 正向引物：5’‑GCAGGATAGAtAGCTGGCAGG‑3’

[0044] 反向引物：5’‑AGATACAGGTCATTGGGC‑3’

[0045] 该对PCR引物能够将183位赖氨酸AAG密码子突变为琥珀酸密码子TAG将1.25微升的正向引物和1.25微升的反向引物、12.5微升的Q5 Hot Start High‑Fidelity 2X Master Mix、1微升的包含SEQ ID NO:2所示TurboID的DNA序列的模板和9微升的水混合均匀，按照如下条件进行PCR扩增：步骤1 98度 30秒；步骤2 98度 10秒；步骤3 62度 15秒；步骤4 72度5分钟；步骤5从步骤2到步骤4重复25次；步骤6 72度 2分钟。

[0046] 将PCR反应体系中模板利用进行消化，KLD mix的配置：加入1微升PCR产物，5微升2×KLD反应液，1微升10×KLD酶混合物，3微升水。室温孵育5分钟。

[0047] 将上述1微升KLD mix加入到化学感受态大肠杆菌中，冰孵30分钟。

[0048] 42度热激30秒后放置于冰上孵育5分钟。

[0049] 加入LB培养基37度孵育1小时。

[0050] 将感受态大肠杆菌涂布于含有相应抗生素的琼脂平板上。通过Sanger DNA测序获得含SEQ ID NO:3所示碱基突变TurboID‑183质粒。

[0051] 2)将TurboID‑183质粒与参考文献9中提及的 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸MNPYK，积累表达获得含SEQ ID NO:4所示的光控邻近生物素连接酶PC‑TurboID‑183‑MNPYK。

[0052] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365nm波长的紫外线对样本照射1分钟，使PC‑TurboID‑183‑MNPYK恢复生物素连接酶活性(参见图1)。

[0053] SEQ ID NO:3，TurboID‑183的DNA序列如下：

[0054] aaagacaatactgtgcctctgaagctgatcgctctcctggctaatggcgagttccatagtggcgaacagctgggagaaaccctgggcatgtccagggccgctatcaacaagcacattcagactctgcgcgactggggcgtggacgtgttcaccgtgcccggaaagggctactctctgcccgagcctatcccgctgctgaacgctaaacagattctgggacagctggacggcgggagcgtggcagtcctgcctgtggtcgactccaccaatcagtacctgctggatcgaatcggcgagctgaagagtggggatgcttgcattgcagaatatcagcaggcagggagaggaagcagagggaggaaatggttctctccttttggagctaacctgtacctgagtatgttttggcgcctgaagcggggaccagcagcaatcggcctgggcccggtcatcggaattgtcatggcagaagcgctgcgaaagctgggagcagacaaggtgcgagtcaaatggcccaatgacctgtatctgcaggatagaTagctggcaggcatcctggtggagctggccggaataacaggcgatgctgcacagatcgtcattggcgccgggattaacgtggctatgaggcgcgtggaggaaagcgtggtcaatcagggctggatcacactgcaggaagcagggattaacctggacaggaatactctggccgctacgctgatccgagagctgcgggcagccctggaactgttcgagcaggaaggcctggctccatatctgccacggtgggagaagctggataacttcatcaatagacccgtga[0055] agctgatcattggggacaaagagattttcgggattagccgggggattgataaacagggagccctgctgctggaac

[0056] aggacggagttatcaaaccctggatgggcggagaaatcagtctgcggtctgccgaaaag

[0057] SEQ ID NO:4，PC‑TurboID‑183‑MNPYK的氨基酸序列如下：

[0058] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDR(MNPYK)LAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0059] 实施例2

[0060] 表达及活化光控生物素连接酶PC‑TurboID‑183‑ONBK的技术方案

[0061] SEQ ID NO:3所示TurboID‑183质粒与参考文献10中提及的 和ONBK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸ONBK，积累表达获得含SEQ ID NO:5所示的光控邻近生物素连接酶PC‑TurboID‑183‑ONBK。

[0062] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365纳米波长的紫外线对样本照射1分钟，使PC‑TurboID‑183‑ONBK恢复生物素连接酶活性(参见图1)。

[0063] SEQ ID NO:5，PC‑TurboID‑183‑ONBK的氨基酸列如下：

[0064] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDR(ONBK)LAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0065] 实施例3

[0066] 表达及活化光控生物素连接酶PC‑TurboID‑132‑ONBY的技术方案

[0067] 如实施例1所述的点突变方法将TurboID中第132位酪氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，得到如SEQ ID NO:6所示的TurboID‑132质粒。点突变所采用的引物如下：

[0068] 正向引物：5’‑CTAACCTGTAgCTGAGTATGTTTTG‑3’

[0069] 反向引物：5’‑CTCCAAAAGGAGAGAACC‑3’

[0070] 将TurboID‑132质粒与参考文献11中提及的 和ONBY‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入加入终浓度为1mM非天然氨基酸ONBY，积累表达获得含SEQ ID NO:7所示的光控邻近生物素连接酶PC‑TurboID‑132‑ONBY。

[0071] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365纳米波长的紫外线对样本照射1分钟，使PC‑TurboID‑ONBY‑132恢复生物素连接酶活性(参见图1)。

[0072] SEQ ID NO:6，TurboID‑132的DNA序列如下：

[0073] aaagacaatactgtgcctctgaagctgatcgctctcctggctaatggcgagttccatagtggcgaacagctgggagaaaccctgggcatgtccagggccgctatcaacaagcacattcagactctgcgcgactggggcgtggacgtgttcaccgtgcccggaaagggctactctctgcccgagcctatcccgctgctgaacgctaaacagattctgggacagctggacggcgggagcgtggcagtcctgcctgtggtcgactccaccaatcagtacctgctggatcgaatcggcgagctgaagagtggggatgcttgcattgcagaatatcagcaggcagggagaggaagcagagggaggaaatggttctctccttttggagctaacctgtaGctgagtatgttttggcgcctgaagcggggaccagcagcaatcggcctgggcccggtcatcggaattgtcatggcagaagcgctgcgaaagctgggagcagacaaggtgcgagtcaaatggcccaatgacctgtatctgcaggatagaaagctggcaggcatcctggtggagctggccggaataacaggcgatgctgcacagatcgtcattggcgccgggattaacgtggctatgaggcgcgtggaggaaagcgtggtcaatcagggctggatcacactgcaggaagcagggattaacctggacaggaatactctggccgctacgctgatccgagagctgcgggcagccctggaactgttcgagcaggaaggcctggctccatatctgccacggtgggagaagctggataacttcatcaatagacccgtgaagctgatcattggggacaaagagattttcgggattagccgggggattgataaacagggagccctgctgctggaacaggacggagttatcaaaccctggatgggcggagaaatcagtctgcggtctgccgaaaag

[0074] SEQ ID NO:7，PC‑TurboID‑132‑ONBY的氨基酸序列如下：

[0075] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANL(ONBY)LSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0076] 实施例4

[0077] 表达及活化光控生物素连接酶PC‑TurboID‑172‑MNPYK的技术方案

[0078] 按照实施例1中所述，将TurboID中第172位赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，得到如SEQ ID NO:8所示的TurboID‑172质粒；

[0079] 点突变的引物如下：

[0080] 正向引物：5’‑GGTGCGAGTCtagTGGCCCAATG‑3’

[0081] 反向引物：5’‑TTGTCTGCTCCCAGCTTTC‑3’

[0082] 将TurboID‑172质粒与参考文献9中提及的 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸MNPYK，积累表达获得含SEQ ID NO:9所示的光控邻近生物素连接酶PC‑TurboID‑172‑MNPYK。

[0083] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365nm波长的紫外线对样本照射1分钟，使PC‑TurboID‑172‑MNPYK恢复生物素连接酶活性(参见图1)。

[0084] SEQ ID NO:8，TurboID‑172的DNA序列如下：

[0085] aaagacaatactgtgcctctgaagctgatcgctctcctggctaatggcgagttccatagtggcgaacagctgggagaaaccctgggcatgtccagggccgctatcaacaagcacattcagactctgcgcgactggggcgtggacgtgttcaccgtgcccggaaagggctactctctgcccgagcctatcccgctgctgaacgctaaacagattctgggacagctggacggcgggagcgtggcagtcctgcctgtggtcgactccaccaatcagtacctgctggatcgaatcggcgagctgaagagtggggatgcttgcattgcagaatatcagcaggcagggagaggaagcagagggaggaaatggttctctccttttggagctaacctgtacctgagtatgttttggcgcctgaagcggggaccagcagcaatcggcctgggcccggtcatcggaattgtcatggcagaagcgctgcgaaagctgggagcagacaaggtgcgagtcTAGtggcccaatgacctgtatctgcaggatagaaagctggcaggcatcctggtggagctggccggaataacaggcgatgctgcacagatcgtcattggcgccgggattaacgtggctatgaggcgcgtggaggaaagcgtggtcaatcagggctggatcacactgcaggaagcagggattaacctggacaggaatactctggccgctacgctgatccgagagctgcgggcagccctggaactgttcgagcaggaaggcctggctccatatctgccacggtgggagaagctggataacttcatcaatagacccgtgaagctgatcattggggacaaagagattttcgggattagccgggggattgataaacagggagccctgctgctggaacaggacggagttatcaaaccctggatgggcggagaaatcagtctgcggtctgccgaaaag

[0086] SEQ ID NO:9，PC‑TurboID‑172‑MNPYK的氨基酸序列如下：

[0087] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRV(MNPYK)WPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0088] 实施例5

[0089] 表达及活化光控生物素连接酶PC‑TurboID‑172‑ONBK的技术方案

[0090] SEQ ID NO:8所示TurboID‑172质粒与参考文献10中提及的 和ONBK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸ONBK，积累表达获得含SEQ ID NO:10所示的光控邻近生物素连接酶PC‑TurboID‑172‑ONBK。

[0091] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365纳米波长的紫外线对样本照射1分钟，使PC‑TurboID‑172‑ONBK恢复生物素连接酶活性(参见图1)。

[0092] SEQ ID NO:10，PC‑TurboID‑172‑ONBK的氨基酸列如下：

[0093] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRV(ONBK)WPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0094] 由图1可见，传统的邻近生物素连接酶(即文献3记载)首先在细胞内过表达，在外源加入大量的生物素后，会对邻近蛋白进行生物素化修饰(A右侧所示)[3]。然而，传统的邻近生物素连接酶在细胞内逐渐表达积累的过程中会利用培养基中的生物素和ATP，对邻近蛋白质进行生物素化，形成较高的背景，干扰下游质谱准确鉴定的蛋白质种类(A左侧所示)。而本发明上述实施例获得光控邻近生物素连接酶通过对传统邻近生物素连接酶的第183位或第172位定点插入非天然氨基酸MNPYK或ONBK，或第132位定点插入非天然氨基酸ONBY，能够阻止邻近生物素连接酶活性中心与ATP或生物素的结合，从而抑制酶活，消除积累表达过程中的背景生物素化对有效质谱鉴定结果的影响，光控邻近生物素连接酶能够在特定紫外波长照射的条件下恢复生物素连接酶的活性。

[0095] 实施例6

[0096] 表达生物素连接酶TurboID‑168‑MNPYK的技术方案

[0097] 如实施例1所述的点突变方法将TurboID中第168位赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，将该载体命名为TurboID‑168质粒。

[0098] 点突变采用引物如下：

[0099] 正向引物：5’‑GGGAGCAGACtAGGTGCGAGT‑3’

[0100] 反向引物：5’‑AGCTTTCGCAGCGCTTCT‑3’

[0101] 将TurboID‑168质粒与参考文献9中提及的 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸MNPYK，积累表达获得含SEQ ID NO:11所示的非天然氨基酸插入的邻近生物素连接酶TurboID‑168‑MNPYK。

[0102] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365纳米波长的紫外线对样本照射1分钟，比较照射前后酶活性的变化。

[0103] SEQ ID NO:11，TurboID‑168‑MNPYK的氨基酸列如下：

[0104] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGAD(MNPYK)VRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0105] 实施例7

[0106] 表达生物素连接酶TurboID‑168‑ONBK的技术方案

[0107] 如实施例1所述的点突变方法将TurboID中第168位赖氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，将该载体命名为TurboID‑168质粒。

[0108] 将TurboID‑168质粒与参考文献10中提及的 和ONBK‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸ONBK，积累表达获得含SEQ ID NO:12所示的非天然氨基酸插入的邻近生物素连接酶TurboID‑168‑ONBK。

[0109] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365nm波长的紫外线对样本照射1分钟，比较照射前后活性的变化。

[0110] SEQ ID NO:12，TurboID‑168‑ONBK的蛋白序列如下：

[0111] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGAD(ONBK)VRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0112] 实施例8

[0113] 表达生物素连接酶TurboID‑111‑ONBY的技术方案

[0114] 如实施例1所述的点突变方法将TurboID中第111位酪氨酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，将该载体命名为TurboID‑111质粒。

[0115] 点突变采用的引物如下：

[0116] 正向引物：5’‑TTGCAGAATAgCAGCAGGCAG‑3’

[0117] 反向引物：5’‑TGCAAGCATCCCCACTCT‑3’

[0118] 将TurboID‑111质粒与参考文献11中的 和ONBY‑tRNA合成酶质粒转染到Hela细胞中，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸ONBY，积累表达获得含SEQ ID NO:13所示的非天然氨基酸插入的邻近生物素连接酶TurboID‑111‑ONBY。

[0119] 将上述的连接酶积累表达12小时后，利用365纳米波长的紫外线对样本照射1分钟，比较照射前后活性的变化。

[0120] SEQ ID NO:13，TurboID‑111‑ONBY的氨基酸序列如下：

[0121] KDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAE(ONBY)

[0122] QQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0123] 将上述实施例1到8中获得的含有邻近生物素连接酶表达的Hela细胞样本，在365nm光照射或者不照射的条件下，经过或不经过生物素化反应后，利用Streptavidin‑HRP检测总蛋白的生物素化的免疫印迹(参见图2)，具体为：

[0124] 对不同处理后获得细胞样本用含有蛋白酶抑制剂RIPA裂解液(Thermo TMScientific ，89900)冰上裂解15分钟后，利用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，将所有样本的蛋TM
白质终浓度调整到1mg/mL，加入终浓度为1×的NuPAGE  LDS样品缓冲液(Thermo TM TM
Scientific ，NP0007)，70度加热样品10分钟，每个泳道上样10微升，利用NuPAGE  4至TM
12％的15孔Bis‑Tris小型蛋白质凝胶(Thermo Scientific ，NP0323BOX)进行在1×TM TM
NuPAGE  MOPS缓冲液(NP0001)体系下80V电压分离1小时，采用NuPAGE 转印缓冲液TM
(Thermo Scientific ，NP0006)在200mA的电流下转PVDF膜1小时，将转好的PVDF膜用含有
5％BSA的PBS封闭1小时，在PBS缓冲液中按照1：5000(v/v)的比例稀释Streptavidin‑HRPTM
(Abcam，ab7403)室温孵育半小时，用PBS洗涤PVDF膜5次，每次5分钟。加入Pierce  ECL反应TM
底物(Thermo Scientific ，32106)反应1分钟，在天能化学发光仪(Tanon 4600FS)上曝光收集光信号。

[0125] 其中，不同处理条件(即图2中泳道1‑18)具体顺序为：

[0126] 转染TurboID质粒，12小时后，不加入生物素。

[0127] 转染TurboID质粒，12小时后，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0128] 转染TurboID‑183和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0129] 转染TurboID‑183和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟

[0130] 转染TurboID‑183和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0131] 转染TurboID‑183和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0132] 转染TurboID‑132和 和ONBY‑tRNA合成酶质粒，加入1mM的ONBY非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0133] 转染TurboID‑132和 和ONBY‑tRNA合成酶质粒，加入1mM的ONBY非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0134] 转染TurboID‑168和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0135] 转染TurboID‑168和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0136] 转染TurboID‑168和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0137] 转染TurboID‑168和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0138] 转染TurboID‑111和 和ONBY‑tRNA合成酶质粒，加入1mM的ONBY非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0139] 转染TurboID‑111和 和ONBY‑tRNA合成酶质粒，加入1mM的ONBY非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0140] 转染TurboID‑172和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0141] 转染TurboID‑172和 和MNPYK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的MNPYK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟

[0142] 转染TurboID‑172和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，不用365纳米波长紫外照射，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0143] 转染TurboID‑172和 和ONBK‑tRNA合成酶质粒同时加入1mM的ONBK非天然氨基酸，12小时后，用365纳米波长紫外照射1分钟，加入终浓度0.5mM生物素37度反应10分钟。

[0144] 由图2可见，第一，从第1泳道和第2泳道对比，表明邻近生物素连接酶TurboID能够利用外源加入的生物素在10分钟的反应时间内对邻近蛋白质进行生物素化反应，这与先前文献3报道的结论一致；第二，从第3泳道、第5泳道、第7泳道、第15泳道和第17泳道可以表明在183位点插入非天然氨基酸MNPYK(第3泳道所示)或ONBK(第5泳道所示)或在132位插入非天然氨基酸ONBY(第7泳道所示)或在172位点插入非天然氨基酸MNPYK(第15泳道所示)或ONBK(第17泳道所示)后，即便外源加入生物素，也无法发生生物素化反应，这证明在TurboID的第183位或132位或172位插入非天然氨基酸能够阻断其生物素连接酶活性；第三，从第3泳道与第4泳道对比、第5泳道与第6泳道对比、第7泳道与第8泳道、第15泳道与第16泳道以及第17泳道和第18泳道对比，表明在365纳米光照1分钟后，PC‑TurboID‑183‑MNPYK(第3泳道与第4泳道对比)、PC‑TurboID‑183‑ONBK(第5泳道与第6泳道对比)、PC‑TurboID‑ONBY‑132(第7泳道与第8泳道对比)PC‑TurboID‑172‑MNPYK(第15泳道与第16泳道对比)和PC‑TurboID‑172‑ONBK(第17泳道与第18泳道对比)均能恢复其生物素连接酶的活性，TurboID‑MNPYK‑183(第4泳道)的活性恢复与野生型TurboID相当(第2泳道)，优于PC‑TurboID‑183‑ONBK(第6泳道)、PC‑TurboID‑ONBY‑132(第8泳道)、PC‑TurboID‑172‑MNPYK(第16泳道)和PC‑TurboID‑172‑ONBK(第18泳道)，这可能是由于以下两点原因造成：(1)不同非天然氨基酸对于365nm波长照射的敏感性不同。具体说，ONBK和ONBY(ONB基团修饰的赖氨酸和酪氨酸)在365纳米光照1分钟的条件下没有完全转化为野生型的赖氨酸和酪氨酸，而MNPYK(MNPY修饰的赖氨酸)在365纳米光照1分钟的条件下可以完全转化为野生型的赖氨酸(2)ONBK和ONBY插入到TurboID的183位或132位或MNPYK插入到172位会导致TurboID的稳定性减弱，更容易被细胞内蛋白酶体降解，而MNPYK插入到TurboID的183位对TurboID的稳定性没有影响；第四，从第3泳道、第5泳道、第7泳道、第15泳道及第17泳道和第1泳道对比，表明插入在TurboID的第183位插入MNPYK(第3泳道)和ONBK(第5泳道)或第132位插入ONBY(第7泳道)或第172位插入MNPYK(第15泳道)和ONBK(第17泳道)能显著消除由于TurboID积累表达引起的生物素化背景(第1泳道)；第五，从第9泳道与第10泳道对比、第11泳道与第12泳道对比以及第13泳道与第14泳道对比，表明在TurboID的168位插入非天然氨基酸MNPYK(第9泳道与第10泳道)或ONBK(第11泳道与第12泳道)以及TurboID的111位插入非天然氨基酸ONBY(第13泳道与第14泳道)，无论是否在365纳米光照1分钟，TurboID的活性均无变化，这证明只有在TurboID的特定位点插入非天然氨基酸能够阻断其生物素连接酶活性，排除了非天然氨基酸系统对于TurboID生物素连接酶活性的非特异性影响。

[0145] 应用例1

[0146] 利用上述实施例获得光控生物素连接酶进行质谱鉴定，具体：

[0147] 以实施例1获得光控生物素连接酶PC‑TurboID‑183‑MNPYK为例，利用所述邻近生物素连接酶与目的蛋白融合表达后，而后在365nm照射，使邻近生物素连接酶恢复酶活性，进而对目的蛋白的邻近蛋白进行生物素标记，被生物素标记的蛋白通过Streptavidin耦联磁珠富集，进行质谱鉴定(参见图3)。其中，细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，SILAC)可以用来区分不同处理条件下的细胞，即365纳米光照或者不光照。

[0148] 进一步的具体为：

[0149] 根据参考文献[3]中提到的定位于线粒体的序列，将该线粒体基质定位序列与SEQ ID NO:3所述TurboID‑183融合，通过基因合成得到如SEQ ID NO:14所示的mito‑TurboID‑183。

[0150] SEQ ID NO:14mito‑TurboID‑183的DNA序列如下：

[0151] ATGCTCGCCACGAGGGTGTTCTCTCTGGTGGGAAAAAGAGCGATTTCAACCAGTGTGTGTGTCAGAGCCCACGGGGGCAGCGGAGGAaaagacaatactgtgcctctgaagctgatcgctctcctggctaatggcgagttccatagtggcgaacagctgggagaaaccctgggcatgtccagggccgctatcaacaagcacattcagactctgcgcgactggggcgtggacgtgttcaccgtgcccggaaagggctactctctgcccgagcctatcccgctgctgaacgctaaacagattctgggacagctggacggcgggagcgtggcagtcctgcctgtggtcgactccaccaatcagtacctgctggatcgaatcggcgagctgaagagtggggatgcttgcattgcagaatatcagcaggcagggagaggaagcagagggaggaaatggttctctccttttggagctaacctgtacctgagtatgttttggcgcctgaagcggggaccagcagcaatcggcctgggcccggtcatcggaattgtcatggcagaagcgctgcgaaagctgggagcagacaaggtgcgagtcaaatggcccaatgacctgtatctgcaggatagaTagctggcaggcatcctggtggagctggccggaataacaggcgatgctgcacagatcgtcattggcgccgggattaacgtggctatgaggcgcgtggaggaaagcgtggtcaatcagggctggatcacactgcaggaagcagggattaacctggacaggaatactctggccgctacgctgatccgagagctgcgggcagccctggaactgttcgagcaggaaggcctggctccatatctgccacggtgggagaagctggataacttcatcaatagacccgtgaagctgatcattggggacaaagagattttcgggattagccgggggattgataaacagggagccctgctgctggaacaggacggagttatcaaaccctggatgggcggagaaatcagtctgcggtctgccgaaaag

[0152] 细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，SILAC)为在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种技术。本应用例重在重标培养基中加入终浓度为73mg/L的L‑Arginine‑HCl,13C6,15N4和146mg/L的L‑Lysine‑2HCl,13C6，在轻标培养基中加入73mg/L的L‑Arginine‑HCl和146mg/L的L‑Lysine‑2HCl，将细胞在重标和轻标培养基中培养5代，可以实现对细胞内99％以上的蛋白质进行同位素标记。

[0153] 在重标和轻标的细胞中通过共转染SEQ ID NO:11所示的mito‑TurboID‑183质粒和参考文献9中提及的非天然氨基酸插入系统 和MNPYK‑tRNA合成酶，同时加入终浓度为1mM非天然氨基酸MNPYK，从而将MNPYK特异性插入到TurboID的第183位赖氨酸位置，得到SEQ ID NO:15所示的靶向线粒体的光控邻近生物素连接酶PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK。

[0154] SEQ ID NO:15PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK的蛋白序列如下：

[0155] MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAHGGSGGKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIPLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVVDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGSRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLKRGPAAIGLGPVIGIVMAEALRKLGADKVRVKWPNDLYLQDR(MNPYK)LAGILVELAGITGDAAQIVIGAGINVAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAATLIRELRAALELFEQEGLAPYLPRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGVIKPWMGGEISLRSAEK

[0156] 积累表达PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK 12小时后，对重标培养基中培养的细胞进行365纳米光照1分钟，而对轻标培养基中的细胞不进行光照；加入终浓度为0.5mM生物素后37度条件下反应10分钟，裂解细胞，等质量混合重标和轻标的细胞裂解液，通过Streptavidin耦联磁珠富集生物素化蛋白，同时利用质谱鉴定富集得到的生物素化蛋白。
通过重标和轻标样本中肽段的丰度比值可以反映出特异性被光活化后PC‑mito‑TurboID‑
183‑MNPYK所生物素化的蛋白。

[0157] 由图3可见，传统方法构建TurboID融合表达线粒体信号肽，即mito‑TurboID[3](即文献3记载)，能够使线粒体基质内的蛋白发生生物素化，研究人员利用mito‑TurboID鉴定出了212种线粒体基质蛋白，特异性仅为67％(图3B，下侧)。利用跟先前文献报道相同的生物学分析流程[3]，PC‑mito‑TurboID‑183‑MNPYK能够鉴定出194种线粒体基质蛋白，其特异性高达91％，而传统的邻近生物素连接酶只有67％的特异性。因此光控邻近生物素连接酶在鉴定特定细胞器内蛋白的特异性上显著优于传统的邻近生物素连接酶。

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