用于诊断糖尿病肾病的分子标志物及其产品和应用

摘要

本发明公开了用于诊断糖尿病肾病的分子标志物及其产品和应用，本发明提供的分子标志物组合对糖尿病肾病具有极好的诊断效能，可用于糖尿病肾病的辅助诊断中，且能够方便运用于临床，快速有效地在早期诊断糖尿病肾病，为临床医生及时采取防治方案提供了支持。

权利要求

1.检测样本中分子标志物组合水平的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物组合为PDZD2、B4GALT5和LPCAT1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：特异性识别所述分子标志物组合的寡核苷酸探针，或特异性扩增所述分子标志物组合的引物，或特异性结合所述分子标志物组合编码的多肽和/或蛋白的结合剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本选自血液、血清、血浆、组织。

说明书

用于诊断糖尿病肾病的分子标志物及其产品和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及用于诊断糖尿病肾病的分子标志物，更具体地，本发明涉及用于诊断糖尿病肾病的分子标志物及其产品和应用。

背景技术

[0002] 糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是最常见的慢性代谢性疾病之一，2017年国际糖尿病联盟发布的数据显示，中国约有1.14亿成年糖尿病患者，且呈持续上升趋势，此外，预计到2045年全球的成年糖尿病患者将高达6.29亿(Cho NH,Shaw JE,Karuranga S,et al.IDF Diabetes Atlas:Global estimates of diabetes prevalence for 2017and projections for 2045[J].Diabetes Res Clin Pract,2018,138:271‑281.)，糖尿病的危害主要体现在各种各样的迁延难愈的并发症，如糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)等，它们严重影响糖尿病患者的生存质量，其中，糖尿病肾病是糖尿病高致残率、高致死率最重要的影响因素之一(Gray  SP,Cooper ME.Diabetic nephropathy in 2010:Alleviating the burden of diabetic nephropathy[J].Nat Rev Nephrol.2011,7(2):71‑3.)，也是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其可以引起慢性肾功能衰竭、终末期肾脏病(ESRD)等。

[0003] 近年来，国内外对糖尿病肾病已经进行了大量的研究，但是由于其病因的复杂性，有关糖尿病肾病发病的分子机制仍不清楚，尤其是糖尿病肾病的早期诊断、早期发病机制的研究，以及针对早期的糖尿病肾病的治疗措施都亟待加强。相关统计研究的结果表明终末期肾脏病患者中的糖尿病肾病患者10年的死亡率仍高达30％以上(Fox CS,Matsushita K,Woodward M,et al.Associations of kidney disease measures with mortality and end‑stage renal disease in individuals with and without diabetes:a meta‑analysis[J].Lancet.2012,9854(380):1662‑73.)。目前，糖尿病肾病诊断的“金标准”是肾穿刺活检病理，肾穿刺活检又称肾穿，通过肾穿所取得的肾脏组织以用于光镜、电镜、免疫病理等常规病理学检查，肾穿刺活体组织检查是为临床医师确定诊断、指导治疗及评估预后提供重要依据的操作，肾穿是查明肾脏疾病尤其是肾小球疾病病因必不可少的重要方法。

[0004] 肾穿刺活检病理作为一种有创诊断方法，其临床适用性和患者的接受度受到限制，因此，寻求新的、可靠的无创的、快速的诊断方法对糖尿病肾病的早期诊断和早期干预治疗具有重要的临床意义。

发明内容

[0005] 为了弥补现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供用于糖尿病肾病诊断的分子标志物，通过检测受试者样本中所述分子标志物的表达水平，即可判断受试者是否患有糖尿病肾病和/或患糖尿病肾病的风险，为本领域提供了一种早期、快速、无创性、准确的诊断方法，具有较好的临床应用价值。

[0006] 本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

[0007] 在本发明中，所述的分子标志物包括基因PDZD2、B4GALT5、LPCAT1，基因PDZD2、B4GALT5、LPCAT1的信息分别如下：

[0008] 基因PDZD2：PDZ domain containing 2，以Gene ID：23037可在NCBI中找到典型的智人mRNA和蛋白序列；

[0009] 基因B4GALT5：beta‑1,4‑galactosyltransferase 5，以Gene ID：9334可在NCBI中找到典型的智人mRNA和蛋白序列；

[0010] 基因LPCAT1：lysophosphatidylcholine acyltransferase 1，以Gene ID：79888可在NCBI中找到典型的智人mRNA和蛋白序列。

[0011] 第一方面，本发明提供了一组与糖尿病肾病相关的分子标志物。

[0012] 进一步，所述分子标志物包括PDZD2、B4GALT5、LPCAT1；

[0013] 优选地，所述分子标志物为PDZD2、B4GALT5；

[0014] 优选地，所述分子标志物为B4GALT5、LPCAT1；

[0015] 优选地，所述分子标志物为PDZD2、B4GALT5、LPCAT1。

[0016] 第二方面，本发明提供了检测样本中本发明第一方面所述的分子标志物水平的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用。

[0017] 进一步，所述产品包括检测本发明第一方面所述的分子标志物水平的试剂。

[0018] 进一步，所述试剂包括：特异性识别本发明第一方面所述的分子标志物的寡核苷酸探针，或特异性扩增本发明第一方面所述的分子标志物的引物，或特异性结合本发明第一方面所述的分子标志物编码的多肽和/或蛋白的结合剂。

[0019] 进一步，所述样本选自血液、血清、血浆、组织。

[0020] 第三方面，本发明提供了一种诊断糖尿病肾病的产品。

[0021] 进一步，所述产品包括检测本发明第一方面所述的分子标志物水平的试剂；

[0022] 优选地，所述产品包括核酸膜条、芯片或试剂盒。

[0023] 进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；

[0024] 优选地，所述基因芯片包括特异性针对本发明第一方面所述的分子标志物的引物或寡核苷酸探针；

[0025] 优选地，所述蛋白质芯片包括特异性结合本发明第一方面所述的分子标志物编码的多肽和/或蛋白的结合剂。

[0026] 进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒；

[0027] 优选地，所述基因检测试剂盒包括特异性针对本发明第一方面所述的分子标志物的引物、寡核苷酸探针或芯片；

[0028] 优选地，所述蛋白检测试剂盒包括特异性结合本发明第一方面所述的分子标志物编码的多肽和/或蛋白的结合剂。

[0029] 第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的分子标志物在构建预测糖尿病肾病的计算模型或嵌入了所述计算模型的系统中的应用；

[0030] 优选地，所述计算模型以所述分子标志物的水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出患糖尿病肾病的风险概率；

[0031] 优选地，所述分子标志物的水平包括所述分子标志物的mRNA水平、所述分子标志物的蛋白水平。

[0032] 第五方面，本发明提供了一种系统。

[0033] 进一步，所述系统包括：糖尿病肾病评估装置、彼此连接的信息通信终端装置；

[0034] 优选地，所述糖尿病肾病评估装置包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有糖尿病肾病和/或患糖尿病肾病的风险；

[0035] 优选地，所述彼此连接的信息通信终端装置提供关于来自受试者的样本中本发明第一方面所述的分子标志物的水平的数据；

[0036] 更优选地，所述糖尿病肾病评估装置的控制单元包括：

[0037] (1)数据接收单元：其接收从所述信息通信终端设备传输的关于受试者样本中的所述分子标志物的水平的数据；

[0038] (2)判别值计算单元：其基于由数据接收单元接收的受试者样本中所述分子标志物的水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的所述分子标志物的水平的判别来计算判别值；

[0039] (3)判别值基准评价单元：其基于由判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者的糖尿病肾病的情况进行评价；

[0040] (4)评估结果发送单元：其将由判别值基准评估单元获得的受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。

[0041] 本发明还提供了促进分子标志物PDZD2表达的试剂、抑制分子标志物B4GALT5表达的试剂、抑制分子标志物LPCAT1表达的试剂在制备用于预防和/或治疗糖尿病肾病的药物组合物中的应用；

[0042] 优选地，所述促进分子标志物PDZD2表达的试剂选自分子标志物PDZD2的模拟物、分子标志物PDZD2的激动剂、过表达分子标志物PDZD2的载体；

[0043] 更优选地，所述促进分子标志物PDZD2表达的试剂为分子标志物PDZD2的模拟物；

[0044] 优选地，所述抑制分子标志物B4GALT5表达的试剂、抑制分子标志物LPCAT1表达的试剂选自gapmer、干扰RNA、CRISPR、TALEN、锌指核酸酶；

[0045] 更优选地，所述抑制分子标志物B4GALT5表达的试剂、抑制分子标志物LPCAT1表达的试剂为干扰RNA。

[0046] 本发明还提供了本发明第一方面所述的分子标志物在筛选预防和/或治疗糖尿病肾病的候选药物中的应用；

[0047] 所述筛选候选药物的方法包括如下步骤：

[0048] (1)用待筛选的物质处理表达或含有本发明第一方面所述的分子标志物的体系；

[0049] (2)检测步骤(1)所述体系中本发明第一方面所述的分子标志物的表达水平；

[0050] 若所述待筛选的物质可提高分子标志物PDZD2的表达水平，降低分子标志物B4GALT5、LPCAT1的表达水平，则表明该待筛选的物质为预防和/或治疗糖尿病肾病的候选药物。

[0051] 进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

[0052] 除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义，此外，对部分术语解释如下：

[0053] 本文中使用的术语“诊断”、“进行诊断”、“诊断的”及这些术语的变化型，是指基于与个体相关的一个或多个的症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即存在疾病或疾患)，上述术语“诊断”、“进行诊断”、“诊断的”及这些术语的变化型包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现，在本发明中，所述糖尿病肾病的诊断包括不患有糖尿病肾病的个体和患有糖尿病肾病的个体的区别。

[0054] 本文中使用的术语“分子标志物”、“标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其他方面特征的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，所述分子标志物包括PDZD2、B4GALT5、LPCAT1、PDZD2+B4GALT5、PDZD2+LPCAT1、B4GALT5+LPCAT1、PDZD2+B4GALT5+LPCAT1，优选地，所述分子标志物为PDZD2+B4GALT5、B4GALT5+LPCAT1、PDZD2+B4GALT5+LPCAT1。

[0055] 本文中使用的术语“探针”，是指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因Labeling作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针等形式制备。

[0056] 本文中使用的术语“引物”，是指能够形成与模板链互补的碱基对，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7‑50个核酸序列。引物通常采用本领域技术人员熟知的方法合成制得，但也可以使用自然生成的核酸，引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

[0057] 本文中使用的术语“差异表达”、“表达差异”，是指与第二种样品中相同的一种或多种分子标志物的表达水平比较，两者之间存在差异。差异表达可以如本文所述的方法和本领域技术人员所熟知的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定分子标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量，样品中给定分子标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中分子标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定分子标志物可测定表达水平的增加或降低。

[0058] 本发明的优点和有益效果：

[0059] 本发明提供的分子标志物组合PDZD2+B4GALT5、B4GALT5+LPCAT1、PDZD2+B4GALT5+LPCAT1与糖尿病肾病具有极高的关联度，所述分子标志物组合在训练集和验证集中均表现出对糖尿病肾病极好的诊断效能，准确性、敏感性和特异性均较高，可用于糖尿病肾病的早期发现，进而在糖尿病肾病的早期进行及时有效的干预治疗，提高患者的生存质量。

附图说明

[0060] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0061] 图1显示PDZD2基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0062] 图2显示B4GALT5基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0063] 图3显示LPCAT1基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0064] 图4显示基因组合PDZD2+B4GALT5的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0065] 图5显示基因组合PDZD2+LPCAT1的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0066] 图6显示基因组合B4GALT5+LPCAT1的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；

[0067] 图7显示基因组合PDZD2+B4GALT5+LPCAT1的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集。

具体实施方式

[0068] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0069] 实施例1筛选糖尿病肾病中差异表达的基因

[0070] 1、数据来源

[0071] 数据来自于GEO数据库，从GEO数据库下载糖尿病肾病数据集GSE142153，作为训练集，样本量为Control：Case＝10：23；从GEO数据库下载糖尿病肾病数据集GSE30122，作为验证集，样本量为Control：Case＝50：19。

[0072] 2、数据预处理

[0073] 对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理，对标准化后的基因表达矩阵通过Platform文件进行注释，多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。

[0074] 3、差异表达分析

[0075] 采用R语言软件中的“limma”包分别对上述数据集GSE142153和GSE30122中的数据进行差异表达分析，差异表达基因的筛选标准为：P.Value<0.05，|logFC|>0.5。

[0076] 4、实验结果

[0077] 结果显示，筛选得到的训练集中的差异表达基因共1391个，验证集中的差异表达基因共740个，两组数据集中差异表达的基因取交集得到84个共有的差异表达基因，其中，筛选出的差异表达基因PDZD2、B4GALT5、LPCAT1在训练集和验证集中的差异表达情况分别见图1‑3，PDZD2、B4GALT5、LPCAT1在糖尿病肾病中表达情况分别为下调、上调、上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0078] 实施例2诊断效能验证

[0079] 1、实验方法

[0080] 对实施例1中筛选出的差异表达基因PDZD2、B4GALT5、LPCAT1，采用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC曲线)，分析其敏感性、特异性、AUC值，以判断其单独和联合时在训练集和验证集中的诊断效能；

[0081] 在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，AUC在0.5

[0082] 在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各基因的表达水平进行Logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。

[0083] 2、实验结果

[0084] 结果见表1‑3和图4‑7，结果显示基因组合PDZD2+B4GALT5、B4GALT5+LPCAT1、PDZD2+B4GALT5+LPCAT1对于糖尿病肾病的诊断效果优于单个标志物，具有较高的敏感性和特异性，表明了上述基因组合能够应用于糖尿病肾病的诊断中。

[0085] 表1单个基因的诊断效能统计

[0086]基因 训练集AUC 验证集AUC
PDZD2 0.765 0.652
B4GALT5 0.778 0.728
LPCAT1 0.796 0.762

[0087] 表2基因组合在训练集中的诊断效能统计

[0088]基因 AUC 敏感性 特异性
PDZD2+B4GALT5 0.839 0.783 0.900
PDZD2+LPCAT1 0.843 0.739 0.900
B4GALT5+LPCAT1 0.861 0.696 1.000
PDZD2+B4GALT5+LPCAT1 0.891 0.739 1.000

[0089] 表3基因组合在验证集中的诊断效能统计

[0090] 基因 AUC 敏感性 特异性PDZD2+B4GALT5 0.838 0.684 0.920
PDZD2+LPCAT1 0.774 0.684 0.840
B4GALT5+LPCAT1 0.823 0.632 0.940
PDZD2+B4GALT5+LPCAT1 0.865 0.789 0.900

[0091] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。