基于金属有机骨架的β-葡萄糖醛酸苷酶探针及应用转让专利
申请号 : CN202110850515.0
文献号 : CN113484295B
文献日 : 2022-06-07
发明人 : 肖玉秀 , 李朔
申请人 : 武汉大学
摘要 :
本发明提供了一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，所述基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针的探针底物可被β‑葡萄糖醛酸苷酶特异性催化，所述探针底物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷。其可以实现比率荧光和/或比率色度检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。其检测限低，可达到0.03U/L；具有良好的选择性，受干扰物影响小；可实现高灵敏裸眼可视化检测(红色到蓝色)；同时具有操作简单、响应快、精密度好、准确度高等突出优点。
权利要求 :
1.一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所述基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针的探针底物可被β‑葡萄糖醛酸苷酶特异性催化，所述探针底
3+
物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷，所述探针中还含有Eu @MOF‑253。
2.根据权利要求1所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所述探针中还含有酶激活剂，所述酶激活剂为二价钙离子盐。
3.根据权利要求2所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所
3+
述探针底物、酶激活剂、Eu @MOF‑253的用量比为(50～800)nmol：(50～300)nmol：(50～
300)mg。
4.根据权利要求1所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所
3+
述Eu @MOF‑253的制备方法包括如下步骤：步骤1)：将有机配体和金属铝盐溶解于第一有机溶剂中，加热至100～150摄氏度反应
18～30h，冷却到15～35摄氏度，洗涤干燥，即得MOF‑253；
步骤2)：将镧系离子金属盐和步骤1)得到的MOF‑253加入第二有机溶剂中，加热回流反
3+
应18～30h，洗涤干燥，即得Eu @MOF‑253。
5.根据权利要求4所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所述步骤1)中，有机配体为2，2’‑联吡啶‑5，5’‑二羧酸；金属铝盐为氯化铝；第一有机溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺。
6.根据权利要求4所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其特征在于，所述步骤2)中，镧系离子金属盐为硝酸铕；第二有机溶剂为甲醇或乙醇。
7.一种权利要求1～3任一项所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，其特征在于，采用4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷作为β‑葡萄糖醛酸
3+
苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过测定水解产物4‑甲基伞形酮与Eu @MOF‑253的比率荧光和/或比率色度来检测生物体系中β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。
8.根据权利要求7所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，其特征在于，体外孵育反应条件为底物浓度为2～3μM；孵育体系pH为5～6；反应温度为30～50摄氏度。
9.根据权利要求7所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，其特征在于，所述生物体系选自重组表达β‑葡萄糖醛酸苷酶、细胞样品、人或动物组织、植物、微生物中的一种。
10.根据权利要求8所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，其特征在于，所述水解产物4‑甲基伞形酮的激发波长为322nm，发射波长为
3+
450nm，Eu @MOF‑253的激发波长为322nm，发射波长为617nm。
说明书 :
基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针及应用
技术领域
[0001] 本发明专利涉及分析化学及临床检验技术领域，尤其是指一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶活性探针、色度分析装置及应用。
背景技术
[0002] β‑葡萄糖醛酸苷酶(GCU)为一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶，它被广泛用作癌症(胰腺、乳腺、肝、结肠和子宫颈的恶性肿瘤)等疾病临床诊断的生物标志物，因此，建立高灵敏度、高准确度、高便携的β‑葡萄糖醛酸苷酶活性分析方法非常必要。
[0003] 目前已经报道了多种检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的方法，包括比色法、电化学法、荧光法等。其中，荧光检测具有较高的灵敏度和选择性，被广泛应用于酶活性检测中。目前的酶荧光检测方法，大多数需要合成制备合适的底物分子或者有机荧光探针，不仅操作复杂、耗时且成本较高。
[0004] 因此，开发新型荧光检测方法用于β‑葡萄糖醛酸苷酶活性分析具有十分重要的意义。建立简便、灵敏、准确的β‑葡萄糖醛酸苷酶活性检测方法在临床上具有很大的应用前景。
发明内容
[0005] 金属有机骨架(metal‑organic framework,MOF)是一种无机‑有机晶体材料，由金属离子和有机配体通过配位键自组装而成。MOF具有制备简单、比表面积大、结构灵活等突出优点。本发明采用合成后修饰方法将镧系离子负载到MOF上，由此，能够得到同时具有镧系离子发光特性、丰富的孔道结构和高比表面积的MOF材料。目前，现有技术中还没有将负载镧系离子MOF材料应用于β‑葡萄糖醛酸苷酶活性检测的报道。而基于负载镧系离子MOF材料开发的酶活检测方法具有重要意义。
[0006] 同时，本发明结合荧光底物构建比率荧光检测能够提高检测方法的精密度和准确度，也可以减少外界干扰，提供校正功能。此外，该方法首次使用照度计测定色度数据RGB，实现实时检测，摆脱了比率荧光法检测酶活对大型仪器的依赖。
[0007] 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针的探针底物可被β‑葡萄糖醛酸苷酶特异性催化，所述探针底物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷，探针底物的结构如下式1所示，
[0008]
[0009] 在本发明的一个或多个实施例中，所述探针中还含有Eu3+@MOF‑253。
[0010] 在本发明的一个或多个实施例中，所述探针中还含有酶激活剂，所述酶激活剂为二价钙离子盐。优选地，所述二价钙离子盐为氯化钙。
[0011] 在本发明的一个或多个实施例中，所述探针底物、酶激活剂、Eu3+@MOF‑253的用量比为(50～800)nmol：(50～300)nmol：(50～300)mg。
[0012] 在本发明的一个或多个实施例中，所述Eu3+@MOF‑253的有机配体为联吡啶有机配体。
[0013] 在本发明的一个或多个实施例中，所述Eu3+@MOF‑253的有机配体为2，2’‑联吡啶‑5，5’‑二羧酸；所述镧系离子为三价铕盐。
[0014] 在本发明的一个或多个实施例中，所述Eu3+@MOF‑253的制备方法包括如下步骤：
[0015] 步骤1)：将有机配体和金属铝盐溶解于第一有机溶剂中，加热至100～150摄氏度反应18～30h，冷却到15～35摄氏度，洗涤干燥，即得MOF‑253；
[0016] 步骤2)：将镧系离子金属盐和步骤1)得到的MOF‑253加入第二有机溶剂中，加热回3+
流反应18～30h，洗涤干燥，即得Eu @MOF‑253。
流反应18～30h，洗涤干燥，即得Eu @MOF‑253。
[0017] 优选地，所述步骤1)中，有机配体为2，2’‑联吡啶‑5，5’‑二羧酸；金属铝盐为氯化铝；第一有机溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺。
[0018] 更优选地，所述步骤2)中，镧系离子金属盐为硝酸铕；第二有机溶剂为甲醇或乙醇。
[0019] 在本发明的第二方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，采用4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷作为β‑葡萄糖醛酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过检测水解所形成的产物4‑甲基伞形酮来检测生物体系中β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。
[0020] 此外，本发明提供一种本发明第一方面所述的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针非诊断非治疗目的的应用，采用4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷作为β‑葡萄糖醛3+
酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过测定水解产物4‑甲基伞形酮与Eu @MOF‑253的比率荧光和/或比率色度来检测生物体系中β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。
酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过测定水解产物4‑甲基伞形酮与Eu @MOF‑253的比率荧光和/或比率色度来检测生物体系中β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。
[0021] 在本发明的一个或多个实施例中，测定比率荧光包括在一定激发波长下记录荧光3+
发射光谱，计算一定发射波长下水解产物4‑甲基伞形酮与一定发射波长下Eu @MOF‑253的荧光强度比，即为比率荧光，然后，以比率荧光为纵坐标建立GCU活性的响应标准曲线。
发射光谱，计算一定发射波长下水解产物4‑甲基伞形酮与一定发射波长下Eu @MOF‑253的荧光强度比，即为比率荧光，然后，以比率荧光为纵坐标建立GCU活性的响应标准曲线。
[0022] 在本发明的一个或多个实施例中，所述比率色度检测所使用的色度分析装置包括照度计和302nm紫外灯。
[0023] 在本发明的一个或多个实施例中，所述体外孵育反应条件为底物浓度2～3μM；孵育体系pH为5～6；反应温度为30～50摄氏度。
[0024] 在本发明的一个或多个实施例中，所述生物体系选自重组表达β‑葡萄糖醛酸苷酶、细胞样品、人或动物组织、植物、微生物中的一种。
[0025] 在本发明的一个或多个实施例中，所述水解产物4‑甲基伞形酮的激发波长为3+
322nm，发射波长为450nm，Eu @MOF‑253的激发波长为322nm，发射波长为617nm。
322nm，发射波长为450nm，Eu @MOF‑253的激发波长为322nm，发射波长为617nm。
[0026] 本发明提供的基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的检测原理为采用的底物4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷在β‑葡萄糖醛酸苷酶的存3+
在下水解成产物4‑甲基伞形酮，在322nm激发时，产物4‑甲基伞形酮与Eu @MOF‑253的发射峰分别在450nm和617nm，可以构建比率荧光检测，同时可以形成由红色到蓝色的荧光颜色变化，实现比率色度检测。图2为本发明一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的原理图。
在下水解成产物4‑甲基伞形酮，在322nm激发时，产物4‑甲基伞形酮与Eu @MOF‑253的发射峰分别在450nm和617nm，可以构建比率荧光检测，同时可以形成由红色到蓝色的荧光颜色变化，实现比率色度检测。图2为本发明一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的原理图。
[0027] 本发明提供的检测方法借助酶解反应底物(4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷)被β‑3+
葡萄糖醛酸苷酶水解产生4‑甲基伞形酮(4‑MU)具有蓝色荧光，Eu @MOF‑253具有红色荧光。
这样的双发射设计不仅具有更高的准确度(自校正)，还具备更高灵敏度(双响应)，不仅如此，由于MOF中镧系离子特征荧光光谱狭窄、单色性好、色纯度高，且红色、蓝色均为RGB三原色，双发射荧光混合显色后很容易实现裸眼可视化的最佳灵敏度。
葡萄糖醛酸苷酶水解产生4‑甲基伞形酮(4‑MU)具有蓝色荧光，Eu @MOF‑253具有红色荧光。
这样的双发射设计不仅具有更高的准确度(自校正)，还具备更高灵敏度(双响应)，不仅如此，由于MOF中镧系离子特征荧光光谱狭窄、单色性好、色纯度高，且红色、蓝色均为RGB三原色，双发射荧光混合显色后很容易实现裸眼可视化的最佳灵敏度。
[0028] 本发明的有益效果在于：
[0029] 1、本发明提供一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，可以实现比率荧光和/或比率色度检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性，具有操作简单、响应快、准确度高、灵敏度高、精密度好等突出优点；
[0030] 2、本发明提供一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性，可实现高灵敏裸眼可视化检测(红色到蓝色)；
[0031] 3、本发明提供一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针，其中含有Eu3+@MOF‑253，检测限低，可达到0.03U/L；
[0032] 4、本发明提供一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性，具有良好的选择性，受干扰物影响小，精密度好，准确度高；
[0033] 5、可应用于微量血清样本(仅需50μL)中β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的高灵敏、高准确、高精密检测，适合用于临床血清样本中β‑葡萄糖醛酸苷酶活性检测以及相关疾病的早期诊断。
附图说明
[0034] 图1为Eu3+@MOF‑253制备和表征图(其中，图1a为Eu3+@MOF‑253制备的流程图，图1b3+ 3+
为Eu @MOF‑253的PXRD图，图1c为Eu @MOF‑253的红外光谱图，图1d为MOF‑253的透射电镜
3+
图，图1e为Eu @MOF‑253的透射电镜图)；
为Eu @MOF‑253的PXRD图，图1c为Eu @MOF‑253的红外光谱图，图1d为MOF‑253的透射电镜
3+
图，图1e为Eu @MOF‑253的透射电镜图)；
[0035] 图2为本发明一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的原理图；
[0036] 图3为本发明一种基于金属有机骨架的β‑葡萄糖醛酸苷酶探针检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的流程图；
[0037] 图4是实施例2以比率荧光为纵坐标对GCU活性的响应标准曲线；
[0038] 图5是实施例3以色度比B/R为纵坐标对GCU活性的响应标准曲线；
[0039] 图6是该GCU检测方法的选择性以及抗干扰能力检测结果图，其中，图6a为该GCU检测方法的选择性检测结果图，图6b为各种干扰物对检测的影响检测结果图。
具体实施方式
[0040] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0041] 以下实施例中，Eu3+@MOF‑253的制备包括如下步骤：
[0042] Eu3+@MOF‑253材料通过溶剂热法制备得到。将0.635mmol六水合氯化铝和0.625mmol2，2’‑联吡啶‑5，5’‑二羧酸溶解于10mL N,N‑二甲基甲酰胺中，转移到高压反应釜，搅拌30min后，在120摄氏度条件下油浴加热24小时，然后自然冷却到15～35摄氏度，最后采用N,N‑二甲基甲酰胺和无水乙醇各洗涤2次，在60摄氏度条件下真空干燥即得MOF‑
253。将制备得到的0.4mmol MOF‑253、4mmol六水合硝酸铕和30mL无水乙醇加入圆底烧瓶中，60摄氏度条件下搅拌回流24h，最后采用无水乙醇洗涤2次。在60摄氏度条件下真空干燥
3+ 3+ 3+
即得Eu @MOF‑253。图1为Eu @MOF‑253制备和表征图，其中，图1a为Eu @MOF‑253制备的流
3+ 3+
程图，图1b为Eu @MOF‑253的PXRD图，图1c为Eu @MOF‑253的红外光谱图，图1d为MOF‑253的
3+
透射电镜图，图1e为Eu @MOF‑253的透射电镜图。
253。将制备得到的0.4mmol MOF‑253、4mmol六水合硝酸铕和30mL无水乙醇加入圆底烧瓶中，60摄氏度条件下搅拌回流24h，最后采用无水乙醇洗涤2次。在60摄氏度条件下真空干燥
3+ 3+ 3+
即得Eu @MOF‑253。图1为Eu @MOF‑253制备和表征图，其中，图1a为Eu @MOF‑253制备的流
3+ 3+
程图，图1b为Eu @MOF‑253的PXRD图，图1c为Eu @MOF‑253的红外光谱图，图1d为MOF‑253的
3+
透射电镜图，图1e为Eu @MOF‑253的透射电镜图。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例采用探针底物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、用荧光光谱仪检测人血清中的GCU活性
[0045] 具体方法如下：取50μL血清、将100μL 20μM 4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、100μL 75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，将溶液置于恒温振荡器(800rpm)中，在37摄氏度下孵育100分钟，然后转移到石英比色皿中，采用荧光光谱仪测量。在322nm激发波长下记录了荧光发射光谱。记录450nm处的荧光强度。以荧光强度为纵坐标建立GCU活性的响应标准曲线。
[0046] 由结果可知，实施例所述方法检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的检测限为0.5U/L。
[0047] 实施例2
[0048] 本实施例采用探针底物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、添加Eu3+@MOF‑253、用荧光光谱仪检测人血清中的GCU活性
[0049] 具体方法如下：取50μL血清,将100μL 20μM 4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、55μL 3+
1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液，100μL 75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，
20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，将溶液置于恒温振荡器(800rpm)中，在37摄氏度下孵育100分钟，然后转移到石英比色皿中，采用荧光光谱仪测量。在322nm激发波长下记录了荧光发射光谱。最后计算450nm和617nm的荧光强度比。
1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液，100μL 75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，
20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，将溶液置于恒温振荡器(800rpm)中，在37摄氏度下孵育100分钟，然后转移到石英比色皿中，采用荧光光谱仪测量。在322nm激发波长下记录了荧光发射光谱。最后计算450nm和617nm的荧光强度比。
[0050] 检测过程参考附图3，直接以比率荧光为纵坐标建立的GCU活性的响应标准曲线如图4所示。
[0051] 基于比率荧光分析方式，本实施例采用荧光光谱仪检测GCU活性的结果如表1所示。
[0052] 表1人血清中GCU活性测定及加标回收实验结果(荧光光谱仪测定，n＝3)[0053]
[0054] 由结果可知，实施例所述方法检测β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的检测限为0.03U/L。
[0055] 实施例3
[0056] 本实施例采用探针底物为4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、添加Eu3+@MOF‑253、用照度计检测人血清中的GCU活性
[0057] 具体方法如下：取50μL血清,将100μL 20μM 4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、55μL 3+
1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液、100μL 75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，
20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，将溶液置于恒温振荡器(800rpm)中，在37摄氏度下孵育100分钟，然后转移到石英比色皿中，在暗箱中302nm紫外光激发下，用照度计进行RGB色度分析，从而实现对GCU活性的定量检测。
1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液、100μL 75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，
20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，将溶液置于恒温振荡器(800rpm)中，在37摄氏度下孵育100分钟，然后转移到石英比色皿中，在暗箱中302nm紫外光激发下，用照度计进行RGB色度分析，从而实现对GCU活性的定量检测。
[0058] 检测过程参考附图3，以比率色度为纵坐标建立的GCU活性的响应标准曲线如图5所示。可视化检测结果见表2。
[0059] 表2人血清中GCU活性测定及加标回收实验结果(比率色度测定，n＝3)
[0060]
[0061] 实施例4
[0062] 本实施例采用荧光光谱仪检测法和比率荧光的分析方式，测试了该方法对GCU活性测定的选择性和抗干扰能力。
[0063] 具体方法如下：配制如下溶液：加入100μL 20μM 4‑甲基伞形酮‑β‑葡萄糖醛酸苷、3+
55μL 1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液，不加GCU或加入适量GCU使其浓度为0U/L或25U/L，100μL
75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，在37摄氏度度下反应100分钟。此外，向溶液中分别加入不同种类的阴离子、阳离子、氨基酸、牛血清白蛋白、葡萄糖、干扰酶等(具体为钠离子、钾离子、碳酸根离子、硫酸根离子、醋酸根离子、溴离子、葡萄糖、半胱氨酸、酪氨酸、溶菌酶、谷氨酸、牛血清白蛋白)，溶液中，阴离子和阳离子干扰物质的浓度均为0.1mM。氨基酸、牛血清白蛋白和葡萄糖干扰物质的浓度为均0.05mg/mL。干扰酶的活性为0.05mg/mL。测试结果如图6所示。其中，图6a为该GCU检测方法的选择性(GCU组中GCU的浓度为25U/L，其余组中GCU的浓度为0U/L)；
图6b为各种干扰物对检测的影响(所有组中GCU的浓度均为25U/L)。由图可知，空白样品与添加其他物质的结果无显著差异，干扰物对GCU检测的影响可忽略不计，以上结果说明比率荧光法检测GUC具有很强的特异性和抗干扰能力。
55μL 1mg/mL Eu @MOF‑253水溶液，不加GCU或加入适量GCU使其浓度为0U/L或25U/L，100μL
75mM氯化钙水溶液，再加上一定量的缓冲液(pH＝5.3，20mM Bis‑Tris‑甘氨酸缓冲液)以使溶液总体积达到1mL，在37摄氏度度下反应100分钟。此外，向溶液中分别加入不同种类的阴离子、阳离子、氨基酸、牛血清白蛋白、葡萄糖、干扰酶等(具体为钠离子、钾离子、碳酸根离子、硫酸根离子、醋酸根离子、溴离子、葡萄糖、半胱氨酸、酪氨酸、溶菌酶、谷氨酸、牛血清白蛋白)，溶液中，阴离子和阳离子干扰物质的浓度均为0.1mM。氨基酸、牛血清白蛋白和葡萄糖干扰物质的浓度为均0.05mg/mL。干扰酶的活性为0.05mg/mL。测试结果如图6所示。其中，图6a为该GCU检测方法的选择性(GCU组中GCU的浓度为25U/L，其余组中GCU的浓度为0U/L)；
图6b为各种干扰物对检测的影响(所有组中GCU的浓度均为25U/L)。由图可知，空白样品与添加其他物质的结果无显著差异，干扰物对GCU检测的影响可忽略不计，以上结果说明比率荧光法检测GUC具有很强的特异性和抗干扰能力。
[0064] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在发明的保护范围之内。