一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途

摘要

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途。一种多重共刺激信号嵌合抗原受体，由信号肽、HBVSAg抗原结合结构域、胞外铰链区、跨膜区、多重胞内共刺激信号分子和胞内信号转导分子串联构成。本发明嵌合体抗原受体T细胞第一信号被激活时，第二信号CD28多重共刺激分子可以产生强烈的集群效应，杀伤肿瘤细胞。同时，这种多重激活的作用不会像注射CD28的激活型抗体一样，引发强烈T细胞免疫，造成潜在严重毒副作用；本发明的嵌合体抗原受体T细胞对HBV阳性肝癌细胞有很好的杀伤作用，具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种多重共刺激信号嵌合抗原受体，其特征在于，由信号肽、HBVSAg抗原结合结构域、胞外铰链区、跨膜区、多重胞内共刺激信号分子和胞内信号转导分子串联构成；其中编码靶向HBVSA嵌合体抗原结合受体的编码基因核酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为膜蛋白信号肽；

所述HBVSAg抗原结合结构域是以HBVSAg抗体为基础，构建其重链可变区和轻链可变区，并由短肽连接而成；

所述胞外铰链区选自IgG1FCCH2CH3铰链区、IgG2FCCH2CH3铰链区、IgG4FCCH2CH3铰链区、CD28铰链区和CD8铰链区中的一种或多种；

所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；

所述胞内共刺激信号分子选自CD28胞内结构域、CD134/OX40胞内结构域、CD137/4‑1BB胞内结构域、LCK胞内结构域、ICOS胞内结构域和DAP10胞内结构域中的一种或多种；

所述胞内信号转导分子为CD3ζ胞内结构域。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述HBVSAg单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述胞外铰链区为IgG1FC铰链区，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述跨膜区为CD28跨膜区，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述胞内共刺激信号分子为1XCD28胞内结构域、2XCD28胞内结构域和/或3XCD28胞内结构域；1XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.4所示；2XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述CD3ζ胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的编码基因。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1‑3任一项所述的嵌合体抗原受体，或包含权利要求4所述的载体。

6.根据权利要求5所述的细胞为T细胞或其他免疫细胞。

7.权利要求1‑3任一项所述嵌合体抗原受体修饰的细胞在制备治疗HBV引起疾病药物中的应用，其特征在于，所述疾病为乙肝、肝硬化或肝癌。

8.一种药物，其特征在在于，所述药物包含权利要求1‑3任一项所述嵌合体抗原受体修饰的细胞和核苷酸类似物或干扰素。

9.一种嵌合体抗原受体修饰细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基因合成编码权利要求1‑3任一项所述嵌合体抗原受体的DNA片段，同时上下游分别添加双酶切位点，合成基因经双酶切后插入pCDH载体构成质粒；

(2)将抗HBVSAg嵌合体抗原受体的表达质粒转染至293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得慢病毒浓缩液；

(3)慢病毒浓缩液感染细胞从而获得靶向HBVSAg嵌合体抗原受体修饰的细胞。

说明书

一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

[0002] 肿瘤过继细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是将经处理的自体或异体免疫细胞(主要是自体细胞)回输给肿瘤患者，直接杀伤肿瘤细胞，或者通过激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞，达到治疗目的。当前肿瘤过继细胞治疗发展迅速，在多种恶性肿瘤的临床治疗中取得了非常好的疗效。肿瘤免疫细胞治疗被认为是最有前景的治疗恶性肿瘤的手段之一。

[0003] 嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor‑T cell，CAR‑T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T 细胞。嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗肿瘤是近年来肿瘤治疗领域取得的里程碑式的突破。其中用于治疗白血病、淋巴瘤的CAR‑T产品CTL019(诺华)和 KTE‑C19(Kite)先后获得美国突破性疗法认证，其在临床试验中病人的完全缓解率达到70％‑94％。良好的治疗效果促使美国FDA加速药品审批流程，在2017 年分别批准以上两家公司的CD19CAR‑T药物上市。

[0004] 肝癌(HCC)是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一，目前针对肝癌的各种治疗策略都不能显著延长肝癌患者的有效生存期。近年来，肿瘤免疫治疗取得飞速发展，在细胞免疫治疗上取得突破性进展，CAR‑T技术的发展为肝癌的治疗带来新的曙光。在针对HCC的CAR‑T治疗中，以Glypican‑3(GPC3)为靶点的 CAR‑T在临床前的研究中显现出良好的肝癌细胞杀伤作用。然而，虽然GPC3 在75％以上的HCC中呈现高表达，但其并非肿瘤特异性抗原，在肺、肾、女性生殖系统等正常组织中也存在表达，潜在的多器官脱靶效应不可避免。

[0005] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是诱发HCC的重要因素。作为一种嗜肝性病毒，HBV可通过多种途径诱导肝细胞的癌变，这也是导致我国 HBV相关性肝癌高发的重要原因。世界范围内，HBV感染相关的HCC占50％左右，而在我国HCC患者中有近90％呈现HBV阳性。更重要的是，HBV感染宿主细胞后病毒HBV表面抗原(HBVsAg)可以在肝细胞表面表达。

[0006] T细胞活化需要两个信号的刺激，即两种T细胞活化相关信号。其中，T细胞表面TCR‑CD3复合体与抗原肽‑MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如 B7)结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。但肿瘤细胞第一信号刺激源(如MHC分子)与第二信号配体(如B7)等缺乏或表达下降，无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而无法激活T细胞免疫反应。

[0007] 嵌合抗原受体CAR通过胞外特异性识别肿瘤抗原的单链抗体片段(Single chain Variable Fragment,scFv)，激活胞内信号CD3ζ或FcεRIγ的 ITAM(immunoreceptor tyrosine‑based activation motifs)信号传递。但是第一代 CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代与第三代的CAR是将T细胞激活所需的两个信号进行了合并，将第二信号CD28或/和4‑1BB细胞内信号区域直接连接到 CD3ζ分子，从而绕过了肿瘤细胞通常第二信号如B7等缺乏所引起T细胞不能激活的障碍。第一信号与第二信号合并后，大大提高了对T细胞激活、增殖及杀伤能力，使之疗效大幅度增加，基于目前对T细胞激活机制的理解，CD28、 4‑1BB分子能够提供第二个激活信号并进一步加强TCR/CD3信号。

[0008] 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途，以解决现有嵌合体抗原受体T细胞在治疗肝癌时存在潜在的多器官脱靶效应的问题。

[0010] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0011] 一种多重共刺激信号嵌合抗原受体，由信号肽、HBVSAg抗原结合结构域、胞外铰链区、跨膜区、多重胞内共刺激信号分子和胞内信号转导分子串联构成。

[0012] 作为优选，所述信号肽为膜蛋白信号肽；

[0013] 所述HBVSAg抗原结合结构域是以HBVSAg抗体为基础，构建其重链可变区和轻链可变区，并由短肽连接而成；

[0014] 所述胞外铰链区选自IgG1 FC CH2CH3铰链区、IgG2 FC CH2CH3铰链区、 IgG4 FC CH2CH3铰链区、CD28铰链区和CD8铰链区中的一种或多种；

[0015] 所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；

[0016] 所述胞内共刺激信号分子选自CD28胞内结构域、CD134/OX40胞内结构域、 CD137/4‑1BB胞内结构域、LCK胞内结构域、ICOS胞内结构域和DAP10胞内结构域中的一种或多种；

[0017] 所述胞内信号转导分子为CD3ζ胞内结构域。

[0018] 更为优选的，所述HBVSAg抗体的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0019] 所述胞外铰链区为IgG FC铰链区，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

[0020] 所述跨膜区为CD28跨膜区，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

[0021] 所述胞内共刺激信号分子为1XCD28胞内结构域、2XCD28胞内结构域和/ 或3XCD28胞内结构域；1XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.4所示； 2XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

[0022] 所述CD3ζ胞内结构域核酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0023] 本发明第二个目的在于提供一种编码基因，所述编码基因编码靶向HBVSA 嵌合体抗原结合受体，其核酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。

[0024] 本发明第三个目的在于提供一种载体，所述载体包上述的编码基因。

[0025] 本发明第四个目的在于提供一种细胞，所述细胞包含上述的嵌合体抗原受体，或包含上述的载体；所述的细胞为T细胞或其他免疫细胞。

[0026] 本发明第五个目的在于提供上述嵌合体抗原受体修饰的细胞在制备治疗 HBV引起疾病药物中的应用，所述疾病为乙肝、肝硬化或肝癌。

[0027] 本发明第七个目的在于在于提供一种药物，所述药物包含上述嵌合体抗原受体修饰的细胞和核苷酸类似物或干扰素，核苷酸类似于物包括拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯和克拉夫定。

[0028] 本发明第八个目的在于在于提供一种嵌合体抗原受体修饰细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0029] (1)基因合成编码权利要求1‑3任一项所述嵌合体抗原受体的DNA片段，同时上下游分别添加双酶切位点，合成基因经双酶切后插入pCDH载体构成质粒；

[0030] (2)将抗HBVSAg嵌合体抗原受体的表达质粒转染至293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得慢病毒浓缩液；

[0031] (3)慢病毒浓缩液感染细胞从而获得靶向HBVSAg嵌合体抗原受体修饰的细胞。

[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0033] (1)本发明以HBVSAg为靶点设计嵌合体抗原受体T细胞，借助其对HBV 的识别杀伤癌细胞，能够最大限度的避免嵌合体抗原受体T细胞脱靶损伤肝脏之外的任何器官，为嵌合体抗原T细胞治疗HCC提供了新的探究方向；且本发明的构建的靶向HBVSAg的嵌合体抗原受体T细胞通过表型分析和体外杀伤实验证实其对HBV阳性肝癌细胞具有很好的杀伤作用，显现出比较好的应用前景。

[0034] 本发明嵌合体抗原受体T细胞第一信号被激活时，第二信号CD28多重共刺激分子可以产生强烈的集群效应，杀伤肿瘤细胞。同时，这种多重激活的作用不会像注射CD28的激活型抗体一样，引发强烈T细胞免疫，造成潜在严重毒副作用。

附图说明

[0035] 图1为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR载体示意图；

[0036] 图2为分别用抗人IgG抗体或抗人Fab抗体流式检测 1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR表达情况；

[0037] 图3为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR‑T流式表达统计图；

[0038] 图4为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR‑T耗竭表型表达；

[0039] 图5为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR‑T记忆细胞表型表达；

[0040] 图6为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR‑T对靶细胞杀伤情况；

[0041] 图7为1XCD28/2XCD28/3X28靶向HBV的CAR‑T对靶细胞细胞因子分泌。

具体实施方式

[0042] 下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0043] 实施例1：表达CAR慢病毒的载体构建

[0044] 全基因合成HBV CAR‑1XCD28 DNA片段、HBV CAR‑2XCD28 DNA片段和HBV CAR‑3XCD28 DNA片段，合成基因经双酶切后插入pCDH载体构建质粒，构建得到的载体如图1所示；

[0045] 本实施例中，HBV CAR‑1XCD28、HBV CAR‑2XCD28和HBV CAR‑3XCD28 的核酸写分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。

[0046] 实施例2：表达CAR慢病毒包装

[0047] D10细胞完全培养配制：DMEM、10％FBS、1％Sodium Pyruvate、1％HEPES 置于4℃冰箱中备用，D5为5％FBS，其他类似。

[0048] Day 0：293T细胞小于20代，不过分长满；以2×107铺150mm皿，20mL D10 培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

[0049] Day 1：293T细胞融合度达到60‑80％时进行转染，铺板到转染的时间不大于24h；

[0050] 慢病毒按下表1准备质粒复合物

[0051] 表1质粒复合物所需材料

[0052] 容器 面积 细胞数 体积 主质粒 RRE REV VSVG PEI OptiMEM3 2 7
15cm 151cm 2×10 20mL 18ug 10ug 10ug 7ug 70uL 1mL+1mL

[0053] 一边轻轻旋涡质粒，一边将PEIpro滴加进去，充分混匀并在室温下静置 15min，形成复合物；将质粒‑PEI复合物缓缓加入到150mm 293T细胞中，充分混匀，培养箱培养6h；

[0054] Day 1：将转染6h的293T细胞，轻轻换液成20mL新鲜D10培养基；

[0055] Day 3：收集转染48h的病毒上清，暂存于4℃冰箱中，继续添加D10培养基20mL；

[0056] Day 4：收集转染72h的病毒上清，与收集转染48h的病毒上清混合；4度，3000g离心10min，或过0.45um滤器去除碎片保留上清进行病毒浓缩，病毒浓缩和纯化也可以选择100K的超滤杯浓缩将过滤后的上清液加入到过滤杯中；

[0057] 4度，3000g离心至所需病毒浓缩的体积，离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的过滤液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上；

[0058] 4度，3000g离心2min，样品收集杯中的即为病毒浓缩液，收集浓缩液，分装，‑70℃以下保存。

[0059] 实施例3：制备1X28/2X28/3X28 HBV CAR‑T

[0060] 分离获得较纯的CD3+T细胞，用含T细胞培养基调整细胞浓度至1×106/mL；将细胞以1mL/孔接种到预先用抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体，再加入400IU/mL的白细胞介素2，刺激培养24h后病毒感染；

[0061] 细胞感染后，每天观察细胞浓度，适时补加含IL‑2400IU/mL的T细胞培养液，使T细5
胞的密度维持在5×10/mL，使细胞扩增；

[0062] 细胞感染5d后分别用抗人IgG抗体或抗人Fab抗体流式检测 1X28/2X28/3X28靶向HBV的CAR表达情况，结果如图2和图3所示；

[0063] 从图2和图3可以看出，CAR阳性率都在70％以上，说明1X28/2X28/3X28 HBV CAR‑T都可以成功稳定表达。

[0064] 实施例4：流式细胞仪检测CAR‑T耗竭表型表达

[0065] 制备1X28/2X28/3X28 HBV CAR‑T 10天后，同时染色CD4、CD8、PD‑1、 LAG‑3、TIM‑3抗体，流式检测各组CAR‑T细胞耗竭表型，结果如图4所示；

[0066] 从图4可以看出，2X28 HBV CAR‑T的耗竭表型表达最高，LAG‑3和PD‑1 双阳性都高于其他组，而其他组的耗竭指标都在20％以下，表明2个CD28共刺激信号可使T细胞更早耗竭。

[0067] 实施例5：流式细胞仪检测CAR‑T记忆细胞表型表达

[0068] 制备1X28/2X28/3X28 HBV CAR‑T 10天后，同时染色CD4、CD8、CD45RA、 CD62L抗体，流式检测各组CAR‑T记忆细胞表型，结果如图5所示；

[0069] 从图5可以看出，2X28 HBV CAR‑T的记忆细胞表型最低，1个CD28或3 个CD28共刺激域的CAR‑T的CD62L表达都在80％左右，且记忆干细胞比例 (CD45RA和CD62L双阳性)也在60％以上，而2个CD28共刺激域的CAR‑T 记忆表型普遍要低10％以上，表明2个CD28共刺激信号可使T细胞记忆表型降低。

[0070] 实施例6：CAR‑T细胞与靶细胞共培养后对靶细胞杀伤

[0071] M10细胞完全培养基制备：MEM、10％FBS、1％Sodium Pyruvate、1％Hepes、1％NEAA，配制好后置于4℃冰箱中备用；

[0072] 培养板准备：取透明底白边96孔贴壁培养板，使用Collagen1：30稀释液 37℃包被30min，PBS洗涤2次后备用；

[0073] 靶细胞准备：消化靶细胞，500g离心5min，去上清，使用M10培养基重悬细胞，取样5
计数，细胞悬液稀释至10/mL；

[0074] 靶细胞种板：按照104/孔、100uL/孔进行96孔板接种，混匀后放入二氧化碳培养箱进行培养；

[0075] 共培养杀伤：取分化的96孔板培养靶细胞(靶细胞按5×104/孔计算)，去上清，加M10培养基50uL/孔，按照杀伤效靶比计算加入CAR‑T细胞量，取需要量的CAR+细胞，稀释至适当浓度使CAR‑T细胞100uL/孔，此处需要说明的是：例如效靶比是3：1，CAR‑T细胞稀释至4
1.5×10/mL；

[0076] 放入二氧化碳培养箱37℃，5％CO2共培养2d，加入LuciferaseAssay System， 50uL/孔，充分震荡后使用酶标仪检测，检测结果见图6；

[0077] 计数方法：杀伤效率＝(1‑目的孔平均值/单独Target cells孔平均值)×100％；

[0078] 从图6可以看出，1X28和2X28 HBV CAR‑T都可以有效杀伤靶细胞，杀伤效率跟效靶比正相关，但3X28 HBV CAR‑T几乎没有杀伤，表明3个CD28共刺激域可能过度活化T细胞使细胞失能。

[0079] 实施例7：CAR‑T细胞与靶细胞共培养后对靶细胞细胞因子分泌

[0080] 打开冻干的标准品(C)，加入2.0ml的Assay Diluent(G)，室温平衡至少 15min；

[0081] 取10支EP管，标记为S1‑S10，稀释标准品；

[0082] 根据样本总量，计算微球混合液总量及6种检测微球(A1‑A6)的体积；

[0083] 依次取捕捉微球A1‑A6，充分震荡后混匀至EP管中，混匀后标记待用；

[0084] 取样本管和标准品管标记，加入20μl/管检测微球混合液至所有检测管中；

[0085] 取新鲜样本或复溶‑80℃保存样本至室温，400g离心10min；

[0086] 取50μl样本和标准品至对应的EP管中；

[0087] 向所有检测管中加入20μl/管的Human Th1/Th2‑II PE Detection Reagent(B) 室温避光孵育180min；

[0088] 取出所有样本，加入1ml WashBuffer(F)，400g离心10min；

[0089] 弃上清后加入200μlWash Buffer重悬样本，上机检测，检测结果见图7；

[0090] 从图7可以看出，1X28和2X28 HBV CAR‑T都可以在有效杀伤靶细胞的同事，大量分泌IFNg和TNF，但3X28 HBV CAR‑T则分泌较少，表明3个CD28 共刺激域可过度活化T细胞使细胞失能，分泌细胞因子能力减弱。

[0091] 从上所述，本发明嵌合体抗原受体T细胞第一信号被激活时，第二信号CD28 多重共刺激分子可以产生强烈的集群效应，杀伤肿瘤细胞。

[0092] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

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