一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法

摘要

本发明公开了一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，属于生物抗体表达技术领域。在诱导表达前对转化有单域抗体基因的大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5‑10min，然后利用低剂量IPTG诱导菌种表达，10‑22℃低温培养，获得大肠杆菌周质表达的单域抗体。本发明所述方法能够将单域抗体表达正确定位于周质空间，克服大肠杆菌在定向周质表达重组单域抗体时无法正确分泌而堆积在胞内的缺陷，同时，该方法还能够有效促进单域抗体在大肠杆菌周质空间中以单体可溶形式高效表达，从而使后续抗体纯化和应用易于实现。

权利要求

1.一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，其特征在于，步骤如下：（1）将转化有单域抗体基因的重组大肠杆菌培养至OD600为1.0‑1.2；

（2）将步骤（1）培养后的重组大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5‑10 min；

（3）向步骤（2）处理后的重组大肠杆菌中添加终浓度为10 μg/mL‑80 μg/mL的IPTG；10‑

16℃诱导培养，促进单域抗体在大肠杆菌周质表达；

所述重组大肠杆菌中转化有单域抗体基因的重组表达载体；所述重组表达载体上包含信号肽PelB序列、单域抗体基因序列、6×His标签序列；

所述单域抗体为鲨源单域抗体，由鲨源单域抗体基因表达而成；所述鲨源单域抗体基因来源于条纹斑竹鲨，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述鲨源单域抗体为抗透明质酸合成酶抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，其特征在于，所述IPTG的终浓度为10 μg/mL。

3.根据权利要求1所述的促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，其特征在于，所述诱导培养温度为16℃。

说明书

一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物抗体表达技术领域，具体涉及一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法。

背景技术

[0002] 软骨鱼(包括鲨鱼、鳐等)和骆驼科(包括单峰驼、双峰驼、羊驼等)动物的血清中存在着仅由重链组成的抗体，其轻链天然缺失。由于缺乏轻链，这种特殊的抗体起到抗原识别和结合作用的只有重链可变区(在软骨鱼类动物中称为VNAR，在驼类动物中称为VHH)。

[0003] 为发挥识别和结合抗原的作用，在体外将这种重链可变结构域进行重组表达，形成单域抗体(Single domain antibody)。单域抗体不仅与常规抗体一样具有良好的抗原识别与结合能力，而且还具有如下优势：(1)分子量小，作为目前已知具有完整抗体功能的最小分子片段，其组织渗透性高；(2)亲水性佳；(3)稳定性强，能耐受苛刻的温度和pH条件；(4)更加灵活的铰链区，没有轻重链可变区的错配，使多价抗体的产生更容易；(5)无需糖基化修饰，更加适合细菌表达体系，易于大量制备；(6)具有更长的抗原互补决定区(CDR)，可以结合到常规抗体无法接触到的抗原缝隙或凹陷表位。受限于培养条件，目前鲨鱼来源的单域抗体研究和应用均较少，有着广阔的开发前景。

[0004] 大肠杆菌作为传统生物学模式生物之一，因其易于培养，遗传背景透彻，是实验室表达异源蛋白的首选生物。大肠杆菌的细胞壁薄但结构复杂，外膜与细胞膜之间存在周质间隙。根据表达的部位，将外源蛋白表达形式分为三种：(1)胞外分泌表达；细菌将异源蛋白分泌到培养基中，但仅适用于小分子蛋白，且在实验室中不利于纯化；(2)胞质表达；其表达量较大，但细菌胞内为还原性环境，含有二硫键的蛋白质往往不能正确折叠并形成二硫键，最终容易大量形成无生物功能的包涵体；虽然有些研究从变性复性的角度尝试恢复包涵体蛋白质的活性，但其工艺繁琐复杂，复性率低，难以进行大批量的处理；(3)周质表达；周质空间呈现氧化性环境，当中含有促进蛋白质折叠的分子伴侣和帮助二硫键正确形成的酶，不仅利于蛋白质中二硫键的形成还可以增加蛋白质的溶解性；另外，在周质空间当中蛋白酶含量较低，杂蛋白少，不仅有利于异源蛋白的稳定存在和下游纯化，而且能减少异源蛋白对于宿主菌的毒性和代谢负担。

[0005] 目前鲨源单域抗体的表达方法不够成熟，在实际生产应用中，周质表达水平与质粒和目的蛋白本身特性有很大的关系，常常会出现如下问题：

[0006] (1)许多单域抗体在大肠杆菌中无法正确表达，或是表达量很低，无法进行后续的应用；

[0007] (2)部分单域抗体虽然能够在胞内表达，但大量形成二聚体或多聚体，或无生物功能的包涵体，无法进行后续应用。

[0008] (3)设计定位于周质空间的单域抗体虽然有所表达，但是无法正确分泌至细菌周质，反而堆积在胞内。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于，提供一种使单域抗体在大肠杆菌周质空间以单体可溶形式高效表达的方法；且该方法克服了大肠杆菌在定向周质表达重组单域抗体时无法正确分泌而堆积在胞内以及表达量低无法分离纯化的缺陷。

[0010] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0011] 一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，步骤如下：

[0012] (1)将转化有单域抗体基因的重组大肠杆菌培养至OD600为1.0‑1.2；

[0013] (2)对步骤(1)中的重组大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5‑10min；

[0014] (3)向步骤(2)处理后的重组大肠杆菌中添加终浓度为10μg/mL‑80μg/mL的IPTG；10‑22℃诱导培养，促进单域抗体在大肠杆菌周质表达。

[0015] 上述方法中，所述重组大肠杆菌中转化有单域抗体基因的重组表达载体；所述重组表达载体上包含信号肽PelB序列、单域抗体基因序列、6×His标签序列，其中，构建重组表达载体时，优选采用pET系列空质粒载体进行；pET系列载体包含T7强启动子利于细菌维持目的蛋白的高水平表达。

[0016] 在一个具体的实施例中，进一步选取pET22b作为表达载体，该载体包含氨苄青霉素(Ampicillin)抗性标记以供细菌的筛选。另外，pET22b上含有PelB信号肽和6×His标签序列，pelB信号肽能够将相连的目的蛋白引导入周质空间，6×His标签序列提供蛋白质的示踪及纯化。将目的蛋白的基因序列精确插入到PelB信号肽基因序列的后面，即可构建出表达单域抗体的重组表达载体。

[0017] 在一个具体的实施例中，具体选择大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株，大肠杆菌感受态BL21(DE3)包含整合在细菌染色体上的λ噬菌体的DE3区域，该区域的lacUV5启动子可以有效调控T7 RNA聚合酶的表达，适合含有T7启动子的表达载体。

[0018] 在一个具体的实施例中，所述0℃冰激处理是利用冰水混合物进行处理。

[0019] 在一个具体的实施例中，所述IPTG的终浓度优选为10μg/mL。

[0020] 在一个具体的实施例中，所述诱导培养温度优选为10‑16℃，进一步优选为16℃。

[0021] 在一个具体的实施例中，提供了一种大肠杆菌周质表达鲨源单域抗体的方法，步骤如下：

[0022] (1)将转化有鲨源单域抗体基因的重组大肠杆菌培养至OD600为1.0‑1.2；

[0023] (2)对步骤(1)中的重组大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5‑10min；

[0024] (3)向步骤(2)处理后的重组大肠杆菌中添加终浓度为10μg/mL‑80μg/mL的IPTG；10‑22℃诱导培养，促进鲨源单域抗体在大肠杆菌周质表达。

[0025] 所述鲨源单域抗体基因来源于条纹斑竹鲨，具体为抗透明质酸合成酶抗体，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0026] 本发明的有益效果在于：

[0027] (1)与常规的胞质表达方法相比，本发明将抗体分泌到周质空间，维持了均一的单体可溶状态，多聚化现象基本消失。

[0028] (2)与常规的周质表达系统(如pGC表达系统)相比，本发明能够显著提高单域抗体在周质空间的表达量，减少抗体在胞内堆积的现象。

[0029] (3)与常规的诱导方法相比，本发明采用的T7强启动子、低诱导剂(IPTG)组合能够有效节省IPTG的用量，在最优的IPTG诱导实施方案当中，使用的IPTG终浓度仅为通常工作浓度的1/10。考虑到诱导剂的昂贵价格，大规模表达VNAR时，本发明的技术方案能够极大地节省成本。

附图说明

[0030] 图1为pGC表达质粒组成示意图(A)与使用pGC质粒表达出的周质蛋白提取液的蛋白质免疫印迹示意图(B)；

[0031] 图2为VNAR‑pET22b表达质粒组成示意图；

[0032] 图3为不同诱导培养温度表达条件下胞质和周质提取液蛋白质免疫印迹示意图；

[0033] 图4为不同IPTG浓度诱导表达条件下周质提取液蛋白质免疫印迹示意图；

[0034] 图5为诱导培养前低温冰激处理的胞质和周质提取液蛋白质免疫印迹示意图；

[0035] 图6为优化后的诱导条件与常规条件下周质蛋白质提取液的蛋白质免疫印迹示意图；

[0036] 图3‑6中，“M”代表Marker；“1×”表示用以诱导的IPTG终浓度为100μg/mL，其余泳道表示的倍数为换算后相应的终浓度值。

具体实施方式

[0037] 本发明所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等技术均为常规实验操作，操作流程可详见《分子克隆指南(第三版)》。

[0038] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。具体如下：

[0039] 术语“大肠杆菌工程菌”指人工改造，易于接受外源基因，并进行外源蛋白重组表达的大肠杆菌。

[0040] 术语“表达载体”指经过人工改造，并含有外源蛋白基因序列的质粒载体，可以在大肠杆菌当中自我复制并表达外源蛋白产物。

[0041] 术语“周质空间”指革兰氏阴性细菌中，其外膜与细胞膜之间的狭窄空间，在本发明中等同于术语“周质间隙”。

[0042] 术语“表达”，是指狭义的蛋白质表达，即仅指大肠杆菌合成与定位外源蛋白的过程，不包括进一步的蛋白质提取分离与纯化步骤。

[0043] 术语“周质表达”，是指大肠杆菌合成外源蛋白质后最终被定位于周质空间的过程，在本发明中等同于“周质空间表达”。

[0044] 术语“异源蛋白”，是指大肠杆菌合成的重组质粒载体中的目的蛋白，在本发明中即指重组表达出的鲨源单域抗体(VNAR)，等同于“目的蛋白”、“单域抗体”。

[0045] 术语“单域抗体”，是指广义上的仅有重链可变区构成的抗体片段，在本发明中，除非特别指明“鲨源”、“鲨鱼来源”或“软骨鱼源”，否则指既包含驼类动物来源也包含软骨鱼动物来源。

[0046] 单域抗体分子表面含有一对半胱氨酸残基，容易在表达或应用过程中受到氧化还原环境影响，生成分子间二硫键，导致错误的二聚或多聚化现象。目前在针对含有这类二硫键的蛋白质表达领域方面，现有技术广泛地采用细菌的周质定向表达技术以便得到结构正确的异源抗体分子，周质表达要求质粒上添加信号肽，以便细菌识别并将目的蛋白分泌至周质间隙。如Nuttall SD等从质粒pUC19构建出含有信号肽的pGC表达体系(图1A)，使用常见的表达方法能够在大肠杆菌BL21菌株中进行VNAR的定向周质表达(参考文献：Methods Mol Biol.2012；911:27‑36以及J Immunol Methods.1996Jun 10；192(1‑2):13‑23)。但在实际操作中，本发明的发明人利用Nuttall SD等提供的方法对pGC质粒进行构建和表达，发现pGC质粒在大肠杆菌BL21菌株中周质表达VNAR的实际水平极低，如图1B所示，条带显色弱，蛋白表达量不足以支撑后续的检测或应用，表明在面对部分VNAR时，使用此法并不高效。这可能是由于该表达体系使用的lac启动子不够强，或者抗体本身性质所限，不能够在该体系内稳定持续地表达VNAR。

[0047] 低温表达体系能够降低胞内蛋白酶的活性，并且使蛋白质有足够的时间进行折叠，表达出的目的蛋白具有较高的纯度和可溶性，被广泛地用于单域抗体的异源表达。常见的低温表达是先将细菌培养至指数增长期，再将诱导温度降至20‑30℃对细菌进行低温培养(参考文献：Methods Mol Biol.2012；911:257‑75；Methods Mol Biol.2009；562:205‑14；J Biotechnol.2014Dec 10；191:236‑45以及Prep Biochem Biotechnol.2019；49(4):
315‑327)。除了在使用温度敏感型表达系统的情况下，本领域技术人员极少采用低于20℃的诱导表达方法，因为过分低的温度会导致细菌生长缓慢，蛋白质表达量下降的情况发生。

[0048] 下面以鲨源单域抗体表达方法为例，并参照数据进一步详细的描述本发明的技术方案。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0049] 实施例1构建表达鲨源单域抗体的大肠杆菌工程菌

[0050] 表达鲨源单域抗体的大肠杆菌工程菌的构建方法，具体步骤如下：

[0051] (1)含酶切位点的鲨源单域抗体基因的获得

[0052] 从含有鲨源单域抗体基因的载体中分离鲨源单域抗体基因片段，步骤包括PCR扩增、1.5％琼脂糖凝胶电泳以及DNA胶回收试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)回收扩增片段。

[0053] 鲨源单域抗体基因的序列如下述SEQ ID NO:1所示：

[0054] SEQ ID NO:1：

[0055]

[0056] 针对鲨源单域抗体基因设计引物，其中，5'端引物包含NcoⅠ酶切位点，3'端引物包含NotⅠ酶切位点，设计完后交由北京擎科新业生物技术有限公司(下文简称“擎科生物”)进行PCR扩增。具体设计的引物如下：

[0057] 5'端引物：5'‑GATCCATGGCCGAACGGGTTGAACA‑3'(SEQ ID NO:3)，下划线为NcoⅠ酶切位点；

[0058] 3'端引物：5'‑GTCGCGGCCGCTTTCACAGTCAGAATGGTCCCG‑3'(SEQ ID NO:4)，下划线为NotⅠ酶切位点。

[0059] 具体的PCR反应条件为：

[0060] 反应模板(100ng/μL)1μL，5'端引物(50ng/μL)2μL，3'端引物(50ng/μL)2μL，PCR反应混合液12.5μL，加ddH2O至25μL；PCR程序循环开始前95℃30秒，循环开始后95℃15秒，54℃15秒，72℃30秒，共进行35个循环，循环结束后72℃5分钟。

[0061] (2)重组质粒表达载体VNAR‑pET22b的构建

[0062] 用NcoⅠ和NotⅠ酶切pET22b空质粒载体和步骤(1)扩增获得的含酶切位点的鲨源单域抗体基因，然后由T4连接酶将鲨源单域抗体基因序列精确连接到PelB信号肽基因序列的后面，构建出表达VNAR片段的重组表达载体VNAR‑pET22b。

[0063] NcoⅠ和NotⅠ酶切pET22b空质粒载体的具体条件为：

[0064] 空质粒载体pET22b 1μg，NcoⅠ酶2μL，NotⅠ酶2μL， buffer 5μL，加ddH2O至50μL；37℃反应2小时。

[0065] T4连接酶连接pET22b空质粒及鲨源单域抗体基因的具体条件为：

[0066] 10×T4 buffer 2μL，T4连接酶0.5μL，经酶切的pET22b空质粒载体1μL，经酶切的鲨源单域抗体基因片段300ng(按插入片段比载体为3:1比例)，加ddH2O至20μL；于室温下反应1‑2小时。

[0067] 将连接完成的表达载体转化大肠杆菌感受态DH5α(购自擎科生物)并扩增后交由测序公司(擎科生物)进行测序，确认经连接反应的载体的正确性。使用小型质粒提取试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将扩增后的表达质粒(VNAR‑pET22b)提取出来，保存至‑20℃。构建的VNAR‑pET22b重组质粒表达载体，如图2所示。

[0068] (3)重组大肠杆菌工程菌VNAR‑pET22b/BL21(DE3)的构建

[0069] 将VNAR‑pET22b通过热激转化至感受态BL21(DE3)(购自擎科生物)中，即可得到重组大肠杆菌工程菌VNAR‑pET‑22b/BL21(DE3)，具体条件为：

[0070] 取100μL BL21(DE3)感受态细胞快速融化后置于冰上，向其中加入2μL VNAR‑pET22b质粒，冰浴30min后置于42℃水浴锅热激45‑60s，快速转移至冰上冷却2min。每管菌液加入500μL LB培养基，于37℃，220rpm摇床上活化培养1h。取50μL活化后的菌液，涂布于氨苄抗性的LB平板上。将平板置于37℃培养箱，倒置培养10‑12h。挑取单菌落交由测序公司(擎科生物)进行质粒测序，确认表达质粒的转入及目的蛋白基因序列的准确性。

[0071] 实施例2鲨源单域抗体在大肠杆菌周质空间的高效表达方法

[0072] (1)种子培养

[0073] 挑取少量甘油管保藏的重组大肠杆菌工程菌株VNAR‑pET22b/BL21(DE3)一级菌种，于LB平板(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)上划线，置于37℃培养箱中过夜培养。挑单克隆于15mL的LB培养基(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)，加入葡萄糖溶液至终浓度为1％(g/L)，于37℃、220rpm过夜摇菌培养作为二级种子。

[0074] (2)摇床培养

[0075] 将步骤(1)活化后的菌液按1:100的体积比例接种至1L的2×YT培养基中(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)，加入葡萄糖溶液至终浓度为0.1％(g/L)，于37℃、220rpm条件下培养至OD600为1.0‑1.2。

[0076] (3)诱导培养

[0077] 将第(2)步中的菌液置于冰水混合物中(0℃)冰激处理5min，待菌体彻底冷却后，往其中加入IPTG至终浓度为10μg/mL，于16℃、200rpm过夜表达16‑18h。

[0078] 实施例3诱导培养温度对大肠杆菌周质表达单域抗体的影响

[0079] 将实施例2步骤(2)中摇床培养至相应OD值的菌液加入诱导剂IPTG至终浓度为100μg/mL(1×)，分别转移至10℃、16℃、22℃、28℃，于200rpm下过夜表达16‑18h。采用渗透休克法(osmotic shock)提取周质蛋白，并使用细胞裂解缓冲液(Lysis buffer)对提完周质蛋白的胞质部分进行裂解，使用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)观察胞质中与周质空间中目的蛋白的表达情况。

[0080] 实验结果如图3所示，存留于胞质中的目的蛋白随着诱导温度的上升而增加，可能是由于温度升高后细胞合成蛋白质的速率加快导致目的蛋白在胞内积累挤占细胞转运通道所导致的。分泌至周质中的目的蛋白随着诱导温度的下降而增多，但10℃下表达的蛋白量不如在16℃下的多。可能原因是低温使得细胞合成蛋白质速率降低，能够较为顺利地分泌到周质空间当中，但当温度降至10℃时，细胞新陈代谢受到过分抑制，目的蛋白表达量反而更少，转运到周质的蛋白也相应的减少。在16℃下周质蛋白提取液当中目的蛋白的含量最高，可能是在这一温度附近细胞的蛋白质合成速率与分泌速率达到最佳的适配关系。同时对比周质与胞质中蛋白质发现，胞质中的蛋白质容易形成二聚体(～30kDa)的现象，而周质空间中的蛋白质为十分均一的单体状态。因此，利用大肠杆菌周质表达单域抗体，最佳的诱导培养表达温度为10℃‑16℃。

[0081] 实施例4IPTG浓度对大肠杆菌周质表达单域抗体的影响

[0082] 将实施例2步骤(2)中摇床培养至相应OD值的菌液加入诱导剂IPTG至终浓度分别为200μg/mL(2×)、100μg/mL(1×)、80μg/mL(0.8×)、50μg/mL(0.5×)、10μg/mL(0.1×)、1μg/mL(0.01×)。随后置于16℃、200rpm下过夜表达16‑18h。采用渗透休克法提取周质蛋白，并用蛋白质免疫印迹法观察周质空间当中目的蛋白的表达情况。

[0083] 实验结果如图4所示，在大肠杆菌当中常用的IPTG工作液浓度100μg/mL(1×)下的诱导效果并不好，在较低的IPTG浓度10μg/mL‑80μg/mL下，大肠杆菌周质空间的表达水平反而较高。因此，利用大肠杆菌周质表达鲨源单域抗体，较佳的IPTG诱导终浓度为10μg/mL‑80μg/mL，更佳的IPTG诱导终浓度为10μg/mL‑50μg/mL，最佳的IPTG诱导终浓度为10μg/mL。

[0084] 实施例5诱导前不同处理对大肠杆菌周质表达单域抗体的影响

[0085] 将实施例2步骤(2)中摇床培养至相应OD值的菌液分别置于室温下的冷水(约20℃)以及冰水混合物中(0℃)处理5min，彻底冷却菌体后，往其中加入IPTG至终浓度为10μg/mL，于16℃、200rpm过夜表达16‑18h。采用渗透休克法提取周质蛋白，并使用细胞裂解缓冲液对提完周质蛋白后的胞质部分进行裂解，使用蛋白质免疫印迹法观察在胞质中与周质空间中目的蛋白的表达情况。

[0086] 实验结果如图5所示，无处理组和室温冷水处理组在胞质当中的目的蛋白比冰水混合物组(0℃)的更多，这可能是由于未经冷却的菌体，在加入IPTG诱导剂之后，菌体迅速地合成目的蛋白，超过了细胞转运通道的转运能力，堆积在了细胞的内部。冰水混合物组(0℃)分泌到周质当中的目的蛋白比无处理组和室温冷水处理组的更多，这可能是因为经过冷却的菌体，代谢速率下降，在加入同等的IPTG后，合成蛋白质的速率也较低，使得目的蛋白顺利地转移到周质空间当中。可以看出，使用冰激的方法可以非常有效地促进目的蛋白的单体可溶性表达。

[0087] 对比例1

[0088] 将实施例2步骤(2)中摇床培养至相应OD值的菌液使用常规的条件表达：无冰激处理，直接加入诱导剂IPTG至终浓度为100μg/mL(1×)，置于28℃、200rpm过夜诱导表达16‑18h。

[0089] 采用渗透休克法提取实施例2和对比例1的周质蛋白，使用蛋白质免疫印迹法观察在周质空间中目的蛋白的表达情况。

[0090] 实验结果如图6所示，使用实施例2所述技术方案表达出的VNAR条带明显，而对比例1所述技术方案表达出的蛋白条带信号弱。对于鲨源单域抗体的有效周质表达，常规方法远远不够，加之IPTG的浓度不合适和未采用冰激处理的情况下，展示出的表达量非常低下，影响后续的实验与应用。使用了本发明技术方案的实验组有明显的表达，且表达出的目的蛋白纯度高，大多为可溶的单体形式，极大地便利了下游的检测和应用。

[0091] 上述在周质空间表达的鲨源单域抗体，其氨基酸序列如下述SEQ ID NO:2所示：

[0092] MAERVEQTPTTTTKEAGESLTVNCVLKGSSCALGNTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAYTCAGGTPWRHYIEGGGTILTVK

[0093] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。