一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法

摘要

本发明涉及化学品风险评估的技术领域，具体的更涉及一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法步骤至少包括：(1)个体尿样收集、基本信息收集：包括尿液收集、个人基本信息收集；(2)尿样DEHP代谢物含量水平检测：检测个体尿液中的4种常见DEHP代谢产物，包括MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP；(3)DEHP的生理毒代动力学(physiologically basedtoxicokinetic,PBTK)模型构建和验证；(4)结合尿DEHP代谢物含量水平、个体基本信息，输入DEHP的PBTK模型，推算出每日摄入量(estimateddaily intake,EDI)水平。本发明通过优化和应用DEHP的PBTK模型，降低传统估算方法的不确定性，实现准确性良好的个体每日DEHP暴露量的估计，用于暴露于DEHP的风险评估。

权利要求

1.一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤至少包括：

(1)个体尿样收集、基本信息收集：包括尿液收集、个人基本信息收集；

(2)尿样DEHP代谢物含量水平检测：检测个体尿液中的4种常见DEHP代谢产物，包括MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP；

(3)DEHP的PBTK模型构建和验证；

模型中MEHP在肝脏的分布应用弥散限制模型描述,肝组织和肝血流中MEHP量变化率分别表示为:

弥散系数PA设置为0.26；

(4)结合尿DEHP代谢物含量水平、个体基本信息，输入DEHP的PBTK模型，推算出EDI水平。

2.如权利要求1所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述个人基本信息收集至少包括性别、年龄、身高、体重、健康状况的收集。

3.如权利要求1所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤(2)中，尿样DEHP代谢物含量水平检测方法包括尿液前处理；

所述尿液前处理包括：将储存于‑20℃～‑10℃的尿样自然解冻，准确移取100μL校准标准品、尿液、高效液相色谱级水、高浓度质控样、低浓度质控样于自动进样器瓶；加入4‑甲基伞形酮葡萄糖苷酸标准液25μL，100μL同位素内标混合液以及β‑葡萄糖苷酶/乙酸铵缓冲液

25μL，混匀；37℃至少孵育120min后，加入50μL冰醋酸，150μL5％乙腈水溶液保存样品。

4.如权利要求1所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤(3)包括，通过分析摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程，确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程。

5.如权利要求4所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤(3)包括，S1：分析经日常饮食摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程；

S2：确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程；

S3：查找已公开数据，获得人体生理学参数、DEHP生化参数以及DEHP毒代动力学参数；

S4：根据S3中已公开数据，进行DEHP的生理毒物代谢动力学模型进行参数优化与模型验证。

6.如权利要求5所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述分析经日常饮食摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程包括：摄入的DEHP在小肠发生代谢为MEHP，未代谢部分在小肠吸收；DEHP和MEHP在肝脏、肾脏、脂肪组织有蓄积性，MEHP在血液中80％以与脂蛋白结合形式存在；DEHP经日常饮食摄入后，在人体肠黏膜细胞中肠酯酶及小肠的细胞外酶作用下水解产生MEHP，MEHP在人体小肠可依次代谢为MEHHP和MEOHP，在人体肝脏可代谢为多种代谢物，如MEHHP、MEOHP、MECPP；尿液为主要排泄途径，尿液中含有12～21种DEHP的代谢产物，至少包括MECPP、MEHHP、MEOHP、MEHP。

7.如权利要求3所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构包括：小肠、肝脏、性腺、脂肪、血液循环系统及其他组织器官；经日常饮食摄入的DEHP在肠、肝脏部分代谢生成MEHP；其中部分MEHP在肠进一步代谢生成MEHHP、MEOHP，在另一部分肝脏进一步代谢生成MEHHP、MEOHP、MECPP；经日常饮食摄入的DEHP在人体内代谢完全，无原型经尿液排出，而代谢产物均经尿液排出体外。

8.如权利要求5所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述MEHP在肝脏的分布应用弥散限制模型描述，即肝脏腔室进一步分成肝组织腔室和肝血流腔室，肝血流腔室体积与器官血流体积一致，肝组织腔室体积为器官体积与肝血流腔室体积的差值。

9.如权利要求5所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤S4中，根据S3中已公开数据进行模型参数优化与验证，使得模型可充分模拟人体摄入DEHP后代谢动力学过程。

10.如权利要求1所述的应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，其特征在于，步骤(4)中：尿液实测DEHP代谢物水平推算EDI值，首先需获得尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，为获得关联，设置EDI为梯度；模型输入初始值为三分之一EDI水平，输入量重复次数为3次，即模拟早、中、晚3餐；3次重复输入之间间隔6*60*60次运算，模拟早与中、中与晚餐之间间隔6小时，共运算5*24*60*60次，得到该个体的模型运行稳定状态下尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，并根据该关联，获得尿液实测DEHP代谢物含量水平计算得EDI水平，用于暴露于DEHP的风险评估。

说明书

一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学品风险评估的技术领域，具体的更涉及一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法。

背景技术

[0002] 邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯(DEHP)，CAS号为117‑81‑7，主要作为增塑剂被用于各种塑料制品中，如儿童玩具、地砖、墙面覆盖物、家具、油漆、粘合剂、食品包装盒容器、塑料管道、医疗设备等。由于DEHP与塑料是以非共价键形式结合，易于释放到周围环境中，造成食物、水、空气、土壤等污染。DEHP可通过多种途径进入人体，而食物摄入是人群中DEHP主要暴露途径。研究已经证实DEHP暴露与多种健康危害相关。动物试验报道DEHP具有生殖和发育毒性，还能够影响肝脏结构和功能、甲状腺功能、免疫功能和代谢稳态等。DEHP还具有内分泌干扰效应，具有类雌激素活性和抗雄激素活性。人群流行病学研究发现DEHP与儿童性早熟、女性不良妊娠结局、男性生殖功能受损以及成年人代谢性疾病等有关。美国环境保护署(Environmental Protection Agency,EPA)将DEHP列为可能的人类致癌物。大量人群生物监测研究在人体的血液、尿液、唾液、精浆和乳汁等检出DEHP或其代谢产物，证实人群DEHP暴露具有普遍性。因此，开展人群DEHP的暴露风险评估对于保障人群健康至关重要。

[0003] 人群化合物暴露风险评估主要包括两个步骤，首先是进行化合物的个体每日摄入量估计(estimated daily intake，EDI)，然后是将估计的EDI值与国家卫生标准推荐的个体每日容许摄入量限值(即健康指导值)进行比较，从而评估人群暴露于该化合物的健康风险。可见，估计EDI值是进行人群化合物暴露风险评估的关键步骤和先决条件，并且EDI值估计的不确定度高低决定了化合物暴露风险评估的准确度。

[0004] 目前用于估计个体DEHP暴露的EDI值的方法主要有3种，陈述如下：

[0005] 第一种方法是基于测量人群DEHP外暴露水平。方法1的具体步骤包括：首先通过问卷调查收集人群中每人每日各类食物，如谷类、蔬菜、水果等的摄入量，并检测各类食品中的DEHP含量水平；然后根据各类食物的摄入量与DEHP含量水平的乘积之和，估算出个体每日DEHP的摄入量(estimated daily intake，EDI)(参考文献：隋海霞,蒋定国,吴平谷,等.中国居民邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯膳食摄入水平及其风险评估[J].中华预防医学杂志,2015,49(003):218‑222.)。

[0006] 第二种方法是基于尿液生物监测数据(即DEHP内暴露水平)。方法2具体而言就是：首先收集个体的晨尿或随机点尿样，并检测尿样中DEHP代谢物的含量水平C；然后假定个体任意时段的尿液DEHP代谢物含量水平恒定，根据公式：

[0007]

[0008] 计算个体每日DEHP总摄入量估计值，式中V为根据个体体重估算的每日尿液排泄量，f是指经日常饮食摄入得到DEHP代谢产物经尿液排泄分数，B.W.是指个体体重(kg)(参考文献：Li X,Liu L,Wang H,Zhang X,Xiao T,Shen H.Phthalate exposure and cumulative risk in a Chinese newborn population.Environ Sci Pollut Res Int.2019；26(8):7763‑7771.doi:10.1007/s11356‑019‑04216‑z)。

[0009] 第三种方法也是基于尿液生物监测数据(即DEHP内暴露水平)。与第二种方法不同之处在于个体每日DEHP的总摄入量的估算方法不同。第三种方法除了检测个体的晨尿或随机点尿样中DEHP代谢物的含量水平C，同时还要检测尿液肌酐含量CCr，并估算个体每日尿液肌酐排泄量(m1)，然后根据公式：

[0010]

[0011] 计算个体EDI水平。(参考文献：Koch HM,Drexler H,Angerer J.An estimation of the daily intake of di(2‑ethylhexyl)phthalate(DEHP)and other phthalates in the general population.Int JHyg Environ Health.2003；206(2):77‑83.doi:10.1078/1438‑4639‑00205)

[0012] 上述3种估计个体DEHP暴露的EDI值的方法均存在明显的不足。方法1通过问卷调查结合食物测量来计算个体DEHP的摄入量，该方法的不确定度高。首先，获得个体各类食物的摄入量数据的误差较大。因为人们在参与问卷调查时存在回忆性偏差，可能遗漏部分食物种类，并且各类食物的摄入量仅凭个体主观判断，无法保证量化的准确性；其次，DEHP暴露来源众多，无法对每个人摄入的每一种食品中DEHP的含量水平都进行检测；此外，食物的不同烹饪方式、个体的消化吸收差异均可导致食物中DEHP不同程度的损失、变化，使人体实际摄入DEHP含量水平与食物中水平存在差异。因此，该方法得出的EDI值准确性差。在方法2中，虽然尿液DEHP代谢产物的含量水平能够反映人体实际DEHP的摄入水平，但现有研究已经证实：个体尿液DEHP代谢物的含量水平存在日内变异性(参考文献：Bastiaensen M,Malarvannan G,Gys C,Ait Bamai Y,Araki A,Covaci A.Between‑and within‑individual variability of urinary phthalate and alternative plasticizer metabolites in spot,morning void and24‑h pooled urine samples.Environ Res.2020,191:110248.doi:10.1016/j.envres.2020.110248)。而方法2假定个体任意时段的尿液DEHP代谢物的含量水平恒定，不可避免导致DEHP暴露量估算的不确定度增加，可能低估个体EDI水平。另一方面，影响个体每日尿液排泄量的因素多，体重仅是一个影响因素，故通过假定人每日尿液排泄率0.0224L/Kg体重来估算的每日尿液排泄量存在较大误差。方法3通过计算尿液肌酐排泄量来校正个体间尿液排泄量的差异，一定程度上可以降低结果的不确定度。但是现有研究已经表明：DEHP在肝脏代谢通过I相和II相代谢得到的葡萄苷酸化代谢产物并通过肾小管主动分泌，它们经肾脏排泄后，不适合用肌酐进行校正。(参考文献：Zhang Y,Cao Y,Shi H,Jiang X,Zhao Y,Fang X,Xie C.Could exposure to phthalates speed up or delay pubertal onset and development？A 1.5‑year follow‑up of a school‑based population.Environ Int.2015,83:41‑9.doi:10.1016/j.envint.2015.06.005.；Adibi JJ,Whyatt RM,Williams PL,Calafat AM,Camann D,Herrick R,Nelson H,Bhat HK,Perera FP,Silva MJ,Hauser R.Characterization of phthalate exposure among pregnant women assessed by repeat air and urine samples.Environ Health Perspect.2008,116(4):467‑73.doi:10.1289/ehp.10749.)故应用上述3方法中的任一方法估计人群DEHP暴露的个体EDI值均无法获得准确性良好的结果，而对人群中所有个体的DEHP暴露风险高估或低估会误导相关的管控措施执行，最终对人群健康造成不利影响。因此，亟需发明一种新方法提高人群DEHP暴露的个体EDI值计算准确度，最终提高人群DEHP暴露风险评估的准确性。

发明内容

[0013] 生理毒物代谢动力学模型(physiologically based toxicokinetic，PBTK)依据真实的生理解剖学结构，考虑化学品的理化特性、组织脏器的血流及代谢酶分布特征等，采用数学建模的方法，描述化学品及其代谢产物在血液和全身器官组织的动力学过程，包括吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)和排泄(excretion)。目前被广泛应用于化学品风险评估、管理等方面。一方面，利用DEHP的PBTK模型，可以实现DEHP内外暴露水平的直接关联。考虑到PBTK模型是充分结合人体生理学特征，代谢动力学特征，以及人群实际数据验证，因此可有效降低由内暴露推导外暴露的误差。具体而言，上文方法2或3获得的人群尿液生物监测数据(即DEHP内暴露水平)，通过PBTK模型可以直接用于推导外暴露浓度，有效避免了因借助肌酐排泄量间接推导而导致的人群DEHP暴露的个体EDI值估计的误差增加。另一方面，PBTK模型能够精确模拟经日常饮食摄入的DEHP在体内代谢和排泄过程，能够较好反映DEHP代谢产物含量水平的日内变化情况，即尿液DEHP代谢产物浓度的日内波动，避免了方法2和方法3中假定个体任意时段的尿液DEHP代谢物含量水平恒定导致的失真误差，进一步提高人群DEHP暴露的个体EDI值计算的准确性。因此，本发明提出一种应用PBTK模型估计个体每日DEHP摄入量(即个体EDI值)的新方法。该方法可以提高人群DEHP暴露的个体EDI值估计的准确度，最终促进人群DEHP暴露风险评估的可靠性。

[0014] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

[0015] 为了解决上述的技术问题，本发明中提供了一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，步骤至少包括：

[0016] (1)个体尿样收集、基本信息收集：包括尿液收集、个人基本信息收集；

[0017] (2)尿样DEHP代谢物含量水平检测：检测个体尿液中的4种常见DEHP代谢产物，包括MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP；

[0018] (3)DEHP的PBTK模型构建和验证；

[0019] (4)结合尿DEHP代谢物含量水平、个体基本信息，输入DEHP的PBTK模型，推算出EDI水平。

[0020] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤(1)中，所述个人基本信息收集至少包括性别、年龄、身高、体重、健康状况的收集。

[0021] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤(2)中，尿样DEHP代谢物含量水平检测方法包括尿液前处理；

[0022] 所述尿液前处理包括：将储存于‑20℃～‑10℃的尿样自然解冻，准确移取100μL校准标准品、尿液、高效液相色谱级水、高浓度质控样、低浓度质控样于自动进样器瓶；加入4‑甲基伞形酮葡萄糖苷酸标准液25μL，100μL同位素内标混合液以及β‑葡萄糖苷酶/乙酸铵缓冲液25μL，混匀；37℃至少孵育120min后，加入50μL冰醋酸，150μL 5％乙腈水溶液保存样品。

[0023] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤(3)包括，通过分析摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程，确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程。

[0024] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤(3)包括，

[0025] S1：分析摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程；

[0026] S2：确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程；

[0027] S3：查找已公开数据，获得人体生理学参数、DEHP生化参数以及DEHP毒代动力学参数；

[0028] S4：根据S3中已公开数据，进行DEHP的生理毒物代谢动力学模型进行参数优化与模型验证。

[0029] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤S1中，所述分析经日常饮食摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程包括：摄入的DEHP在小肠发生代谢为MEHP，未代谢部分在小肠吸收；DEHP和MEHP在肝脏、肾脏、脂肪组织有蓄积性，MEHP在血液中80％以与脂蛋白结合形式存在；DEHP经日常饮食摄入后，在人体肠黏膜细胞中肠酯酶及小肠的细胞外酶作用下水解产生MEHP，MEHP在人体小肠可依次代谢为MEHHP和MEOHP，在人体肝脏可代谢为多种代谢物，如MEHHP、MEOHP、MECPP；尿液为主要排泄途径，尿液中含有12～
21种DEHP的代谢产物，至少包括MECPP、MEHHP、MEOHP、MEHP。

[0030] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤S2中，所述DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构包括：小肠、肝脏、性腺、脂肪、血液循环系统及其他组织器官；经日常饮食摄入的DEHP在肠、肝脏部分代谢生成MEHP；其中部分MEHP在肠进一步代谢生成MEHHP、MEOHP，在另一部分肝脏进一步代谢生成MEHHP、MEOHP、MECPP；经日常饮食摄入的DEHP在人体内代谢完全，无原型经尿液排出，而代谢产物均经尿液排出体外。

[0031] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤S2中，所述MEHP在肝脏的分布应用弥散限制模型描述，即肝脏腔室进一步分成肝组织腔室和肝血流腔室，肝血流腔室体积与器官血流体积一致，肝组织腔室体积为器官体积与肝血流腔室体积的差值。

[0032] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤S4中，根据S3中已公开数据进行模型参数优化与验证，使得模型可充分模拟人体摄入DEHP后代谢动力学过程。

[0033] 作为一种优选的技术方案，本发明中步骤(4)中：尿液实测DEHP代谢物水平推算EDI值，首先需获得尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，为获得关联，设置EDI为梯度。模型输入初始值为三分之一EDI水平，输入量重复次数为3次，即模拟早、中、晚3餐；3次重复输入之间间隔6*60*60次运算，模拟早与中、中与晚餐之间间隔6小时，共运算5*24*60*60次，得到该个体的模型运行稳定状态下尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，并根据该关联，获得尿液实测DEHP代谢物含量水平计算得EDI水平。

[0034] 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

[0035] 本发明提出一种应用生理毒代谢动力学模型估计个体每日DEHP摄入量的新方法，通过优化和应用DEHP的PBTK模型，降低传统方法的不确定性，实现准确性良好的个体每日DEHP暴露量的估计。首先，本发明相较于膳食问卷调查数据与食物中DEHP含量水平数据，晨尿样检测数据为准确的个体化数据，并且真实反映个体DEHP的内暴露量情况；其次，利用DEHP的PBTK模型，可以实现DEHP内‑外暴露水平的直接关联，考虑到PBTK模型是充分结合人体生理学特征，代谢动力学特征，以及人群实际数据验证，因此可有效降低由内暴露推导外暴露的误差。具体而言，本发明中所述的方法获得的人群尿液生物监测数据(即DEHP内暴露水平)，通过PBTK模型可以直接用于推导外暴露浓度，有效避免了因借助肌酐排泄量间接推导而导致的人群DEHP暴露的个体EDI值估计的误差增加。最后，本发明中的PBTK模型能够精确模拟经日常饮食摄入的DEHP在体内代谢和排泄过程，能够较好反映DEHP代谢产物含量水平的日内变化情况，即尿液DEHP代谢产物浓度的日内波动，避免了现有技术用于估计个体DEHP暴露的EDI值的方法中假定个体任意时段的尿液DEHP代谢物含量水平恒定导致的失真误差，进一步提高人群DEHP暴露的个体EDI值计算的准确性。

附图说明

[0036] 图1为本发明中所述的一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法流程图。

[0037] 图2为成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构。

[0038] 图3为模型预测血液各代谢物含量水平时间变化趋势与公开文献报道值(黑色圆点)；其中，A)模型模拟血清MEHP含量水平；B)模型模拟MEHHP含量水平；C)模型模拟MEOHP含量水平；D)模型模拟血清MECPP含量水平。

[0039] 图4为实施例1中PBTK模型预测尿液代谢物含量水平时间变化趋势。

具体实施方式

[0040] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0041] 本发明提供了一种应用生理毒代谢动力学模型估计DEHP每日摄入量的方法，步骤至少包括：

[0042] (1)个体尿样收集、基本信息收集：包括尿液收集、个人基本信息收集；

[0043] (2)尿样DEHP代谢物含量水平检测：检测个体尿液中的4种常见DEHP代谢产物，包括MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP；

[0044] (3)DEHP的PBTK模型构建和验证；

[0045] (4)结合晨尿DEHP代谢物含量水平、个体基本信息，输入DEHP的PBTK模型，推算出EDI水平。

[0046] 本发明中所述MEHP为邻苯二甲酸单(2‑乙基己基)酯的简称；所述MEHHP为邻苯二甲酸单(2‑乙基‑5羟基己基)的简称；所述MEOHP为邻苯二甲酸单(2‑乙基‑5酮基己基)的简称；所述MECPP为邻苯二甲酸单(2‑乙基‑5羧基己基)的简称；

[0047] 在一些实施方式中，步骤(1)中，尿液收集：使用不含邻苯二甲酸酯类塑化剂等聚丙烯尿杯和采尿管收集研究对象清晨第一次尿样中端尿15mL，并记录尿液收集日期、时间。收集到的尿液及时放入冰盒中，统一避光运回实验室，‑20℃冰箱保存。

[0048] 在一些实施方式中，步骤(1)中，所述个人基本信息收集通过问卷调查收集样本人群的基本人口统计学信息，主要包括性别、年龄、身高、体重、健康状况等。

[0049] 一般人群实际暴露于DEHP主要为经日常饮食摄入，并且为长期低剂量暴露。在模型中设定个体性别、年龄、体重。

[0050] 在一些实施方式中，步骤(1)中，所述个人基本信息收集至少包括性别、年龄、身高、体重、健康状况的收集。

[0051] 在一些实施方式中，步骤(2)中，采用高效液相色谱‑串联质谱(HPLC‑MS/MS)检测个体尿液中的4种常见DEHP代谢产物，包括MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP。引用美国疾病预防控制中心(CDC)公布的检测方法。见Metabolites of phthalates and  phthalate alternatives analysis CDC。

[0052] 在一些实施方式中，步骤(2)中，检测方法包括尿样样品前处理，仪器分析和质量控制。

[0053] 在一些实施方式中，步骤(2)中，尿样DEHP代谢物含量水平检测方法包括尿液前处理；

[0054] 所述尿液前处理包括：将储存于‑20℃～‑10℃的尿样自然解冻，准确移取100μL校准标准品、尿液、高效液相色谱级水、高浓度质控样、低浓度质控样于自动进样器瓶；加入4‑甲基伞形酮葡萄糖苷酸标准液25μL，100μL同位素内标混合液以及β‑葡萄糖苷酶/乙酸铵缓冲液25μL，混匀；37℃至少孵育120min后，加入50μL冰醋酸，150μL 5％乙腈水溶液保存样品。

[0055] 在一些实施方式中，步骤(2)中，所述仪器分析应用在线SPE‑HPLC‑MS/MS分析；使用Thermo Scientific液相色谱泵，Thermo Scientific Surveyor液相色谱仪与Thermo Scientific TSQ Vantage三重四极质谱联用仪，配备ESI(电喷雾电离)接口，三个系统和6端口Reodyne开关阀都由Xcalibur软件控制；自动进样盘设定在10℃；液相色谱泵置于装样位置，Surveyor自动进样器注入450μL尿液样品。Chromolith Flash RP‑18e SPE柱，用0.1％乙酸水溶液：0.1％乙酸乙腈，1.8mL/min冲洗(参见表1)。后分析物从SPE柱转移到HPLC柱(3μm,150mm×2.1mmThermo Scientific Betasil phenyl苯基色谱柱)。电喷雾电离(ESI)采用负离子模式。～1.5mTorr氩气作为碰撞气，质谱参数见表2。

[0056] 在一些实施方式中，步骤(2)中，所述质量控制中，每组分析50个样，包括30个待测尿样，4个试剂空白，10个标样，6个加标尿液(3个低浓度质控样本；3个高浓度质控样本)，随机选择2个低浓度质控样本和2个高浓度质控样本的平均值对每一组测定结果进行评定。如质控样的值均在2倍标准差范围内，则检测结果可接受。质控样的值超过相应限值时，可认为脱离控制并且这一组尿液需重新进行处理分析。

[0057] 表1在线固相萃取和高效液相色谱溶剂梯度程序

[0058]

[0059]

[0060] 表2方法的色谱质谱参数

[0061]

[0062]

[0063] 本发明步骤(3)中所述的摄入的DEHP指的是经日常饮食摄入的DEHP，由于食物如禽肉、乳制品、蔬果、塑料包装食品等在生产、加工、运输过程中接触塑料制品等，食品中或多或少的残留有DEHP，人在日常饮食生活中，不可避免的摄入DEHP。本发明中人体摄入DEHP均为自然状态下经日常饮食摄入，未进行任何人为干预措施。

[0064] 在一些实施方式中，步骤(3)包括，通过分析摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程，确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程。

[0065] 在一些实施方式中，步骤(3)包括，

[0066] S1：分析摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程；

[0067] S2：确定成年人暴露于DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构，建立数学模型，编写微分方程；

[0068] S3：查找已公开数据，获得人体生理学参数、DEHP生化参数以及DEHP毒代动力学参数；

[0069] S4：根据S3中已公开数据，进行DEHP的生理毒物代谢动力学模型进行参数优化与模型验证。

[0070] 在一些实施方式中，步骤S1中，所述分析经日常饮食摄入的DEHP在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程包括：摄入的DEHP在小肠发生代谢为MEHP，未代谢部分在小肠吸收；DEHP和MEHP在肝脏、肾脏、脂肪组织有蓄积性，MEHP在血液中80％以与脂蛋白结合形式存在；DEHP经日常饮食摄入后，在人体肠黏膜细胞中肠酯酶及小肠的细胞外酶作用下水解产生MEHP，MEHP在人体小肠可依次代谢为MEHHP和MEOHP，在人体肝脏可代谢为多种代谢物，如MEHHP、MEOHP、MECPP；尿液为主要排泄途径，尿液中含有12～21种DEHP的代谢产物，至少包括MECPP、MEHHP、MEOHP、MEHP。本发明的步骤S1中，经日常饮食摄入DEHP后，在人体肠黏膜细胞中肠酯酶及小肠的细胞外酶作用下水解产生邻苯二甲酸单乙基几酯(MEHP)，MEHP在人体小肠可依次代谢为MEHHP和MEOHP，在人体肝脏可代谢为MEHHP、MEOHP，MECPP和MCMHP，上述过程的主要催化酶CYP450、乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)在肝脏的活性高于肠道；人体经日常饮食摄入、吸收DEHP后，血液中有多种代谢产物，其中MEHP、MEHHP、MEOHP、MECPP等为主要代谢产物，其浓度可在进入人体后约2小时达到峰值。

[0071] 在一些实施方式中，步骤S2中，所述DEHP的生理毒物代谢动力学模型结构包括：小肠、肝脏、性腺、脂肪、血液循环系统及其他组织器官；经日常饮食摄入的DEHP在肠、肝脏部分代谢生成MEHP；其中部分MEHP在肠进一步代谢生成MEHHP、MEOHP，在另一部分肝脏进一步代谢生成MEHHP、MEOHP、MECPP；经日常饮食摄入的DEHP在人体内代谢完全，无原型经尿液排出，而代谢产物均经尿液排出体外。

[0072] 在一些实施方式中，步骤S2中，所述MEHP在肝脏的分布应用弥散限制模型描述，即肝脏腔室进一步分成肝组织腔室和肝血流腔室，肝血流腔室体积与器官血流体积一致，肝组织腔室体积为器官体积与肝血流腔室体积的差值。

[0073] 本发明中为描述MEHP在肝脏细胞和细胞外腔室间的弥散限制过程，引入新的参数PA(permeation coefficient‑surface area‑cross product)，肝组织和肝血流中MEHP量变化率分别表示为：

[0074]

[0075]

[0076] 其中，PA为弥散系数；QL为肝脏的血流量；CLe、CLi、Cb分别为肝血流、肝细胞和血液循环中MEHP的含量水平；PLMEHP为肝脏MEHP的分配系数；Rmets表示MEHP代谢成其他物质的量变化率；dALi/dt和dALe/dt分别表示肝组织和肝血流MEHP量变化率。

[0077] 在一些实施方式中，查找已公开数据，获得人体生理学参数、DEHP生化参数以及DEHP毒代动力学参数；其中人体生理学参数如各器官血流量根据国家标准GBZT 200.3‑2014、GBZT 200.2‑2007推荐值(表3)；DEHP生化参数如分配系数来源于公开发表的文献(参考文献1：Keys DA,Wallace DG,Kepler TB,Conolly RB.Quantitative evaluation of alternative mechanisms of blood and testes disposition of di(2‑ethylhexyl)phthalate and mono(2‑ethylhexyl)phthalate in rats.Toxicol Sci.1999Jun；49(2):
172‑85.doi:10.1093/toxsci/49.2.172；35)(参考文献2：Sharma RP,Schuhmacher M,Kumar V.Development of a human physiologically based pharmacokinetic(PBPK)model for  phthalate(DEHP)and  its metabolites:A bottom up modeling approach.Toxicol  Lett.2018Oct  15；296:152‑162.doi:10.1016/
j.toxlet.2018.06.1217)(表4)。DEHP毒代动力学参数来源于公开发表的文献(参考文献：
Choi K,Joo H,Campbell JL Jr,Andersen ME,Clewell HJ 3rd.In vitro intestinal and hepatic metabolism of Di(2‑ethylhexyl)phthalate(DEHP)in human and rat.Toxicol In Vitro.2013Aug；27(5):1451‑7.doi:10.1016/j.tiv.2013.03.012)。

[0078] 表3.人体生理学参数

[0079]

[0080] 表4.分配系数

[0081]

[0082]

[0083] 在一些实施方式中，步骤S4中，根据S3中已公开数据进行模型参数优化与验证，使得模型可充分模拟人体摄入DEHP后代谢动力学过程。

[0084] 已发表文献1“Koch HM,Bolt HM,Angerer J.Di(2‑ethylhexyl)phthalate(DEHP)metabolites in human urine and serum after a single oral dose of deuterium‑labelled DEHP.Arch Toxicol.2004Mar；78(3):123‑30.doi:10.1007/s00204‑003‑0522‑3.”和文献2“Koch HM,Bolt HM,Preuss R,Angerer J.New metabolites of di(2‑ethylhexyl)phthalate(DEHP)in human urine and serum after single oral doses of deuterium‑labelled DEHP.Arch Toxicol.2005Jul；79(7):367‑76.doi:10.1007/s00204‑
004‑0642‑4.”公开了一项人体口服试验数据：一名成年德国男性分别口服48.5mg、2.15mg、
0.35mg D4‑DEHP的试验数据(表5)，根据该数据进行模型参数优化与验证，使模型可充分模拟人体摄入DEHP后代谢动力学过程。根据该数据参数优化后，确定参数PA设置为0.26。模型预测血浆MEHP含量水平‑时间变化曲线与实测值水平基本一致，预测得峰值浓度为5.01mg/L，为实测峰值浓度4.95mg/L的1.01倍，并且含量水平随时间变化趋势与实测值吻合。模型预测血清MEHHP、MEOHP、MECPP含量水平‑时间变化趋势均与实测值有高度一致性，预测得MEHHP、MEOHP、MECPP峰值浓度分别为0.22mg/L、0.07mg/L和0.60mg/L，其实测峰值浓度分别为0.20mg/L、0.06mg/L以及0.57mg/L，即预测峰值浓度为实测水平的1.05‑1.17倍，模型预测准确(图3)。

[0085] 表5 Koch等公开成年男性口服48.5mg的D4‑DEHP后不同时点血各代谢物浓度数据(mg/L)

[0086]

[0087] 在一些实施方式中，步骤(4)中：尿液实测DEHP代谢物水平推算EDI值，首先需获得尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，为获得关联，设置EDI为梯度。模型输入初始值为三分之一EDI水平，输入量重复次数为3次，即模拟早、中、晚3餐；3次重复输入之间间隔6*60*60次运算，模拟早与中、中与晚餐之间间隔6小时，共运算n*60*60次(n为小时数)，得到该个体的模型运行稳定状态下尿液各DEHP代谢物与EDI水平之间准确关联，并根据该关联，获得尿液实测DEHP代谢物含量水平计算得EDI水平。

[0088] 在一些实施方式中，步骤(4)中：所述为获得关联，设置EDI的梯度为1、10、50、100。

[0089] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0090] 实施例1

[0091] 1‑获得1例男性尿液DEHP代谢物含量水平：

[0092] “Koch HM,Bolt HM,Preuss R,Angerer J.New metabolites of di(2‑ethylhexyl)phthalate(DEHP)in human urine and serum after single oral doses of deuterium‑labelled DEHP.Arch Toxicol.2005Jul；79(7):367‑76.doi:10.1007/s00204‑004‑0642‑4.”公开了成年男性口服48.5mg D4‑DEHP的试验数据，口服摄入后4小时，尿液MEHHP含量水平达到峰值浓度为10.0mg/L。

[0093] 2‑根据文献公开男性信息设置模型：

[0094] DEHP的PBTK模型输入值：

[0095] 性别：男性

[0096] 年龄：61岁

[0097] 体重：75kg

[0098] 模型输入量：分别输入值1、10、50、100

[0099] 输入量重复次数：1

[0100] 输入间隔：无重复输入

[0101] 总运算次数：44*60*60次(等效于44小时)

[0102] 输出：相当于口服后4小时的尿液MEHHP含量水平

[0103] 模型模拟尿液含量水平随时间变化趋势图见图4。获得4小时尿液MEHHP含量水平与EDI水平之间关联性，由此，4小时尿液MEHHP浓度为10.0mg/L推算得到摄入量为45.3mg，与实际摄入量值48.5mg相差6.6％，准确性良好。

[0104] 实施例2

[0105] 1.获得成年人群尿液DEHP代谢物含量水平分布：

[0106] “Zhang X,Tang S,Qiu T,Hu X,Lu Y,Du P,Xie L,Yang Y,Zhao F,Zhu Y,Giesy JP.Investigation of phthalate metabolites in urine and daily phthalate intakes among three age groups in Beijing,China.Environ Pollut.2020May；260:114005.doi:10.1016/j.envpol.2020.114005.”附录中公开了30名年轻成年人(年龄27‑45岁，男：女为1:1)以及20名年老成年人(年龄50‑71岁，男：女为1:1)随机点尿样中DEHP代谢物含量水平分布，MEHHP含量分布的中位数分别为11.8、23.5ng/mL；并根据背景技术部分第二种方法、第三种方法分别估计EDI水平分布。该2种方法估计的年轻成年人EDI中位数分别为2.8，1.1μg/kg bw per day；年老成年人EDI中位数分别为3.6，2.0μg/kg bw per day.[0107] 2.由于文献未公开每个研究个体尿液DEHP代谢物含量水平，根据文献公开人群信息分别设置模型：

[0108] DEHP的PBTK模型输入值：

[0109] 性别：男性(女性)

[0110] 年龄：27‑45岁/50‑71岁

[0111] 体重(均值)：62.5kg/67.1kg

[0112] 模型输入量：分别输入值1、10、50、100

[0113] 输入量重复次数：3次/日(模型每日内EDI分3餐摄入)

[0114] 输入间隔：6*60*60次(即模拟早餐与午餐、午餐与晚餐之间间隔6小时)[0115] 总运算次数：120*60*60次(等效于5日)

[0116] 输出：相当于人群长期经日常饮食摄入DEHP后，尿液MEHHP含量水平[0117] 模型获得该人群尿液MEHHP含量水平与EDI水平之间关联性，由此，年轻成年人尿液MEHHP浓度分布中位数浓度11.8ng/mL推算得到EDI水平为3.4μg/kg bw per day；年轻成年人尿液MEHHP浓度分布中位数浓度23.5ng/mL推算得到EDI水平为6.3μg/kg bw per day。显示背景技术部分第二种方法、第三种方法低估了人群EDI水平，从而低估了人群DEHP暴露健康风险。本发明可提供更为准确的EDI估计，从而进行风险评估，保障人群健康。

[0118] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。