EHDV-2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒

摘要

本发明涉及EHDV‑2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒。本发明方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。本发明中的抗体检测试剂盒可用于流行性出血病病毒血清抗体的检测和流行病学调查，操作程序简单，检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(OIE)推荐的EHD ELISA抗体检测方法。

权利要求

1.一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，其特征在于：该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

2.使用权利要求1所述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：培养杂交瘤细胞株EHD E2C5，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体为杂交瘤细胞株EHD E2C5分泌。

3.一种抗体试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如权利要求1所述的细胞株分泌的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的抗体试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

5.根据权利要求4所述的抗体试剂盒，其特征在于，所述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：流行性出血病病毒2型抗原预包被板 2块；EHDV‑2型单克隆抗体 0.3mL；强阳性对照 0.6 mL；弱阳性对照 0.6 mL；阴性对照 0.6 mL；HRP标记羊抗鼠二抗 0.3mL；20倍浓缩洗涤液 50mL；稀释液 60 mL；底物液 25 mL；终止液 25 mL；封板纸 6张；说明书 1份。

说明书

EHDV‑2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及流行性出血病病毒2型单克隆抗体、制备源细胞株及其试剂盒。

背景技术

[0002] 流行性出血病病毒2型简写EHDV‑2型。EHD‑2型属于EHD九种血清型中的一种。EHD不同的血清型毒株对牛的致病性差异较大。现有的研究认为仅EHDV‑2型的其中1个毒株‑茨城病病毒(Ibaraki virus，IBAV)对牛有较强致病性，其引起牛的突发高热、咽喉麻痹、关节疼痛性肿胀等症状。我国每年从国外进口10万‑20万头种牛，加强EHDV‑2型病毒抗体的监测，是保障我国种牛健康养殖的措施之一。

[0003] EHD抗体检测方法，现有中和试验(VN)、琼扩试验和ELISA检测方法，其中中和试验实验环境要求高，需要生物安全一定级别实验室进行，试验周期长3‑5天；琼扩试验需要有经验的实验员观察判定，不能数字显示检测结果；ELISA方法，通过酶联免疫分析仪读取，结果以数字化形式判定，客观、准确，具有较强的使用优势。本专利研制的EHD‑2型B‑ELISA抗体检测方法，主要针对EHD感染牛致病性的毒株产生的抗体检测而设计，具有显著的针对性，对于EHD感染牛的防控意义较大，同时研制的试剂盒其检测灵敏性、特异性等指标均与OIE推荐的类似方法相近。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题在于，利用制备的EHD‑2型单克隆抗体、EHD‑2型病毒包被的ELISA板，组装试剂盒，试剂盒检测指标达到国际认可的检测值。

[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案是，一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

[0006] 使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。

[0007] 上述的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)用纯化的EHDV‑2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；

[0009] (2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV‑2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV‑2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5。

[0010] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫A型或Asia I型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。

[0011] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对EHDV‑2病毒的抗原决定簇

[0012] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与EHDV‑2病毒及EHD抗原有特异性免疫反应。

[0013] 一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。

[0014] 上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

[0015] 上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％Tween‑20的0.01mol/LpH7.4 PBST；稀释液为含1％～10％BSA、0.05％～0.5％Tween‑20pH7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1‑2mol/L H2SO4溶液。

[0016] 上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：流行性出血病病毒2型抗原预包被板2块；EHD‑2型单克隆抗体0.3mL；强阳性对照0.6mL；弱阳性对照0.6mL；阴性对照0.6mL；HRP标记羊抗鼠二抗0.3mL；20倍浓缩洗涤液50mL；稀释液60mL；底物液25mL；终止液
25mL；封板纸6张；说明书1份。

[0017] 所述EHDV‑2型病毒包被板通过以下方法制备：

[0018] EHDV‑2病毒接种于长成单层的BHK21细胞，5％CO2 37℃培养3d‑5d，细胞出现缩圆脱落后，‑20℃冻融细胞3次，收集病毒液。用pH4.0柠檬酸缓冲液透析24h，再用pH7.0 PBS透析24h，收集病毒液。病毒液中加入等体积饱和硫酸铵，沉淀2h，离心弃上清，取沉淀，用PBS溶解，作为包被用抗原。EHDV‑2型病毒抗原按照1:500～1:1000比列，用pH9.0‑10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h，洗板3次，用含1％～10％BSA PBS缓冲液封闭1h，PBST洗板，干燥1h～3h制得。

[0019] 一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括：

[0020] (1)使用EHDV‑2型抗原预包被板；

[0021] (2)使用纯化的灭活EHDV‑2病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株EHD E2C5，取杂交瘤细胞上清，利用ProteinG柱纯化的EHDV‑2型单克隆抗体。

[0022] 在本发明所述的试剂盒的制备方法中，还包括强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液，并将所述液体和EHDV‑2型抗原预包被板、EHDV‑2单克隆抗体分开放置。

[0023] 本发明的试剂盒采用阻断ELISA检测牛、羊和鹿等动物血清EHDV‑2病毒抗体，可用于EHDV‑2及EHD其它血清型病毒血清抗体的快速检测和流行病学调查。

[0024] 本发明有益效果为，试剂盒中EHDV‑2型病毒单克隆抗体通过EHDV‑2型灭活病毒免疫Balbc小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合而制得；通过单克隆抗体与EHD‑2灭活病毒，优化反应条件制备的EHDV‑2型病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，操作程序简单，检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(OIE)推荐的EHD ELISA抗体检测方法。

具体实施方式

[0025] 本发明提供一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

[0026] 使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。

[0027] 上述的方法，包括以下步骤：

[0028] (1)用纯化的EHDV‑2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；

[0029] (2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV‑2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV‑2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5。

[0030] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫A型或Asia I型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。

[0031] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对EHDV‑2病毒的抗原决定簇

[0032] 上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与EHDV‑2病毒及EHD抗原有特异性免疫反应。

[0033] 一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。

[0034] 上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。

[0035] 上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％Tween‑20的0.01mol/L pH7.4 PBST；稀释液为含1％～10％BSA、0.05％～0.5％Tween‑20pH7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1‑2mol/L H2SO4溶液。

[0036] 上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：EHDV‑2抗原预包被板2块；EHD‑2型单克隆抗体0.3mL；强阳性对照0.6mL；弱阳性对照0.6mL；阴性对照0.6mL；HRP标记羊抗鼠二抗0.3mL；20倍浓缩洗涤液50mL；稀释液60mL；底物液25mL；终止液25mL；封板纸6张；说明书1份。

[0037] 一种EHDV‑2病毒单克隆抗体的制备和相应的ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒包括分别放置的EHDV‑2抗原预包被板，EHDV‑2病毒特异性单克隆抗体。

[0038] 此外，在上述试剂盒中，还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。其中所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.1％Tween‑20的0.01mol/L pH 7.4PBST；稀释液为含1％～10％BSA、0.05％～0.1％Tween‑20pH7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1mol/L H2SO4溶液。

[0039] 为了便于使用，上述试剂盒的各组成部分的体积或数量如下：

[0040]

[0041] 以下提供制备上述试剂盒的具体实例：

[0042] 1.制备EHDV‑2抗原预包被板：EHDV‑2病毒接种于长成单层的BHK21细胞，5％CO2 37℃培养3天，细胞出现缩圆，脱落后，‑20℃冻融细胞3次，收集病毒液。用pH4.0柠檬酸缓冲液透析24h，再用pH7.0 PBS透析24h，收集病毒液。病毒液中加入等体积饱和硫酸铵，沉淀
2h，离心弃上清，取沉淀，用PBS溶解，作为包被用抗原。EHDV‑2型病毒抗原按照1:500～1:
1000比列，用pH9.0‑10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h，洗板3次，用含1％～10％BSA PBS缓冲液封闭1h，PBST洗板，干燥1h～3h制得。

[0043] 2、制备抗EHDV‑2型病毒单克隆抗体：用纯化的EHDV‑2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV‑2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV‑2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5；用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与EHDV‑2病毒蛋白抗原有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如口蹄疫A型、Asia I型，蓝舌病、赤羽病、病毒性腹泻等)没有任何免疫反应。

[0044] 3、制备强阳性对照：挑选体格健壮的16个月以上的山羊2～3只，将灭活的EHDV‑2病毒经背部皮下注射，5mL/只；首免后第2周和第4周分别用EHDV‑2病毒进行二免和三免；待山羊血清中抗EHDV‑2病毒抗体，酶联免疫吸附试验效价达1:100以上，无菌采血分离血清，离心或过滤除去沉淀，抽滤除菌，3mL/管分装，贴上标签，‑80℃保存。

[0045] 4、阴性对照的制备：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用OIE(2010)《EHDV病毒中和试验》检测方法确认血清中是否有EHDV‑2病毒抗体，证实无EHDV‑2病毒抗体的山羊，无菌采血分离血清。3mL/管分装，贴上标签，‑80℃保存。

[0046] 5、制备弱阳性对照：利用阴性对照，倍比稀释EHDV‑2病毒强阳性对照，采用OIE推荐的ELISA方法进行效价测定，与国际标准阳性血清进行比较，制备EHDV‑2病毒弱阳性对照。

[0047] 6、包被缓冲液：0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液(NaHCO31.465g、Na2CO30.795g或Na2CO3.10H2O 1.2g、水500mL)。溶解后过滤除菌，置于4℃冰箱，一周内使用。

[0048] 7、单克隆抗体制备：取5D3杂交瘤细胞株，利用20％胎牛血清的IMDM培养基进行培养，收集细胞上清，8000rpm离心，取上清利用ProteinG柱进行纯化，纯化后，稀释成0.48mg/mL进行保存。

[0049] 8、底物液：TIANGEN(中国)，可溶性单组份TMB(货号：PA107‑01)。

[0050] 9、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液、终止液的优选：本发明通过试验，选定如下最佳的洗涤液、稀释液，终止液配方。

[0051] 20倍浓缩洗涤液配方：NaCL160g，KH2PO4 4.8g，Na2HPO429g，KCL4g，Tween‑20 10mL，蒸馏水1000mL，充分溶解，过滤除菌后分装。用时作20倍稀释。

[0052] 稀释液配方：NaCL8g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO41.44g，KCL 0.2g，蒸馏水1000mL，充分溶解，加入3％BSA，过滤除菌后分装。

[0053] 终止液：将10.87Ml初始浓度为95％～98％的硫酸缓慢加入到89.13Ml的去离子水中混匀，即为终止液。

[0054] 10、羊抗鼠二抗：采用商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(USA，KPL公司，货号074‑1806，1.0mg)，作1：50稀释。

[0055] 11、试剂盒的组装：将按上述方法制备好的EHDV‑2抗原预包被板、单克隆抗体、HRP羊抗鼠二抗、稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照定量分装，分别贴上标签与说明。1份详细的试剂盒使用操作说明书。6张贴板纸。装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。

[0056] 12、试剂盒中各种试液的配制与分装

[0057] 试剂盒中试液的配制分装表

[0058]

[0059] 使用上述试剂盒进行检测操作的程序如下：

[0060] 1.试剂工作液的配置

[0061] PBST洗液：利用试剂盒提供的20×洗液(洗液中如出现沉淀，请37℃加热使其溶解)，用去离子水或蒸馏水进行20倍稀释，即为PBST洗液

[0062] EHDV‑2单克隆抗体工作液：用试剂盒提供的稀释液按1:50稀释EHDV单克隆抗体(如：10μL单克隆抗体+490μL试剂盒提供稀释液)，即为EHDV单克隆抗体工作液。

[0063] HRP羊抗鼠二抗工作液：用试剂盒提供的稀释液进行1:100稀释HRP羊抗鼠二抗(如：10μLHRP羊抗鼠二抗+990μL稀释液)，即为HRP羊抗鼠二抗工作液。

[0064] 2.操作步骤：

[0065] 计算测试样品数量，取所需测试ELISA板条，进行试验。

[0066] (1)每孔加入30μL稀释液，然后分别加入：

[0067] a：加20μL稀释液到A1，A2孔；

[0068] b：加20μL待检血清样品到测试孔中，每孔加一份样品；

[0069] c：加20μL强阳性对照到B1，B2，C1，C2孔；

[0070] d：加20μL弱阳性对照到D1，D2，E1，E2孔；

[0071] e：加20μL阴性对照到F1，F2，G1，G2孔；

[0072] 37℃连续震荡反应1h；

[0073] (2)不要洗板。

[0074] A1，A2孔加50μL稀释液，其余每孔加入50μLEHDV‑2型单克隆抗体工作液。

[0075] (3)37℃连续震荡反应45min。

[0076] (4)用PBST洗液，每孔加250μL，洗板3次，甩干。

[0077] (5)每孔加入HRP羊抗鼠二抗工作液100μL，37℃连续震荡反应30min。

[0078] (6)用PBST洗液，每孔加250μL，洗板3次，甩干。

[0079] (7)每孔加入底物液100μL，37℃避光静置10min～15min。

[0080] (8)每孔加终止液100μL

[0081] (9)用ELISA仪，在450nm波长下读数。

[0082] 3.结果判定：

[0083] ①计算公式：

[0084] S/M＝100‑血清样本平均OD值/M孔平均OD值*100

[0085] ②判定标准：

[0086] PI 结果≤50 阳性
>50 阴性

[0087] 注：若每份样品做双孔，在结果判定时如出现1孔S/M值小于等于50，1孔PI值大于50时，需重新检测。

[0088] 注：1.试剂盒置4℃保存。

[0089] 2.可疑样品，需用其它方法进行检测。

[0090] 试剂盒阳性判定值的确定：按照上述试剂盒的检测程序，采用OIE(2010)《EHD病毒中和试验》检测方法确认的30份阴性对照和120份阳性血清，进行B‑ELISA试验后，结果所有阳性血清的S/M≤50％，所有阴性S/M>50。因此，获得bELISA阴性判定值(cut‑off value)为：S/M≤50被检血清EHDV‑2型抗体阳性；反之阴性。

[0091] 试剂盒的临床样品检测与应用以及试剂盒敏感性、特异性的评价：按照上述试剂盒的检测程序，用OIE(2010)《EHD病毒中和试验》检测方法确认的30份阴性对照和30份阳性血清，进行bELISA试验。统计获得试剂盒的特异性为97％(阴性结果数/阴性样品总数＝29/30)，敏感性为90％(阳性结果数/阳性样品总数＝27/30)，本试剂盒的特异性、敏感性为良好。

[0092] 上述具体实施例的实验数据表明，本发明的EHDV‑2型病毒抗体阻断酶联免疫吸附试验(B‑ELISA)试剂盒特异性强，敏感性高，适用于鹿流行性出血病病毒的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。

[0093] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护。