一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用

摘要

本发明公开了一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用。噬菌体DLn1保藏编号为：GDMCC No：61638‑B1。本发明提供的烈性噬菌体DLn1能特异性裂解蜡样芽胞杆菌，且噬菌体DLn1裂解量较大。裂解量大的噬菌体能在较短时间增殖，更好的用于抵抗蜡样芽胞杆菌的污染。同时，噬菌体DLn1对高温和酸碱具有耐受性，有较强的环境适应能力，不易在应用过程中失活，在牛奶中对目标菌有良好抑制效果。综上所述，噬菌体DLn1有望成为一种抑菌制剂用于防控食品中蜡样芽胞杆菌的污染。

权利要求

1.烈性噬菌体DLn1，保藏编号为：GDMCC No：61638‑B1。

2.权利要求1所述的噬菌体DLn1在制备抑制蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，噬菌体DLn1在制备抑制食品中蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，噬菌体DLn1在制备抑制牛奶中蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

5.一种抑制蜡样芽胞杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的噬菌体DLn1作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的抑制蜡样芽胞杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，所述的噬菌体制剂是抑制食品中蜡样芽胞杆菌的制剂。

7.根据权利要求6所述的抑制蜡样芽胞杆菌的噬菌体制剂，其特征在于，所述的噬菌体制剂是抑制牛奶中蜡样芽胞杆菌的制剂。

说明书

一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用

技术领域：

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用。背景技术：

[0002] 细菌是导致食源性疾病发生的主要病因，严重危害人们的健康，且抗生素的过度使用进一步加剧了这个情况。我国的主要食源性致病菌包括副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色
葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、致泻大肠埃希菌等。其中，蜡样芽胞杆菌越来越受到人们的关注。
据统计，从2003到2019年在我国由蜡样芽胞杆菌引起的食源性暴发事件有504起，死亡人数
为6人，在食源性致病菌中排名第四。当人体摄入被蜡样芽胞杆菌污染的食物后，可引起呕
吐或腹泻症状，严重时会导致死亡。芽胞的产生是蜡样芽胞杆菌容易污染食品的一个重要
原因。具有耐受性的芽胞能够抵抗环境中不利因素的影响，并且在适宜的条件下重新转变
成营养细胞，进一步生长繁殖。已有研究表明，蜡样芽胞杆菌对β‑内酰胺、红霉素、四环素和
碳青霉烯等抗生素具有耐药性。因此，利用抗生素防控蜡样芽胞杆菌不容乐观，开发新的防
控手段势在必行。

[0003] 噬菌体是一类侵染细菌的病毒，会干扰宿主菌正常的代谢过程，甚至导致宿主菌裂解死亡。因此，噬菌体及其衍生物在病原体生物控制中具有很大的潜力。在二十世纪，由
于抗生素耐药问题日趋严重，噬菌体疗法重新进入人们的视野，被用于临床治疗并取得了
一定的效果。多种噬菌体制剂也已被批准应用在食品生产中，如美国食品药品监督管理局
TM
在2006年批准List Shield 制剂作为食品添加剂，用于防控肉制品、水产品、乳制品中李斯
TM TM
特杆菌的污染。EcoShield 制剂及SalmoFresh 制剂也被批准用于防控大肠杆菌和沙门氏
菌的污染。为了增强治疗效果、扩大噬菌体制剂的裂解范围并预防耐受菌的出现，通常商品
化的噬菌体制剂不是单一的噬菌体，而是由多种噬菌体组合而成。因此对新型噬菌体的分
离和表征尤为重要。

[0004] 虽然很多噬菌体制剂已被用于防控微生物的污染，但是目前用于防控蜡样芽胞杆菌污染的噬菌体仍十分有限，因此亟需分离出能够感染蜡样芽胞杆菌并可应用于食品加工
和生产的噬菌体及其组合制剂。
发明内容：

[0005] 本发明的第一个目的在于提供一株蜡样芽胞杆菌的新型烈性噬菌体DLn1，可将其应用于食品中抑制蜡样芽胞杆菌的生长。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 本发明提供的烈性噬菌体DLn1(Bacillus cereus phage DLn1)是以蜡样芽胞杆菌为宿主分离纯化所得。所述噬菌体DLn1于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏
中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保
藏编号为：GDMCC No：61638‑B1。

[0008] 本发明的噬菌体DLn1属于有尾噬菌体目Salasmaviridae科，通过全基因组测序与比对，表明该噬菌体与已有噬菌体相似性低，属于一株新型噬菌体。

[0009] 本发明的噬菌体DLn1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0010] 本发明的噬菌体DLn1潜伏期短、裂解量大。潜伏期为15min，裂解量为634PFU/cell。

[0011] 本发明的噬菌体DLn1具有良好的热稳定性和pH稳定性，在温度为4‑55℃及pH为4‑10之间可保持稳定效价。

[0012] 本发明的噬菌体DLn1有相对较宽的宿主范围，可以裂解宿主克隆复合体ST‑205的多个蜡样芽胞杆菌菌株。

[0013] 本发明的噬菌体DLn1在牛奶中对蜡样芽胞杆菌具有良好抑菌效果。

[0014] 因此，本发明的第二个目的是提供上述噬菌体DLn1在制备抑制蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

[0015] 本发明的第三个目的是提供一种抑制蜡样芽胞杆菌的噬菌体制剂，其含有噬菌体DLn1作为活性成分。

[0016] 优选，噬菌体DLn1在制备抑制食品中蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

[0017] 进一步优选是噬菌体DLn1在制备抑制牛奶中蜡样芽胞杆菌制剂中的应用。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明提供的烈性噬菌体DLn1能特异性裂解蜡样芽胞杆菌，且噬菌体DLn1裂解量较大。裂解量大的噬菌体能在较短时间增殖，更好的用于抵抗蜡样芽胞杆菌的污染。同时，
噬菌体DLn1对高温和酸碱具有耐受性，有较强的环境适应能力，不易在应用过程中失活，且
在牛奶中对目标菌有良好抑制效果。综上所述，噬菌体DLn1有望成为一种抑菌制剂用于防
控食品中蜡样芽胞杆菌的污染。

[0020] Bacillus cereus phage DLn1于2021年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏
编号为：GDMCC No：61638‑B1。

附图说明

[0021] 图1为噬菌体DLn1裂解宿主的平板示意图。

[0022] 图2为噬菌体DLn1的透射电镜图。

[0023] 图3为噬菌体DLn1的一步生长曲线示意图。

[0024] 图4为噬菌体DLn1的热稳定性示意图。

[0025] 图5为噬菌体DLn1的酸碱稳定性示意图。

[0026] 图6为噬菌体DLn1抑制牛奶中蜡样芽胞杆菌生长效果的示意图。

具体实施方式

[0027] 为了具体阐明本发明所采取的手段及实施效果，以下结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

[0028] 实施例1、噬菌体DLn1的分离、纯化与增殖

[0029] 1、样品的来源及处理

[0030] 用于分离噬菌体的样本来自于广东省广州市污水，采集水样后进行10000×g离心20min使大部分杂质沉于底部，取上清液用0.45μm的滤膜过滤去除大部分环境细菌。加入
50mM硫酸镁至上清液，静置30min后用0.22μm滤膜过滤，使噬菌体吸附至滤膜。随后用洗脱
液(1％牛肉膏、3％Tween 80)浸泡滤膜并超声5min后，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤除去细
菌，滤液保存以备用。

[0031] 2、噬菌体的分离、纯化

[0032] 在3mLTSB培养基(含1mM CaCl2)中添加30μL培养至对数期的蜡样芽胞杆菌2177和100μL滤液，在温度为37℃、转速为200rpm的摇床过夜培养。随后用0.22μm滤膜过滤，将未纯
化的噬菌体滤液于4℃保存。

[0033] 采用双层琼脂平板法分离纯化噬菌体。将培养至对数期的蜡样芽胞杆菌2177与100μL噬菌体滤液加至TSB上层琼脂(含0.4％琼脂、1mM CaCl2)中，混匀后倒入TSB固体平板
(含1.5％琼脂、1mM CaCl2)。待上层琼脂凝固后，于37℃倒置培养4h，当出现噬菌斑后，用接
种针挑取单一噬菌斑并悬浮于1mLTSB培养基中。梯度稀释后取100μL与对数期的宿主菌蜡
样芽胞杆菌2177混匀，再次采用双层平板法获得独立分散的噬菌斑。重复以上操作4‑5次，
直至出现大小形态均匀的噬菌斑(图1)，即获得纯化的噬菌体DLn1。将纯化的噬菌体DLn1于
4℃保存。

[0034] 3、噬菌体DLn1的增殖

[0035] 采用多次富集的方法可增殖噬菌体DLn1。取500μL过夜蜡样芽胞杆菌2177菌株接于含有1mM CaCl2的50mLTSB培养基中，培养1h后，加入1mL噬菌体DLn1，继续培养7h后，
10000×g离心10min，离心之后过滤，重复以上操作3‑5次，以提高噬菌体的效价，获得滴度
10
为3×10 PFU/mL的噬菌体DLn1。

[0036] 实施例2、噬菌体DLn1的形态观察

[0037] 取10μL高滴度的噬菌体DLn1置于镀碳网的铜膜上，自然静置15min后，用干净的滤纸吸取多余的液体。晾干后用2％的磷酸钨染色10min，待自然干燥后，将制备好的染色片在
透射电子显微镜下观察(图2)。噬菌体头长和宽分别为60.1±3.6nm，36.5±3.6nm，噬菌体
尾长和宽分别为36.4±3.7nm和4.7±1.0nm。

[0038] 实施例3、噬菌体DLn1基因组分析

[0039] 提取噬菌体DLn1的基因组DNA进行分析。将上述所获得的噬菌体DLn1用聚乙二醇及氯化钠浓缩，获得更高滴度的噬菌体。随后采用苯酚氯仿法提取噬菌体DNA，通过
Illumina Miseq对DNA进行测序并分析。经分析可知，噬菌体DLn1具有如SEQ ID NO：1的核
苷酸序列。通过NCBI BLASTn确定噬菌体DLn1与已报道噬菌体的相似性。

[0040] 通过测序及分析可知，噬菌体DLn1的基因组大小为25379bp，且为线性DNA。噬菌体DLn1与NCBI比对结果如表1所示，其中核酸一致性是Query Cover与Per.ident的乘积。通过
表1可知，该噬菌体与已知的噬菌体相似性小于95％，表明该噬菌体属于新型噬菌体。结合
电子显微镜观察及最新国际病毒分类学可知，噬菌体DLn1属于有尾噬菌体目
Salasmaviridae科。

[0041] 表1噬菌体DLn1与NCBI已有噬菌体相似性比对

[0042]

[0043] 实施例4、噬菌体DLn1的保藏

[0044] 上述分离的蜡样芽胞杆菌烈性噬菌体DLn1(Bacillus cereus phage DLn1)已送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大
院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61638‑B1，保藏日期为：2021.05.12。

[0045] 实施例5、噬菌体DLn1一步生长曲线的测定

[0046] 预先将TSB(1mM CaCl2)培养基及噬菌体在37℃保温。取1mL生长于对数期的宿主菌蜡样芽胞杆菌2177，13000×g离心1min后重悬于1mLTSB(1mM CaCl2)培养基中。将噬菌体
与菌液以感染复数(MOI)为0.1混合，吸附5min后13000×g离心1min，将上清过滤到新的离
心管中以测定未吸附的噬菌体量。同时，将沉淀重悬于1mLTSB(1mM CaCl2)培养基中，取50μ
L到50mL的TSB培养基(1mM CaCl2)中，于37℃摇床震荡培养，每隔5min取样测定噬菌体效
价，重复三次实验。以取样时间为横坐标，噬菌体效价与感染中心之比为纵坐标，绘制噬菌
体DLn1一步生长曲线。通过一步生长曲线(图3)可知，噬菌体DLn1的潜伏期为15min，裂解量
为634PFU/cell。

[0047] 实施例6、噬菌体DLn1温度稳定性的测定

[0048] 取1mL效价为108PFU/mL的噬菌体DLn1分别置于4℃、30℃、37℃、55℃、65℃、72℃、85℃中孵育1h，随后稀释适当倍数，采用双层琼脂法测定不同温度下噬菌体的效价。通过实
验可知，噬菌体DLn1在温度为4‑55℃稳定，65℃时活性下降，高于65℃后活性丧失(图4)。

[0049] 实施例7、噬菌体DLn1酸碱稳定性的测定

[0050] 用1M HCL和1M NaOH将TSB培养基调至不同pH(2～12)。取100μL噬菌体DLn1置于不8
同pH培养基中，使噬菌体DLn1最终浓度为10PFU/mL。30℃孵育1h后，稀释至适当倍数，采用
双层琼脂法测定不同pH下噬菌体的效价。通过实验可知，噬菌体在pH为4‑11之间稳定，在pH
为3时活性下降，在pH为2和12时活性丧失(图5)。

[0051] 实施例8、噬菌体DLn1宿主谱的测定

[0052] 测定噬菌体DLn1潜在的宿主范围，将86株蜡样芽胞杆菌培养至对数期，随后采用双层琼脂点样法测定噬菌体DLn1对以上菌株的裂解能力。结果如表2所示。

[0053] 表2噬菌体DLn1宿主谱

[0054]

[0055]

[0056]

[0057] 备注：“+”表示清晰透明噬菌斑，“‑”表示无噬菌斑

[0058] 一共测定了86株蜡样芽胞杆菌，其中除感染原始使用目标菌蜡样芽胞杆菌2177外，噬菌体DLn1还能感染其他17株蜡样芽胞杆菌，且这17株与宿主菌2177都属于ST‑205克
隆复合体。

[0059] 实施例9、噬菌体DLn1在牛奶中抑菌能力的测定

[0060] 挑取新鲜的蜡样芽胞杆菌2177单菌落悬浮于500μL磷酸盐缓冲溶液使OD600＝1.2，4
取100μL宿主菌加入9.8mL牛奶中，菌液最终浓度为10 CFU/mL，最后与100μL噬菌体混合，至
MOI分别为100和1000。在25℃静置培养，分别于0h、3h、6h、12h和24h取样，稀释不同数量级
铺板计数，测定在牛奶中噬菌体对蜡样芽胞杆菌2177生长的抑制效果。由图6可知，在培养
3h后，与对照组相比，MOI为100和1000实验组中细菌数量显著降低，分别降低了0.88lg
(CFU/mL)和2.21lg(CFU/mL)，且在高MOI下，噬菌体对细菌抑制效果更明显。在6h，当MOI为
100和1000时，实验组中细菌数量较对照组降低了4个数量级；同样，在12h时降低了3个数量
级。培养至24h，实验组中细菌数量增至7.26lg(CFU/mL)，与对照组无显著差异。从整体看，
噬菌体DLn1在前12h抑菌效果明显，对防控食品中蜡样芽胞杆菌污染有较大的潜力。