一种S-氰醇裂解酶的制备方法及其产品

摘要

本发明提供了一种植物来源的、新型的S‑氰醇裂解酶突变子的制备方法及其应用。具体地，通过通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，上述氰醇裂解酶突变子的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％～500％。

权利要求

1.一种S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：包括，氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；

添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因两端插入双酶切位点；

制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；

导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；

菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。

2.如权利要求1所述S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述突变处理，其中，突变处理的方式为易错PCR。

3.如权利要求1所述S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。

4.如权利要求1所述S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)。

5.如权利要求1所述S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。

6.如权利要求1所述S‑氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD600=1.0后，加入0.2 mM IPTG并且保持温度为30℃，诱导表达4 5 h。

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7.如权利要求1 6所述S‑氰醇裂解酶的制备方法制得的产品，其特征在于：所述产品，~

其催化活性是野生型氰醇裂解酶的200% 500%倍。

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说明书

一种S‑氰醇裂解酶的制备方法及其产品

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种S‑氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即HCN与醛酮的加成，得到具有光学活
性的α‑氰醇产物。

[0003] 天然的S‑氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度低，纯化难度大。1995年，Wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶MeHNL
(Plant Sci，1995，108，1)；White等人采用三步法从木薯叶中提取了MeHNL，采用盐析和透
析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高(Plant Physiol 1998，116，
1219)。来源于木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶(MeHNL)是一种S‑氰醇裂解酶，己有
文献报道将MeHNL用于催化S‑型手性氰醇的化学合成，ee值＞99％，具有重要的应用价值，
例如S‑间苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯类农药的通用中间体。1993年，Wajant等人报道了
编码MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。

[0004] 采用微生物作为宿主菌是快速大量的得到氰醇裂解酶的有效方法。Effenberger等人在1996年报道了MeHNL在大肠杆菌中的重组表达，但是蛋白多为包涵体，可溶性蛋白含
量较低(Angew 1996，35，437)。程树华等2001年将MeHNL基因克隆到质粒PPIC9K中，实现了
在酵母菌中的表达(生物工程学报，2001，17(1)，78)，但是酶活仍然不够高，难以达到实际
应用的要求。

发明内容

[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部
分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

[0006] 鉴于上述和/或现有S‑氰醇裂解酶制备方法中存在的问题，提出了本发明。

[0007] 因此，本发明其中一个目的是，克服现有制备的S‑氰醇裂解酶活性不够高的缺陷，提供一种S‑氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

[0008] 为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种S‑氰醇裂解酶的制备方法，包括，

[0009] 氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解
酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示。

[0010] 添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；

[0011] 制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；

[0012] 导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；

[0013] 菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。

[0014] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述突变处理，其中，突变处理的方式为易错PCR。

[0015] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。

[0016] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)。

[0017] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。

[0018] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD600＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为
30℃，诱导表达4～5h。

[0019] 作为本发明所述S‑氰醇裂解酶的制备方法所制得产品，其中：所述产品，其催化活性是野生型氰醇裂解酶的200％～500％倍。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 本发明提供了一种植物来源的、新型的S‑氰醇裂解酶突变子的制备方法及其应用。具体地，通过通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰
醇裂解酶，上述氰醇裂解酶突变子的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％～500％。

具体实施方式

[0022] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0023] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的
情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0024] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指
同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

[0025] 本发明的实施例中，所用氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶。

[0026] 本发明中所用原料和试剂，若无特殊说明，均为市售。

[0027] 实施例1

[0028] 本发明设计的具体原理为通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶。

[0029] S‑氰醇裂解酶突变子来源为野生型氰醇裂解酶，其具体的合成方法为：将氰醇裂解酶野生基因如Seq ID No.1所示，或者将氰醇裂解酶突变子基因如Seq ID No.2所示，两
端加入酶切位点NdeI和HindIII，DNA酶切纯化后插入到表达载体pET26b(+)中得到重组质
粒，将重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)中构建成重组表达菌株。上述重组菌株在LB培养基
中培养到OD600＝1.0后，0.2mM IPTG并在30℃诱导培养4～5小时，离心收集得到野生型或者
突变子细胞，细胞超声裂解后得到粗酶液。

[0030] 实施例2

[0031] 野生型氰醇裂解酶突变子的制备方法如下：

[0032] 将木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶野生基因序列如Seq ID No.1所示，通过易错PCR的方式导入随机突变和(或者)基于酶蛋白结构/模拟底物对接而的导入的点饱
和突变，然后进行高通量筛选，得到我方发明中氰醇裂解酶野生型突变子如Seq ID No.2所
示。

[0033] 木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶野生基因进行转录翻译后的蛋白序列如Seq ID No.3所示，野生型氰醇裂解酶突变子翻译的蛋白序列如Seq ID No.4所示，野生型
氰醇裂解酶突变子相较野生氰醇裂解酶相比有着50位的谷氨酸突变为甘氨酸，128位的色
氨酸突变为丙氨酸，226位的赖氨酸突变为脯氨酸的区别，Seq ID No.4表示了其中一种蛋
白质序列的可能，但是其他各种蛋白质序列发生突变的可能性也有着相同的性能。

[0034] 野生型氰醇裂解酶突变子基因除Seq ID No.2所示外，第148～150位更改为GGG、第382～384位更改为GCG、第676～678位更改为CCG，还包括其中任一位点发生以上所述变
化的任意情况。

[0035] 实施例3

[0036] 氰醇酶高通量筛选的步骤如下：在25℃下，于96孔板里依次加入如下试剂，130μL的100mM磷酸钾‑柠檬酸缓冲液(pH 5.0)，20μL稀释的裂解酶液，最后加入50μL的苯乙氰醇
底物溶液，使用酶标仪在280nm处读取吸光值变化5分钟，吸光值变化大小代表酶活高低。

[0037] 苯乙氰醇底物溶液：使用100mM磷酸钾‑柠檬酸缓冲液(pH 3.5)，配制浓度为8微升每毫升缓冲液。

[0038] 实施例4

[0039] 酶活性的测定

[0040] 将野生型氰醇裂解酶基因以实施例中相同的操作步骤，插入到表达载体pET26b(+)中得到重组质粒，将质粒转化入E.coli BL21(DE3)中构建成表达菌株。使菌株在LB培养
基中培养到OD600＝1.0后，0.2mM IPTG并在30℃诱导培养4～5小时，离心收集得到野生型细
胞，细胞超声裂解后得到粗酶液。

[0041] 同时计算野生型氰醇裂解酶与野生型氰醇裂解酶突变子的酶的活性

[0042] 在1.0毫升的比色皿里加入下述试剂：0.70毫升100mM磷酸钾‑柠檬酸缓冲液(pH 5.0)与0.10毫升稀释的酶液。

[0043] 放入紫外分光光度计，混合均匀，280nm处调零，加入0.2毫升的苯乙氰醇底物溶液(同实施例3)，混合均匀，读取280nm处吸光值变化5分钟。

[0044] 酶的活性计算公式＝7.267×酶液稀释倍数×ΔA280

[0045] ΔA280：280nm处每分钟的吸光值变化

[0046] 表1野生型氰醇裂解酶突变子(细胞裂解液)的活性

[0047]

[0048]

[0049] 本发明提供了一种植物来源的、新型的S‑氰醇裂解酶突变子的制备方法及其应用。具体地，通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂
解酶，上述S‑氰醇裂解酶突变子的催化活性是野生型氰醇裂解酶的200％～500％倍。

[0050] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术
方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发
明的权利要求范围当中。