激活宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因表达的双链saRNA分子转让专利
申请号 : CN202110621966.7
文献号 : CN113528517B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 黄益玲 , 黄利鸣 , 严静 , 胡火军 , 鲁华 , 尤程程 , 向珺昱 , 夏玉桦 , 黄紫弦 , 王霖 , 汪聪
申请人 : 三峡大学
摘要 :
本发明公开了一种激活宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因表达的双链saRNA（small activating RNA）分子。saRNA由正义链5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑３′和反义链5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑３′组成。本发明的saRNA分子可靶向结合LRIG启动子区，抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭迁移，诱导HeLa细胞发生凋亡，可用于制备宫颈癌治疗的药物。
权利要求 :
1.抑癌基因LRIG1的双链saRNA分子，其特征在于，由如下序列的正义链和反义链组成：正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT] ‑3′。
2.一种用于抑癌基因LRIG1的组合物，包括双链saRNA分子，其特征在于，所述双链saRNA分子由如下序列的正义链和反义链组成：正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT] ‑3′。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为重组质粒。
5.一种非治疗诊断目的增加LRIG1基因表达的方法，其特征在于，设计双链saRNA分子并引入到细胞中，所述的双链saRNA分子由如下序列的正义链和反义链组成：正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT] ‑3′。
6.如权利要求1‑4任一项所述的双链saRNA分子用于制备激活LRIG1基因表达的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述双链saRNA分子激活LRIG1基因表达在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。
说明书 :
激活宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因表达的双链saRNA分子
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，提供一种可激活宫颈癌HeLa细胞中抑癌基因LRIG1表达的双链小激活RNA分子及其在制备宫颈癌治疗药物中的用途。
背景技术
[0002] 宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，Cancer Statistics 2020的最新统计数据显示，全球2020年宫颈癌的新发病例约60万，死亡病例约34万。尽管随着宫颈癌筛查的推
行及HPV疫苗的应用，宫颈癌的发病率和死亡率逐渐呈下降趋势，但全球人口增长和人口老
龄化导致全球宫颈癌绝对发病例数和死亡例数仍然呈上升趋势，严重威胁女性健康及生
命。因此，开发小分子核酸药物用于宫颈癌的治疗具有重要的科学意义和临床应用前景。
行及HPV疫苗的应用，宫颈癌的发病率和死亡率逐渐呈下降趋势，但全球人口增长和人口老
龄化导致全球宫颈癌绝对发病例数和死亡例数仍然呈上升趋势，严重威胁女性健康及生
命。因此，开发小分子核酸药物用于宫颈癌的治疗具有重要的科学意义和临床应用前景。
[0003] LRIG1基因位于第3p14染色体带上,编码一个富含重复亮氨酸序列和免疫球蛋白样领域的跨膜蛋白，也被称为LIG1或LIG‑1，在正常组织中广泛表达，人体所有组织中均检
测到LRIG1 mRNA。大量的临床数据证实LRIG1与肿瘤患者生存期及预后密切相关，Zhang 等
分析研究纳入了2043名临床患者，癌症组织LRIG1阳性表达率明显低于正常组织，高表达
LRIG1与恶性肿瘤的良好预后相关。肿瘤患者临床样本免疫组织化学结果显示，LRIG1 可能
作为预后良好的预测因素。与宫颈癌相关研究报道显示，LRIG1高表达与宫颈鳞癌患者良好
预后相关。截止目前为止，将该基因用于宫颈癌治疗的靶点国内外尚未见报道。
测到LRIG1 mRNA。大量的临床数据证实LRIG1与肿瘤患者生存期及预后密切相关，Zhang 等
分析研究纳入了2043名临床患者，癌症组织LRIG1阳性表达率明显低于正常组织，高表达
LRIG1与恶性肿瘤的良好预后相关。肿瘤患者临床样本免疫组织化学结果显示，LRIG1 可能
作为预后良好的预测因素。与宫颈癌相关研究报道显示，LRIG1高表达与宫颈鳞癌患者良好
预后相关。截止目前为止，将该基因用于宫颈癌治疗的靶点国内外尚未见报道。
[0004] 小激活RNA(small activating RNA,saRNA)是新近发现的，能够靶向作用于基因启动子区域并在转录水平诱导基因表达的小分子双链RNA。与RNA干扰(RNA interference,
RNAi)相比，RNA激活(RNA activation,RNAa)技术在细胞内作用更稳定，对靶基因的作用更
持久。saRNA具有细胞特异性及序列特异性：dsEcad‑215能上调PC‑3和DU‑145中 Ecad的表
达，但对Hela细胞中Ecad的表达则无影响，dsVEGF‑706能上调HeLa细胞中靶基因的表达，而
HEK293却对dsVEGF‑706的上调作用无应答。MiNA公司于2016年开始了全球第一款saRNA药
物MTL‑CEBPA的临床研究，用于晚期肝癌的治疗。saRNA药物从转录及转录后水平进行基因
激活，相比传统蛋白水平发挥作用的药物具有高特异性、高效性、长效性等明显优势，在肿
瘤治疗领域具有极大的潜力。
RNAi)相比，RNA激活(RNA activation,RNAa)技术在细胞内作用更稳定，对靶基因的作用更
持久。saRNA具有细胞特异性及序列特异性：dsEcad‑215能上调PC‑3和DU‑145中 Ecad的表
达，但对Hela细胞中Ecad的表达则无影响，dsVEGF‑706能上调HeLa细胞中靶基因的表达，而
HEK293却对dsVEGF‑706的上调作用无应答。MiNA公司于2016年开始了全球第一款saRNA药
物MTL‑CEBPA的临床研究，用于晚期肝癌的治疗。saRNA药物从转录及转录后水平进行基因
激活，相比传统蛋白水平发挥作用的药物具有高特异性、高效性、长效性等明显优势，在肿
瘤治疗领域具有极大的潜力。
发明内容
[0005] saRNA的激活作用具有细胞特异性和序列特异性。为了得到能有效治疗宫颈癌的 saRNA药物，发明人以LRIG1基因为靶点，设计三对saRNA分子，发现dsLRIG1‑393对宫颈癌
HeLa细胞中LRIG1的激活作用最强。dsLRIG1‑393的组成如下：
HeLa细胞中LRIG1的激活作用最强。dsLRIG1‑393的组成如下：
[0006] 正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′
[0007] 反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGAA[dT][dT]‑3′
[0008] 抑癌基因LRIG1的双链saRNA分子(dsLRIG1‑393)，由如下序列的正义链和反义链组成：
[0009] 正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′
[0010] 反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′。
[0011] 一种用于抑癌基因LRIG1的组合物，包括双链saRNA分子，所述双链saRNA分子由如下序列的正义链和反义链组成：
[0012] 正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACAU[dT][dT]‑3′
[0013] 反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′。
[0014] 所述组合物还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。
[0015] 所述组合物为重组质粒。
[0016] 一种非治疗诊断目的增加LRIG1基因表达的方法，设计双链saRNA分子并引入到细胞中，所述的双链saRNA分子由如下序列的正义链和反义链组成：
[0017] 正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑3′
[0018] 反义链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′。
[0019] 所述的双链saRNA分子用于激活LRIG1基因表达的药物中的用途。
[0020] 所述双链saRNA分子激活LRIG1基因表达在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。
[0021] 所述药物采用皮下注射剂、静脉注射剂或者液体口服剂。
[0022] dsLRIG1‑393对HeLa细胞中LRIG1的激活作用具有高效性和长效性，将dsLRIG1‑ 393以50nM的浓度转染至HeLa中，72h后分别提取总RNA和总蛋白，检测LRIG1 mRNA和蛋白表
达情况。dsLRIG1‑393转染后平均上调LRIG1 mRNA的表达5.75±1.97 倍，上调LRIG1蛋白表
达3.3±0.02倍。
达情况。dsLRIG1‑393转染后平均上调LRIG1 mRNA的表达5.75±1.97 倍，上调LRIG1蛋白表
达3.3±0.02倍。
[0023] dsLRIG1‑393转染72h后入胞效率达90％，可部分入核，通过与LRIG1启动子区结合激活其表达。
[0024] dsLRIG1‑393对宫颈癌HeLa细胞的增殖和侵袭迁移有明显的抑制作用，并且能促进HeLa细胞凋亡。
[0025] 本发明公开了一种激活宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因表达的双链小激活RNA分子 (dsLRIG1‑319)及其应用。dsLRIG1‑319由正义链5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT]
[dT]‑3′和反义链5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′组成。本发明的双链小激活
RNA分子可靶向结合人宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因的启动子区，在mRNA 水平及蛋白水平
激活LRIG1的表达，并抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭迁移，诱导 HeLa细胞发生凋亡，可
用于制备治疗宫颈癌的药物。
[dT]‑3′和反义链5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′组成。本发明的双链小激活
RNA分子可靶向结合人宫颈癌HeLa细胞中LRIG1基因的启动子区，在mRNA 水平及蛋白水平
激活LRIG1的表达，并抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭迁移，诱导 HeLa细胞发生凋亡，可
用于制备治疗宫颈癌的药物。
附图说明
[0026] 图1为dsLRIG1‑393转染后激活HeLa细胞中LRIG1基因mRNA及蛋白表达，A：半定量PCR检测LRIG1 mRNA表达情况；B：LRIG1 mRNA灰度统计分析；C：LRIG1蛋白表达情况；D：
LRIG1蛋白灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<0.01。
LRIG1蛋白灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<0.01。
[0027] 图2为dsLRIG1‑393转染HeLa细胞后对LRIG1蛋白表达的激活作用有时间长效性，A：dsLRIG1‑393转染HeLa细胞24h、48h、72h、7d后LRIG1蛋白表达情况； B：dsLRIG1‑393组时
间梯度LRIG1蛋白表达情况；C：LRIG1蛋白表达时间梯度灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<
0.01。
间梯度LRIG1蛋白表达情况；C：LRIG1蛋白表达时间梯度灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<
0.01。
[0028] 图3为dsLRIG1‑393转染HeLa细胞后靶向结合LRIG1启动子区，NCBI数据库检索 LRIG1基因启动子区。
[0029] 图4为LRIG1基因启动子区与dsLRIG1‑393完全互补配对。
[0030] 图5为LRIG1基因启动子区质粒pGL4 promotor测序验证。
[0031] 图6为双荧光素酶报告基因系统验证dsLRIG1‑393与LRIG1基因启动子区的靶向结合，*：P<0.05，**：P<0.01。
[0032] 图7为dsLRIG1‑393转染HeLa细胞后对HeLa细胞增殖的抑制作用，A：MTT实验检测dsLRIG1‑393对HeLa细胞的增殖抑制率；B：p‑ERK1和ERK1/2蛋白表达情况；C：蛋白表达灰度
统计分析，*：P<0.05，**：P<0.01。
统计分析，*：P<0.05，**：P<0.01。
[0033] 图8为dsLRIG1‑393转染HeLa细胞后对HeLa细胞迁移的抑制作用，A：细胞划痕伤口愈合能力(100×)；B：划痕愈合能力统计分析，*：P<0.05，**：P<0.01。
[0034] 图9为dsLRIG1‑393转染HeLa细胞后对HeLa细胞凋亡的诱导作用，A：流式细胞仪细胞凋亡检测；B：凋亡细胞统计分析；C：凋亡信号通路相关蛋白表达情况；D：蛋白表达灰度统
计分析，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
计分析，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
具体实施方式
[0035] 实施例1
[0036] dsRNA设计dsLRIG1‑393为针对LRIG1基因启动子区相对转录起始点‑393附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子。对照组dsRNA
(dsControl) 与已知人基因组序列非同源，长度同样为21个核苷酸碱基对的dsRNA序列。利
用 Genebank数据库，找到LRIG1基因启动子区序列，针对启动子上游‑393的序列作为设计
dsRNA的模板，具体序列为：正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑ 3′；反义
链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′。
(dsControl) 与已知人基因组序列非同源，长度同样为21个核苷酸碱基对的dsRNA序列。利
用 Genebank数据库，找到LRIG1基因启动子区序列，针对启动子上游‑393的序列作为设计
dsRNA的模板，具体序列为：正义链：5’‑UUC UUC CUG ACU GGG ACA U[dT][dT]‑ 3′；反义
链：5’‑AUG UCC CAG UCA GGA AGA A[dT][dT]‑3′。
[0037] 实施例2
[0038] 细胞培养与转染
[0039] 人宫颈癌HeLa细胞购自武汉大学细胞典藏中心，由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室培养保存。培养条件：5％CO2，37℃湿化孵箱，1640培养基含体积分数
5
10％胎牛血清，1×10U/L青霉素、100mg/L链霉素。实验分为3组：对照组(转染dsControl)
和实验组(转染dsLRIG1‑393，dsLRIG1‑365，dsLRIG1‑712(具体序列见表1)，每个实验组的
dsRNA浓度为50nmol/L。通过半定量PCR法及Western Blot检测dsLRIG1‑393转染 HeLa细胞
后靶基因LRIG1 mRNA及蛋白的表达水平。细胞接种于6孔板，密度达60～70％时进行基因转
染：PBS冲洗各孔板细胞两遍，确定细胞生长状态良好，加入1.8mL DMEM 完全培养基备用。
取1.5mL EP管置于管架上，管内分别加入DMEM基础培养基200μ L，并在各EP管内分别加入5
μL缓慢融解的dsRNA，轻柔混匀，静置5min后再分别向各管内加入5μL的Tubofect转染试剂，
轻柔混匀，后在冰上静置15min，做好标记备用，荧光标签短链核酸注意避光。向6孔板各孔
内分别加入已经静置完备的脂质体短链核酸复合体，前后左右各方向摇匀，确保复合体分
布均匀，置于细胞培养箱继续培养，观察细胞状态，收取各孔细胞进行后续实验。
5
10％胎牛血清，1×10U/L青霉素、100mg/L链霉素。实验分为3组：对照组(转染dsControl)
和实验组(转染dsLRIG1‑393，dsLRIG1‑365，dsLRIG1‑712(具体序列见表1)，每个实验组的
dsRNA浓度为50nmol/L。通过半定量PCR法及Western Blot检测dsLRIG1‑393转染 HeLa细胞
后靶基因LRIG1 mRNA及蛋白的表达水平。细胞接种于6孔板，密度达60～70％时进行基因转
染：PBS冲洗各孔板细胞两遍，确定细胞生长状态良好，加入1.8mL DMEM 完全培养基备用。
取1.5mL EP管置于管架上，管内分别加入DMEM基础培养基200μ L，并在各EP管内分别加入5
μL缓慢融解的dsRNA，轻柔混匀，静置5min后再分别向各管内加入5μL的Tubofect转染试剂，
轻柔混匀，后在冰上静置15min，做好标记备用，荧光标签短链核酸注意避光。向6孔板各孔
内分别加入已经静置完备的脂质体短链核酸复合体，前后左右各方向摇匀，确保复合体分
布均匀，置于细胞培养箱继续培养，观察细胞状态，收取各孔细胞进行后续实验。
[0040] 表1 saLRIG1位置及序列
[0041]
[0042] 实施例3
[0043] 荧光素酶报告基因质粒的构建及靶向结合验证选取LRIG1基因转录起始点上游2000bp 区域构建至荧光素酶报告基因载体pGL4 basic中，并测序验证，使用pRL‑TK海参荧
光素酶质粒作为内参，利用双荧光素酶报告系统验证dsLRIG1‑393与启动子区靶向关系。根
据试剂说明书，配制荧光素酶检测试剂：将荧光素酶检测缓冲液10mL，加入到冻干荧光素酶
检测底物的瓶中，振荡使其充分混匀，1.5mL EP管分装，避光、‑80℃保存。收集各组细胞于
1.5mL EP管中，每管加入80μL 1×裂解液，充分重悬细胞沉淀，置冰上15分钟，每5分钟轻弹
EP管一次，保证充分裂解，完毕后4℃、12000rpm离心10min，取上清于新EP管中。取各组基因
转染后的蛋白样品，与荧光素酶检测试剂混匀，酶标仪检测荧光素酶活性数值并记录。结果
显示，LRIG1启动子区报告基因质粒构建成功，与对照组相比，dsLRIG1‑ 393转染后可使荧
光活力增加14.18±4.00倍，见图3‑6。LRIG1基因转录起始点上游2000 bp区域(如图3所示)
构建至荧光素酶报告基因载体pGL4 basic中(如图4所示)，并测序验证(如图5所示)，使用
pRL‑TK海参荧光素酶质粒作为内参，利用双荧光素酶报告系统验证dsLRIG1‑393与启动子
区靶向关系。结果显示，LRIG1启动子区报告基因质粒构建成功，与对照组相比，dsLRIG1‑
393转染后可使荧光活力增加14.18±4.00倍，见图6。
光素酶质粒作为内参，利用双荧光素酶报告系统验证dsLRIG1‑393与启动子区靶向关系。根
据试剂说明书，配制荧光素酶检测试剂：将荧光素酶检测缓冲液10mL，加入到冻干荧光素酶
检测底物的瓶中，振荡使其充分混匀，1.5mL EP管分装，避光、‑80℃保存。收集各组细胞于
1.5mL EP管中，每管加入80μL 1×裂解液，充分重悬细胞沉淀，置冰上15分钟，每5分钟轻弹
EP管一次，保证充分裂解，完毕后4℃、12000rpm离心10min，取上清于新EP管中。取各组基因
转染后的蛋白样品，与荧光素酶检测试剂混匀，酶标仪检测荧光素酶活性数值并记录。结果
显示，LRIG1启动子区报告基因质粒构建成功，与对照组相比，dsLRIG1‑ 393转染后可使荧
光活力增加14.18±4.00倍，见图3‑6。LRIG1基因转录起始点上游2000 bp区域(如图3所示)
构建至荧光素酶报告基因载体pGL4 basic中(如图4所示)，并测序验证(如图5所示)，使用
pRL‑TK海参荧光素酶质粒作为内参，利用双荧光素酶报告系统验证dsLRIG1‑393与启动子
区靶向关系。结果显示，LRIG1启动子区报告基因质粒构建成功，与对照组相比，dsLRIG1‑
393转染后可使荧光活力增加14.18±4.00倍，见图6。
[0044] 实施例4
[0045] 总RNA的提取及RT‑PCR分析mRNA表达水平转染72h后收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以1μg RNA模版，依次在PCR管中加入1μl Oligo dT，用DEPC水加至12μl，将EP管置于
70℃、5分钟后立即置于冰上1分钟。分别加入5×buffer 4μl,20U/μl核糖核酸酶抑制剂1μ
l,10mM dNTP mix为2μl和逆转录酶1μl,混合均匀，瞬时离心。将混合物置于PCR仪中完成后
续反应：37℃5min，42℃60min、70℃10min。以反转录的 cDNA为模板，扩增目的基因LRIG1和
GAPDH。引物序列：LRIG1上游5’‑ ATCATCACCCAGCCAGAAAC‑3’，下游5’‑
CTACCGTGGTCCCATCCTT‑3’；GAPDH上游5’‑AACGGATTT GGTCGTATTGGG‑3′，下游5′‑
CCTGGAAGATGGTGATGGGAT‑ 3’，反应参数：94℃预变性5min、94℃变性30sec、55℃退火
30sec、72℃延伸45sec、35 个循环，72℃充分延伸10min，反应体系见表2。凝胶电泳检测PCR
产物片段，拍照，并统计灰度值(如图1A、1B所示)。
70℃、5分钟后立即置于冰上1分钟。分别加入5×buffer 4μl,20U/μl核糖核酸酶抑制剂1μ
l,10mM dNTP mix为2μl和逆转录酶1μl,混合均匀，瞬时离心。将混合物置于PCR仪中完成后
续反应：37℃5min，42℃60min、70℃10min。以反转录的 cDNA为模板，扩增目的基因LRIG1和
GAPDH。引物序列：LRIG1上游5’‑ ATCATCACCCAGCCAGAAAC‑3’，下游5’‑
CTACCGTGGTCCCATCCTT‑3’；GAPDH上游5’‑AACGGATTT GGTCGTATTGGG‑3′，下游5′‑
CCTGGAAGATGGTGATGGGAT‑ 3’，反应参数：94℃预变性5min、94℃变性30sec、55℃退火
30sec、72℃延伸45sec、35 个循环，72℃充分延伸10min，反应体系见表2。凝胶电泳检测PCR
产物片段，拍照，并统计灰度值(如图1A、1B所示)。
[0046] 表2半定量PCR反应体系
[0047]
[0048]
[0049] 实施例5
[0050] Western Blot检测相关蛋白表达水平dsRNA转染细胞72h后收集细胞用于蛋白表达的分析，用PBS清洗细胞，加入蛋白裂解液(所述的蛋白裂解液为：RIPA裂解液，成分为：
50mM Tris‑HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，1％NP‑40，0.1％SDS)，冰上裂解后离心收集上清液，
BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的蛋白量均为20ug，
actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS‑PAGE胶电泳，蛋白转膜后，室温封闭 2h后，先后
与抗靶蛋白抗体(一抗)和辣根过氧化物酶标记的二抗作用，电化学发光法示踪靶蛋白。需
检查的靶蛋白有：LRIG1、caspase3、caspase8、caspase9、Bax、Bcl‑2等。实验以β‑actin为内
参照蛋白。实验结果显示，dsLRIG1‑393转染后对HeLa细胞中LRIG1蛋白表达的激活作用最
明显(故后续实验均选用dsLRIG1‑393)。dsLRIG1‑393转染72h后平均上调LRIG1蛋白表达
3.3±0.02倍(如图1C、1D所示)。dsLRIG1‑393转染7d后仍能检测到蛋白含量显著上调，见图
2。
50mM Tris‑HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，1％NP‑40，0.1％SDS)，冰上裂解后离心收集上清液，
BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，使各个样品的蛋白量均为20ug，
actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS‑PAGE胶电泳，蛋白转膜后，室温封闭 2h后，先后
与抗靶蛋白抗体(一抗)和辣根过氧化物酶标记的二抗作用，电化学发光法示踪靶蛋白。需
检查的靶蛋白有：LRIG1、caspase3、caspase8、caspase9、Bax、Bcl‑2等。实验以β‑actin为内
参照蛋白。实验结果显示，dsLRIG1‑393转染后对HeLa细胞中LRIG1蛋白表达的激活作用最
明显(故后续实验均选用dsLRIG1‑393)。dsLRIG1‑393转染72h后平均上调LRIG1蛋白表达
3.3±0.02倍(如图1C、1D所示)。dsLRIG1‑393转染7d后仍能检测到蛋白含量显著上调，见图
2。
[0051] dsLRIG1‑393可增加HeLa细胞凋亡的比例(如图9A、9B所示)。dsLRIG1‑393转染后，凋亡途径执行蛋白casepase3显著激活，并且可同时激活外源性凋亡信号通路蛋白
casepase8和内源性凋亡信号通路蛋白casepase9；内源性凋亡信号通路上游蛋白Bax上调，
Bcl‑2下调(如图9C、9D所示)。
casepase8和内源性凋亡信号通路蛋白casepase9；内源性凋亡信号通路上游蛋白Bax上调，
Bcl‑2下调(如图9C、9D所示)。
[0052] 实施例6
[0053] MTT实验检测细胞增殖能力将saRNA以50nM浓度转染HeLa细胞2d后，胰酶消化收集细胞，制成细胞悬液并计数，以3000个细胞/孔铺96孔板后继续培养。在不同时间段(3 d、
5d、7d)取出培养板，向每孔加20μL MTT(5mg/mL)，轻轻震荡培养板使其混合均匀，在培养箱
内继续培养4h。取出培养板，弃上清液，向每孔加150μL DMSO，避光，室温摇床轻摇15min，酶
标仪在490nm波长处测定其OD值，检测dsLRIG1‑393对 HeLa细胞的增殖抑制率，记录结果并
分析。MTT检测结果显示，与NC组相比，dsLRIG1‑ 393能明显抑制HeLa细胞增殖。72h后提取
总蛋白，利用Western Blot技术检测ERK/ MAPK信号通路ERK1/2和p‑ERK1的蛋白含量变化。
结果发现dsLRIG1‑393能降低p‑ ERK1的蛋白含量，见图7，与NC组相比，dsLRIG1‑393能明显
抑制HeLa细胞增殖(如图 7A所示)。72h后提取总蛋白，利用Western Blot技术检测ERK/
MAPK信号通路ERK1/2 和p‑ERK1的蛋白含量变化(如图7B所示)，结果发现dsLRIG1‑393能降
低p‑ERK1的蛋白含量(如图7C所示)。
5d、7d)取出培养板，向每孔加20μL MTT(5mg/mL)，轻轻震荡培养板使其混合均匀，在培养箱
内继续培养4h。取出培养板，弃上清液，向每孔加150μL DMSO，避光，室温摇床轻摇15min，酶
标仪在490nm波长处测定其OD值，检测dsLRIG1‑393对 HeLa细胞的增殖抑制率，记录结果并
分析。MTT检测结果显示，与NC组相比，dsLRIG1‑ 393能明显抑制HeLa细胞增殖。72h后提取
总蛋白，利用Western Blot技术检测ERK/ MAPK信号通路ERK1/2和p‑ERK1的蛋白含量变化。
结果发现dsLRIG1‑393能降低p‑ ERK1的蛋白含量，见图7，与NC组相比，dsLRIG1‑393能明显
抑制HeLa细胞增殖(如图 7A所示)。72h后提取总蛋白，利用Western Blot技术检测ERK/
MAPK信号通路ERK1/2 和p‑ERK1的蛋白含量变化(如图7B所示)，结果发现dsLRIG1‑393能降
低p‑ERK1的蛋白含量(如图7C所示)。
[0054] 实施例7
[0055] 细胞划痕实验检测细胞迁移能力取对数生长期的HeLa细胞铺于6孔板，每孔约2×5
10个细胞，12小时待细胞贴壁后，以直尺为参照，用10ul枪头轻轻划痕，每孔至少划2条线，
每条线间隔0.5cm。去除旧培养基，用PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞，随后将 dsLRIG1‑
393序列以50nM的浓度转染至HeLa中，使用含2％FBS不完全培养基培养，按0 h、24h、48h、
72h拍照取图，在光学显微镜下连续观察划痕伤口愈合情况。实验结果显示，在HeLa细胞中
转染dsLRIG1‑393 72h可使细胞划痕伤口愈合能力降低46％，显著抑制 HeLa细胞迁移，见
图8，在HeLa细胞中转染dsLRIG1‑393 72h可使细胞划痕伤口愈合能力降低46％，显著抑制
HeLa细胞迁移(如图8A、8B所示)。
10个细胞，12小时待细胞贴壁后，以直尺为参照，用10ul枪头轻轻划痕，每孔至少划2条线，
每条线间隔0.5cm。去除旧培养基，用PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞，随后将 dsLRIG1‑
393序列以50nM的浓度转染至HeLa中，使用含2％FBS不完全培养基培养，按0 h、24h、48h、
72h拍照取图，在光学显微镜下连续观察划痕伤口愈合情况。实验结果显示，在HeLa细胞中
转染dsLRIG1‑393 72h可使细胞划痕伤口愈合能力降低46％，显著抑制 HeLa细胞迁移，见
图8，在HeLa细胞中转染dsLRIG1‑393 72h可使细胞划痕伤口愈合能力降低46％，显著抑制
HeLa细胞迁移(如图8A、8B所示)。
[0056] 实施例8
[0057] 流式细胞仪检测细胞凋亡将dsLRIG1‑393以50nM的浓度转染至HeLa中，72h后用不含 EDTA的胰酶消化各组细胞，800rpm离心3min收集悬浮和贴壁细胞，PBS冲洗细胞两次，用
6
适量Annexin V结合液重悬，使细胞密度为1×10 /L。继续向上述细胞悬液中加入染色液
(Annexin V‑FITC结合液与染色液比例为100：1)，轻柔混匀后15min冰盒内避光孵育，加PI
染色液2μL，5min冰盒内避光孵育，上流式细胞仪检测。结果如图9所示，图 9为dsLRIG1‑393
转染HeLa细胞后对HeLa细胞凋亡的诱导作用，A：流式细胞仪细胞凋亡检测；B：凋亡细胞统
计分析；C：凋亡信号通路相关蛋白表达情况；D：蛋白表达灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<
0.01，***：P<0.001。实验结果显示，dsLRIG1‑393可增加 HeLa细胞凋亡的比例(如图9A、9B
所示)。dsLRIG1‑393转染后，凋亡途径执行蛋白 casepase3显著激活，并且可同时激活外源
性凋亡信号通路蛋白casepase8和内源性凋亡信号通路蛋白casepase9；内源性凋亡信号通
路上游蛋白Bax上调，Bcl‑2下调(如图9C、9D所示)。
6
适量Annexin V结合液重悬，使细胞密度为1×10 /L。继续向上述细胞悬液中加入染色液
(Annexin V‑FITC结合液与染色液比例为100：1)，轻柔混匀后15min冰盒内避光孵育，加PI
染色液2μL，5min冰盒内避光孵育，上流式细胞仪检测。结果如图9所示，图 9为dsLRIG1‑393
转染HeLa细胞后对HeLa细胞凋亡的诱导作用，A：流式细胞仪细胞凋亡检测；B：凋亡细胞统
计分析；C：凋亡信号通路相关蛋白表达情况；D：蛋白表达灰度统计分析，*：P<0.05，**：P<
0.01，***：P<0.001。实验结果显示，dsLRIG1‑393可增加 HeLa细胞凋亡的比例(如图9A、9B
所示)。dsLRIG1‑393转染后，凋亡途径执行蛋白 casepase3显著激活，并且可同时激活外源
性凋亡信号通路蛋白casepase8和内源性凋亡信号通路蛋白casepase9；内源性凋亡信号通
路上游蛋白Bax上调，Bcl‑2下调(如图9C、9D所示)。