一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，步骤如下：构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3×Flag标签；共转染细胞，固定细胞进行isPLA；随后分选、扩增、重组，经过多轮筛选和测序后，构建依次包含谷胱甘肽S‑转移酶GST、烟草花叶病毒TEV蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3×Flag标签的重组蛋白，在大肠杆菌中表达，随后经过纯化和酶切，即得。本方法能够从构建的高容量sdAb文库中筛选到特异性识别不同抗原决定簇的sdAbs，并且成本低、效率高。不涉及动物样本或杂交瘤的制备。

权利要求

1.一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，其特征在于：步骤如下：

首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3×Flag标签；将该文库的表达质粒与带有HA标签的SQSTM1的表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36 h后，固定细胞进行isPLA；随后分选含有阳性红色荧光信号的细胞；这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR对其进行扩增，随后将扩增得到的DNA片段重组到同sdAb表达载体上，形成一个sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选；

三轮筛选后，得到识别SQSTM1的sdAb序列；接下来，构建依次包含谷胱甘肽S‑转移酶GST、烟草花叶病毒 TEV 蛋白酶切位点、识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3×Flag标签的编码序列的表达质粒，表达后经纯化和酶切，得C端带有ETA易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb，即得利用isPLA高通量筛选的单域抗体。

2.根据权利要求1所述的利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，其特征在于：通过流式细胞仪分选含有阳性红色荧光信号的细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法在体外单细胞中筛选特异识别SQSTM1结构域的sdAbs方面中的应用。

4.如权利要求1或2所述的方法得到的单域抗体在制备抑制内源SQSTM1的分子来调控SQSTM1在细胞内的功能的药物中的应用。

5.如权利要求1或2所述的方法得到的单域抗体在制备用于体外检测SQSTM1的单域抗体与SQSTM1在天然构象下单细胞内的相互作用的检测试剂中的应用。

说明书

一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用。

背景技术

[0002] 1993年，Hamers‑Casterman等在骆驼科动物血清中发现存在2种结构的免疫球蛋白：一种是传统的由2条重链和2条轻链组成的抗体；还有一种仅有2条重链(Nature.1993；363:446‑448.)。只克隆该抗体的重链可变区，即可得到单域抗体(single‑domain antibody,sdAb，也被称为纳米体，nanobody)，分子量约为15kD。sdAb结构稳定，具有较高的亲和力和抗原结合能力，相对分子质量小，容易穿透组织屏障，易于生产制备和进行基因工程改造，凭借其独特的优势得到了广泛的研究和关注(Journal of  Biomedical Nanotechnology,2018,14(1):1‑19.)。例如，它可以作为蛋白结晶过程中的分子伴侣(Nature.2011；469(7329):175‑80.PNAS.2015；112(36):E4975‑84.Elife.2014；3:
e03239.J Virol.2017；91(3):e01443‑16.Nature.2012；487(7405):119‑22.)；还能和其它蛋白融合表达，在细胞内操控其功能(FEBS Lett.1997；414(3):537‑40.J Control Release.2019；299:107‑120.；Artif Cells Nanomed Biotechnol.2020；48(1):854‑
866.)，此外，在临床诊断和治疗中的实践也在积极地探索中(Adv Healthc Mater.2018；7(8):e1701156.FEBS J.2021Apr；288(7):2084‑2102.Nat Rev Drug Discov 2018；17(3):
197‑223.)。

[0003] 然而，对于特定抗原找到其亲和力高的抗体分子仍然面临较大挑战，为此，本申请人构建了基于sdAb骨架序列(complementarity‑determining region 3,CDR3)区域的随机文库，利用原位接近连接(insituproximityligationassay,isPLA)技术筛选来特异识别任意蛋白质分子抗原的sdAb。

[0004] sdAb的抗原互补决定区(complementarity‑determining region，CDR)决定其与相应抗原的亲和力(FEBS J.2021；288(7):2084‑2102.JCB 2015；209(5):633‑44.J Mol Biol.2005；352(3):597‑607.)。传统上，利用抗原免疫羊驼，分离羊驼的浆细胞，制备杂交瘤细胞，筛选出能产生特异识别抗原的sdAb的杂合细胞，用于后续sdAb分离、纯化和功能的验证。整个过程耗时长，所用实验材料较多，费用较高，使得得到高亲和力的sdAb的成功率极低。此外，基于已知抗体抗原决定区的氨基酸序列，工程化的sdAb研究也有一些报道，但这些研究是对已有抗体功能的进一步补充；而从头寻找新的特异性更高的sdAb的尝试还面临较大的挑战，缺乏在单细胞水平高亲和力、高特异性的筛选方法，有待开发。

[0005] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

[0006] 本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用。

[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0008] 一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，步骤如下：

[0009] 首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3×Flag标签；将该文库质粒与带有HA标签的SQSTM1表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36h后，固定细胞进行isPLA；随后分选含有阳性红色荧光信号的细胞；这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR对其进行扩增，随后将扩增得到的DNA片段重组到同一个sdAb表达载体上，形成sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选；

[0010] 筛选后，得到不同的识别SQSTM1的sdAb序列；接下来，构建依次包含谷胱甘肽S‑转移酶GST、烟草花叶病毒TEV蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3×Flag标签；在大肠杆菌BL21细胞中进行表达，随后经过GST亲和纯化和TEV蛋白酶酶切，得C端带有ETA易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb，即得利用isPLA高通量筛选的单域抗体。

[0011] 进一步地，通过流式细胞仪分选含有阳性红色荧光信号的细胞。

[0012] 进一步地，所述筛选为三轮筛选。

[0013] 进一步地，筛选后，从260个随机挑选的克隆中得到24个不同的识别SQSTM1的sdAb序列。

[0014] 进一步地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

[0015] 进一步地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

[0016] 如上所述的利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法在在单细胞中筛选到特异识别SQSTM1结构域的sdAbs方面中的应用。

[0017] 如上所述的方法得到的单域抗体在作为抑制内源SQSTM1的分子来调控SQSTM1在细胞内的功能方面中的应用。

[0018] 如上所述的方法得到的单域抗体在作为检测试剂用于体外的实验方面中的应用。

[0019] 进一步地，所述体外的实验为免疫印迹和/或免疫细胞荧光实验。

[0020] 本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

[0021] 1、本发明在单细胞水平，利用isPLA结合二代DNA测序技术开发一种高亲和力、高特异性的sdAb筛选方法。本方法能够从构建的高容量sdAb文库中筛选到特异性识别不同抗原决定簇的sdAbs，并且成本低、效率高。不涉及动物样本或杂交瘤的制备。

[0022] 2、本发明方法从sdAb文库中高通量筛选特定识别蛋白抗原决定簇抗体，该方法得到的单域抗体能够高灵敏度检测sdAb和蛋白抗原在天然构象下单细胞内的相互作用。

[0023] 3、由于sdAb和抗原分子的相互作用在细胞内通过isPLA的方法被检测到，因此是一种可靠的在体内体外筛选和验证sdAb的方法。重组表达的sdAb在体内应用上具有一些独特优势：分子量小，可溶，单体形式，稳定性高和低免疫原性。由于含有ETA跨膜结构域，使其容易进入细胞，同时具有高亲和力、高特异性的优点。此外，ETA融合的sdAb能够进入胞内，最大限度地降低它在体内的免疫原性，因而副作用可能会较低。

[0024] 4、本发明通过测序，直接读取CDR3区域的氨基酸序列；相互作用的可视化及亚细胞分布和定量；容易验证相互作用和重新评价sdAb的功能；在细菌中易于工程化大量表达和纯化sdAb；能够识别天然状态和变性的蛋白分子。

附图说明

[0025] 图1为本发明中利用isPLA筛选抗SQSTM1的sdAbs图；其中，a,流式细胞仪分选的阳性细胞和对照组含有sdAb对照质粒的HEK293T细胞isPLA结果；b,具有代表性的含有阳性isPLA信号(红色点)的HEK293T细胞，一抗为Flag和HA标签分别来源于小鼠和兔子的抗体；而对照组的一抗只加入抗HA标签的抗体；细胞核用DAPI复染(蓝色)；比例尺，10μm；c,isPLA阳性HEK293T细胞中扩增得到的PCR产物；分别用sdAb Con载体,未转染的HEK3293T细胞，isPLA阳性的HEK293T细胞和水作为PCR模板；最右侧为DNA markers；bp,base pairs；d,重组抗SQSTM1 sdAb在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达并通过SDS‑PAGE和考马斯亮蓝染色展示，以BSA作为上样对照；上栏：融合蛋白的构成依次包括GST,TEV酶切位点，抗SQSTM1 sdAb或者CDR3缺失的对照(sdAb Con),Pseudomonas exotoxinA(ETA)的异位结构域，和3×Flag标签；WCL,全细胞裂解液；B,Glutathione Sepharose 4B珠子上的结合蛋白；P,纯化的sdAb；
M,蛋白分子标记；箭头位置,分别对应纯化的抗SQSTM1 sdAb克隆#1(上)和sdAb Con(下)；

[0026] 图2为本发明中Sqstm1‑/‑LLC1细胞的产生图；其中，a,SQSTM1结构域示意图；PB1Phox‑BEM1结构域；ZZ,ZZ‑type锌指结构域；LB，LIM蛋白结合结构域；TB，TRAF6结合结构域；LIR LC3结合区；KIR，KEAP1结合区域；UBA，泛素相关结构域；NLS，核定位信号序列；NES，出核信号序列；b,LLC1细胞中DNA测序确认野生型(wildtype,wt)和通过CRISPR‑Cas9技术‑/‑
敲除Sqstm1等位基因1和2的DNA序列；c,琼脂糖凝胶电泳检测wt和敲除Sqstm1 LLC1细胞的PCR产物，以转染sgRNACon的LLC1细胞作为对照组细胞；右侧栏，DNA标记分子；bp,base ‑/‑
pairs；d,通过免疫印迹证实Sqstm1 LLC1细胞中Sqstm1蛋白的缺失；ACTB作为上样内参；

[0027] 图3为本发明中识别SQSTM1的sdAb功能验证图；其中，a,在Sqstm1‑/‑LLC1细胞中转染SQSTM1突变体48h后，用抗HA和Flag抗体通过isPLA检测抗SQSTM1 sdAb克隆#1的识别能2+
力；b,Ni 亲和层析柱纯化His标签的重组蛋白，随后和纯化的sdAb克隆#1孵育，最后用Flag抗体检测pulldown效果；c,Co‑IP检测SQSTM1和抗SQSTM1 sdAb克隆#1的相互作用；h.c.,‑/‑
IgG重链；l.c.,IgG轻链；3次重复实验都得到相似的结果；d,在Sqstm1 LLC1细胞中通过isPLA验证SQSTM1不同截断体与sdAb克隆#1的相互作用；比例尺，10μm；e,免疫印迹检测经过不同浓度sdAb克隆#1处理24h以及10mM海藻糖处理12h的A549细胞中的LC3B和SQSTM1的‑/‑
蛋白水平；ACTB作为内参；f‑g,在Sqstm1 LLC1细胞中通过免疫印迹(f)和免疫荧光(g)实验验证抗SQSTM1 sdAb克隆#2与SQSTM1的相互作用，以sdAb Con为对照；比例尺，10μm；

[0028] 图4为本发明中sdAb文库的isPLA‑seq的一种筛选流程图；其中，sdAb文库包含一个随机的21个氨基酸的CDR3结构域和一个C‑末端的3×Flag标签；文库质粒和带有HA标签的诱饵蛋白共转染HEK293T细胞；48h后，收集细胞，涡旋混匀后固定，进行isPLA实验；随后带有阳性荧光点的细胞通过流式细胞仪进行分选；分选到的细胞作为PCR模板，扩增细胞内质粒上的CDR3区域DNA片段；扩增到的片段重组到原始的载体上进行测序，可以到的筛选到的片段，也可以将重组质粒作为第二轮筛选的文库，进行第二轮筛选，进一步富集阳性sdAbs并测序确认；缺失CDR3区域的sdAb作为对照组(sdAb Con)。

具体实施方式

[0029] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

[0030] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

[0031] 一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法，步骤如下：

[0032] 首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3×Flag标签；将该文库质粒与带有HA标签的SQSTM1表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36h后，固定细胞进行isPLA；随后分选含有阳性红色荧光信号的细胞；这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR对其进行扩增，随后将扩增得到的DNA片段重组到同一个sdAb表达载体上，形成sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选；

[0033] 筛选后，得到不同的识别SQSTM1的sdAb序列；接下来，构建依次包含谷胱甘肽S‑转移酶GST、烟草花叶病毒TEV蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列、假单胞菌外毒素ETA的易位结构域和3×Flag标签；在大肠杆菌BL21细胞中进行表达，随后经过GST亲和纯化和TEV蛋白酶酶切，得C端带有ETA易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb，即得利用isPLA高通量筛选的单域抗体。

[0034] 较优地，通过流式细胞仪分选含有阳性红色荧光信号的细胞。

[0035] 较优地，所述筛选为三轮筛选。

[0036] 较优地，筛选后，从260个随机挑选的克隆中得到24个不同的识别SQSTM1的sdAb序列。

[0037] 较优地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

[0038] 较优地，所述利用isPLA高通量筛选的单域抗体的DNA序列为SEQ ID NO.3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

[0039] 如上所述的利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法在在单细胞中筛选到特异识别SQSTM1结构域的sdAbs方面中的应用。

[0040] 如上所述的方法得到的单域抗体在作为抑制内源SQSTM1的分子来调控SQSTM1在细胞内的功能方面中的应用。

[0041] 如上所述的方法得到的单域抗体在作为检测试剂用于体外的实验方面中的应用。

[0042] 较优地，所述体外的实验为免疫印迹和/或免疫细胞荧光实验。

[0043] 具体地，相关制备及检测实施例如下：

[0044] 本发明利用isPLA在单细胞水平筛选特定抗原决定簇的sdAb，构建了以自噬受体Seque stosome 1(SQSTM1/p62)为例进行sdAb文库筛选的实验流程(图4)。作为自噬信号衔接蛋白，SQSTM1参与自噬流量的调控过程和非自噬依赖的生物学功能调控(Cell.2016；167(3):606‑609.)。本发明首先构建一个含21个随机氨基酸序列的CDR3区域的sdAb文库，序列的C端融合一个3×Flag标签。将该文库质粒与带有HA标签的SQSTM1表达质粒共转染HEK293T细胞，培养36h后，固定细胞进行isPLA。随后通过流式细胞仪(fluorescence activated cel l sorting,FACS)分选含有阳性红色荧光信号的细胞(图1a,b)。这些细胞中质粒上含有编码sdAb的DNA序列，通过PCR(polymerase chain reaction,PCR)对其进行扩增(图1c)，随后将扩增得到的DNA片段重组到同一个sdAb表达载体上，形成sdAb的亚文库，进行下一轮的筛选。

[0045] 三轮筛选后，通过二代测序得到两个不同的识别SQSTM1的sdAb序列(补充表S1)。其中克隆#1，测得的次数最多，因此选择它进行下一步的功能试验。假单胞菌外毒素A(ETA)能够将其连接的胞外蛋白质导入细胞质中(J Control Release.2015；200:13‑22.Front Immunol.2020；11:1261.)。接下来，构建了依次包含GST(glutathione S‑transferase,谷胱甘肽S‑转移酶)，TEV(tobacco etch virus，烟草花叶病毒)蛋白酶切位点，识别SQSTM1的sdAb序列，假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A,ETA)的易位结构域，和3×Flag标签(图1d,上)。在大肠杆菌BL21细胞中进行表达，随后经过GST亲和纯化和TEV蛋白酶酶切，C端带有ET A易位结构域和Flag标签的识别SQSTM1的sdAb以及作为缺失CDR3区域的单链抗体对照(sdAb,Con)以考马斯亮蓝染色展示，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作为上样对照(图1d,下)。

[0046] 对于识别SQSTM1抗体功能的分析，想找到其中能够识别SQSTM1特定结构域的sdAb‑/‑(图2a)。为了避免细胞内源性SQSTM1的影响，通过CRISPR‑Cas9技术构建了Sqstm1 Lewis lung carcinoma 1(LLC1)细胞系，并在DNA和蛋白质水平进行了验证(图2b,c,d)。下述的实验都在这一细胞系中进行的。第一，通过isPLA实验检测了SQSTM1的sdAb#1和SQSTM1不同截断体的相互作用。正如我们所料，sdAb#1抗体分子识别SQSTM1的全长以及C末端(221‑
440aa)的肽段，而不识别SQSTM1的N端序列(1‑220aa)(图3a)。第二，通过GSTpulldown实验验证了sdAb#1与SQSTM1的C末端结合而不是其它结构域(221‑440aa)(图3b)。第三，在‑/‑
Sqstm1 细胞中通过了免疫共沉淀实验和免疫荧光实验证实了sdAb#1抗体分子与SQSTM1的C末端肽段的相关作用(图3c,d)。第四，由于阻断SQSTM1会导致自噬过程受到影响，检测了sdAb#1抗体分子对细胞内自噬流量产生的影响。结果表明，在人的肺腺癌A549细胞中外加sdAb#1抗体分子共孵育24h，在自噬激活剂海藻糖(Trehalose,Tre)处理12h条件下，相比于sdAb Con引起了更多LC3B‑II的聚集(图3e)。sdAb#1抗体分子的孵育引起SQSTM1的水平升高，表明了细胞内自噬流的抑制(图3e)。这与此前报道的自噬缺陷表型相符(Cancer Cell.2017；32(6):824‑839.Trends Biochem Sci.2012；37(6):230‑6.)。由此可知，纯化的sdAb#1抗体分子选择性地靶向SQSTM1的C端结构域，并通过抑制细胞内的SQSTM1功能抑制自噬流。最后，通过免疫印迹和免疫细胞荧光实验验证了sdAb#2能够识别LLC1细胞中变性的Sqstm1蛋白分子(图3f,g)。总而言之，本发明所提供的筛选平台允许在单细胞中筛选到特异识别SQSTM1结构域的sdAbs，融合ETA的该sdAb能够作为抑制内源SQSTM1的分子来调控SQSTM1在细胞内的功能，同时也能作为检测试剂用于体外的实验，比如免疫印迹和免疫细胞荧光实验等。

[0047] 更为具地，相关材料方法可以如下：

[0048] 化学试剂、酶和抗体：

[0049] 用到的试剂如下：

[0050] DAPI(D9542,Sigma‑Aldrich),BCA蛋白测定试剂盒(23250,Thermo Scientific),BSA(New England BioLabs),ECL(enhanced chemiluminescence)检测试剂(32106,Thermo Fisher Scientific),EB(溴化乙锭,E1385,Sigma‑Aldrich),GSH(G2451,Sigma‑Aldrich),咪唑(I5513,Sigma‑Aldrich),Tris(T1503,Sigma‑Aldrich),IgG(AC011,mouse,Abclonal),聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences,Inc.),多聚甲醛(158127,Sigma‑Aldrich),多聚赖氨酸(P4707,Sigma‑Aldrich),protein G琼脂糖CL‑4B珠(17‑0618‑01,GE Healthcare),蛋白酶抑制剂混合片剂(4693132001,Roche,Basel,Switzerland),RIPA缓冲液(#9806,Cell Signaling Technology)。用到的抗体包括Flag抗体(F7425,mouse monoclonal,Sigma‑Aldrich),HA抗体(#7695,rabbit monoclonal,Cell Signaling Technology),抗Flag M2亲和珠子(A2220,Sigma‑Aldrich),SQSTM1/p62抗体(鼠源多抗，ab56416,Abcam；兔源多抗，7695,Cell Signaling Technology)。分子克隆中用到的试剂有：限制性内切酶包括EcoRI和BamHI(New England BioLabs),无缝克隆和组装试剂盒(CU201,TransGen Biotech),DNA Markers Tra Plus II(BM121,TransGen Biotech)以及蛋白预染Marker(26616,Thermo Scientific)。

[0051] Sqstm1‑/‑LLC1细胞系构建：

[0052] Sqstm1敲除LLC1细胞系是通过CRISPR/Cas9技术产生的，方法参考已发表的文章(PNAS 2013；8(11):2281‑308.)。用到的sgRNA通过在线sgRNA设计软件设计(https://crispr.mit.edu)。两条靶向Sqstm1的sgRNA序列为：5’‑ATTAATGATATCTCCCGGGT‑3’和5’‑CCGTACCTAGACCGCGGTTA‑3’。两条sgRNA分别被克隆到PC458载体(Addgene,Plasmid#48138)(PNAS 2013；8(11):2281‑308.)。PX458空载体被用作对照(sgRNA Con)。随后，CRISPR载体被转染到LLC1细胞中。48h后，对转染后的细胞进行FACS分选，带有GFP绿色荧光的细胞被单个地分选到96孔板中。继续培养2‑3周后，通过PCR法检测克隆化的细胞基因组DNA敲除情况，靶向小鼠Sqstm1基因的PCR引物序列为：5’‑CTCTTGTGGTCACCCATGTATT‑3’和5’‑GGCTGAAGCAGAAGCTGAA‑3’.

[0053] sdAb文库构建：

[0054] 通过基因合成的方法合成骆驼来源的sdAb(cAbBCII10)(J.Mol.Biol.2005；352:597‑607.)并克隆到pcDNA3.1载体上，其中的CDR3区域序列被替换成EcoRI，BamHI酶切位点以及6个碱基对的linker DNA序列(5’‑GAATTCGGCAGCGGATCC‑3’)，其中基因的3’末端包含一个3xFlag标签，得到sdAb对照质粒(sdAb Con,同时sdAb Con质粒也是文库构建的骨架序列。CDR3 DNA含有63个脱氧核苷酸的兼并碱基，在Invitrogen公司合成，包含两端和sdAb con匹配的约20个核苷酸，序列为：5’‑CTA  TTTATTATTGTGCTGCT(NNN)
21TGGGGTCAAGGTACTCAAGTTACT‑3’。同时合成一个和其3’末端互补的引物，用于通过PCR方式补齐DNA双链，引物序列为：5’‑AGTAACTTGAGTACCTTGACC‑3’。所有克隆均经过测序验证。
通过限制性内切酶EcoRI和BamHI线性化的载体和合成双链的CDR3 DNA混合之后，通过无缝克隆和装配试剂盒进行重组连接。转化到E.coli DH5α细胞中进行阳性克隆筛选和质粒扩
5
增，得到大约2.4×10 个克隆(CFU)，从中随机挑取10个克隆进行测序，验证读码框的正确性，以及兼并碱基分布的随机性。测序结果表明重组效率为100％，可以满足后续的筛选需求。随后通过质粒提取试剂盒(12145,Qiagen,Hilden,Germany)提取质粒备用。

[0055] 细胞培养：

[0056] HEK293T细胞，LLC1细胞和A549细胞购自美国ATCC(Manassas,VA,USA)并按照所建议的培养方法培养。带有Flag标签的sdAb突变体文库质粒和带有HA标签的SQSTM1质粒共转染HEK293T细胞，培养48h后，胰酶消化后的细胞用1％PFA固定，随后收集用于后续的isPLA。isPLA实验按照Duolink In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit试剂盒的要求操作(DUO92101,Sigma‑Aldrich),方法参考已发表文章(Nat Methods 2006；3:995‑1000.)。简言之，收集的细胞用含有0.5％Triton X‑100的PBS室温透化10min，随后将细胞转入1.5mL EP管并加入封闭液混匀，37℃，封闭1h。随后加入抗HA兔源抗体和抗FLAG的鼠源抗体，37℃孵育1h。再加入试剂盒中提供的MINUS(anti‑mouse)和PLUS(anti‑rabbit)PLA探针，37℃孵育1h。杂交探针随后加入Ligation‑Ligase液进行连接，37℃连接30min,最后加入Amplification‑Polymerase液进行扩增，37℃,100min。

[0057] FASC：

[0058] 在isPLA之后，HEK293T细胞用含1％BSA,2mM EDTA,0.1％NaN3的PBS缓冲液洗两遍(1500rpm,4℃,5min),立即用BD FACS Aria II flow cytometer分选，数据用FlowJo V10.0.7软件分析(Tree Star)。分选得到的阳性细胞收集在无核酸水中作为PCR模板用于cDNAs扩增。

[0059] PCR：

[0060] 用流式分选收集在无核酸水中的细胞用金属浴95℃孵育10min，用作PCR的模板来扩增CDR3区域DNA片段。与CDR3区域上游和下游序列互补的PCR引物CDR3‑forward:5’‑ACACCGCCATCTACTACTGC‑3’和CDR3‑reverse:5’‑GCTGCTCACTGTCACTTGTG‑3’(5’‑GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC‑3’和5’‑TGACACCTACTCAGACAATGCGATGC‑3’)在Invitrogen公司合成。Phusion Hot Start II High‑Fidelity PCR Master Mix(Thermo Scientific)根据说明书使用。在50μL反应体系中，选用500个细胞作为模板，每种引物终浓度为0.5μM。PCR步骤包括：预变性，98℃,2min；扩增50个循环，包括在98℃变性30sec,62℃退火30sec,
72℃延伸1min；最后在72℃继续延伸10min。PCR产物用于下一轮筛选亚文库的构建，如果不在进行下一轮筛选，PCR产物直接用于二代测序；如果期望得到单克隆，可以把PCR产物亚克隆到sdAb Con载体上，得到单克隆后测序。测序引物为5’‑GCACCAAAATCAACGGGAC‑3’。

[0061] 琼脂糖凝胶电泳：

[0062] DNA琼脂糖凝胶电泳根据以往描述标准方法进行。使用TAE电泳缓冲液(40mM Tris‑醋酸盐,1mM EDTA,pH 8.5)。在电泳之前在凝胶中加入终浓度0.5μg/mL的溴化乙锭(EtBr,Bio‑Rad),DNA样品在凝胶孔中80V分离1.5h。然后在凝胶成像系统中在紫外光照射下进行拍照。最后，将PCR产物用凝胶回收试剂盒回收。其中，从阳性细胞中扩增得到的122bp的CDR3区DNA片段重组克隆到线性化的sdAb Con质粒上，构建用于第二轮筛选的亚文库。同时，挑取部分单克隆用于CDR3区域的测序。

[0063] 共聚焦显微镜分析：

[0064] 把瞬时过表达SQSTM1和其它基因的HEK293T细胞接种到12孔板中poly‑lysine(P4707,Sigma‑Aldrich)包被过的盖玻片上，过夜培养后，用1％多聚甲醛(15812,Sigma‑Aldrich)将盖玻片上的细胞固定10min,用PBS缓冲液洗两遍，然后进行isPLA实验，最后用含DAPI的封片剂封片，用Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜进行分析并拍照记录实验结果。

[0065] Co‑IP和Western blotting：

[0066] 全细胞裂解液用手提式尖段匀浆器在含protease inhibitors cocktail tablets(4693132001,Roche,Basel,Switzerland)RIPA缓冲液(#9806,Cell Signaling Technology)中裂解。裂解液于12000rpm离心15min,去除不溶物。用BCAprotein assay kit(23250,Thermo Scientific)对蛋白浓度进行测定。上清液中加入一定量protein G‑Sepharose CL‑4B beads(17‑0618‑01,GEHealthcare)在4℃孵育30min，除去非特异结合蛋白，然后12000rpm离心10min除去proteinG‑Sepharose CL‑4B beads。得到的上清加入特定的一抗或对照IgG(AC011,mouse,Abclonal),在4℃孵育过夜，然后加入protein G‑Sepharose CL‑4B beads在4℃孵育2h。随后用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液洗3遍后，离心收集protein G beads，用SDS‑PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。免疫印迹分析用相应的抗体做Western  blotting,然后用ECL detection system(32106,Thermo Scientific)进行显影，曝光到x‑光胶片上，扫描记录曝光条带。

[0067] 抗SQSTM1 sdAb#1和#2CDR3 DNA和氨基酸序列如下：

[0068] 表1抗SQSTM1 sdAb#1和#2CDR3 DNA和氨基酸序列

[0069]

[0070] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。