标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用

摘要

本发明涉及合成生物学技术领域，尤其涉及标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用。本发明提供的PCRTag标签组合能够用于快速检测真核生物基因组有丝分裂重组热点。利用该标签组合能够通过特异性水印标签快速鉴定同源染色体的有丝分裂重组热点，为研究真核生物有丝分裂重组事件提供了便利方法。

权利要求

1.PCRTag标签组合的扩增引物组在制备酵母有丝分裂重组热点检测的试剂中的应用；

所述PCRTag标签组合由YEL038W_amp1、YEL013W_amp1、YER026C_amp1、YER056C_amp1、YER086W_amp1、YER113C_amp2、YER144C_amp2和YER170W_amp1组成；

所述扩增引物组的引物为：

YEL038W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1 2所示；

~

YEL013W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:3 4所示；

~

YER026C_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5 6所示；

~

YER056C_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:7 8所示；

~

YER086W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:9 10所示；

~

YER113C_amp2的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:11 12所示；

~

YER144C_amp2的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:13 14所示；

~

YER170W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:15 16所示。

~

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。

说明书

标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及合成生物学技术领域，尤其涉及标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用。

背景技术

[0002] DNA分子间的同源重组是指DNA序列经历双链断裂、重组修复、染色体分离过程实现序列间的重新组合，形成新型DNA分子的生物学过程。同源重组不仅可以修复DNA的双链断裂(double‑stranded break，DSB)，维持基因组稳定性，而且可以实现遗传信息的交叉互换，产生子细胞遗传多样性，加速生物进化过程。

[0003] 同源重组包含减数分裂重组和有丝分裂重组两种方式，自然状态下，细胞中的遗传物质更倾向于进行减数分裂重组，有丝分裂重组的发生率比减数分裂重组事件的发生率4 5
低10～10倍，因此人们对减数分裂重组事件的研究更为深入。但是有丝分裂重组在真核生物中也具有十分重要的作用，包括修复自发产生的DSB、重新启动停滞的复制叉、在缺少端粒酶的细胞中提供一个端粒复制替代途径、通过产生新的染色体重排促进基因组进化。细胞有丝分裂过程中的染色体重排会导致肿瘤抑制位点的杂合性缺失(loss  of heterozygosity，LOH)，进而诱发细胞的恶性生长，诱发癌细胞，虽然LOH的诱因有很多，但在一项关于视网膜母细胞瘤的研究中，约有一半的LOH事件与有丝分裂重组相关，因此关于有丝分裂重组机制的研究还可以为癌症的诱发机制提供指导意见。

[0004] 早期只是对酵母中单个重组热点区域进行探究，大量的研究都是通过构建减数分裂特异性整合质粒对染色体重排率进行表征，它能够在减数分裂过程中整合到基因组中导致同源区域的异位重组，研究发现位于III号染色体2‑2.5cM/kb处靠近THR4的DNA片段的减数分裂重组率比染色体的平均重组率高出6倍，该位点为一个强效DSB位点。应用类似的方法，还定位了酿酒酵母的以下重组热点：HIS2、HIS4、ARG4、CYS3、DED81、ARE1/IMG1、CDC19、LEU2‑CEN3。通过对上述热点进行序列分析发现，大部分重组热点均为DSB位点，通常是对DNase I敏感的串联重复序列，但也有例外，比如ade6‑M26的重组热点并未位于DSB位点处，而是位于DSB位点上游500bp的序列中，该位点可以和转录因子Atf1/Pcr1结合，White及其同事也通过实验HIS4热点需要与转录因子Bas1、Bas2和Rap1结合热点，这种需要与转录因子结合的热点称为“α”热点，而不需要与转录因子结合的热点称为“β”热点。以上实验说明DSB位点是发生重组断裂的首选位点，但并非重组率的唯一影响因素，重组率还与染色质结构、染色体所处环境密切相关。

[0005] 随着DNA测序技术的发展，人们开始着力于全基因组范围内的重组热点及冷点的探究。Gerton等人利用DNA探针法对6200个ORF进行微阵列分析，将重组率排在前12.5％的区域作为重组热点区域，最后共检测出177个热点。结果发现所有的染色体至少具有一个热点，染色体大小与热点数量之间存在显着相关性，对所有的重组热点进行对比分析发现没有任何单一的显着特点是所有的热点区域都具备的，热点间相关性最强的因素是高GC含量。Mancera等使用ssGenotyping对亲本菌株S288c/YJM789杂合子及其经过51次减数分裂产生的204个孢子进行基因分型，绘制出酵母基因组减数分裂重组的高分辨率图谱。研究表明平均每次减数分裂产生90.5个CO和46.2个NCO，且CO的数量与染色体长度成线性关系。通过统计每个标记处出现的菌株个数，借以表征基因组各个位点的重组率，发现84％的重组热点区域与启动子重叠。大部分基因组CO/NCO的分布比例存在差异，差异最大可以达到CO/NCO事件比率为14：0和0：7。通过对重组热点区域的GC含量进行分析发现染色体倾向于在高GC含量处发生断裂重组。Charles利用SNP微阵列法对酵母IV号染色体的有丝分裂重组规律进行了探究，发现反向重复序列所在区域极易成为断裂热点区域，因为它们在重组时经常会发生链内配对，形成的发夹结构阻碍了复制叉的移动，形成DSB缺口，有时候也会形成类似于霍利迪结的十字形结构，被核酸内切酶错误识别并切割，研究表明位于981‑992kb间的反向Ty元件对(YDRWTy2‑3和YDRCTy1‑3)与热点HS4的重组率显著相关。通过对酵母中的染色体易碎位点进行特征化分析后发现染色体在回文序列、串联重复序列、G4 DNA序列、tRNA、包含内含子的基因序列、ARS元件、Ty元件及其长末端重复序列、高度转录的基因、复制终止区、高γ‑H2AX区域、高GC含量区域、Rrm3p终止位点等位置更容易发生染色体基因组重组。Yang等对二倍体酵母在自发有丝分裂过程中的染色体重排热点进行了探究，发现大型缺失/重复和易位往往是由Ty元素或delta元素等重复序列之间的同源重组介导的，酵母基因组中I‑LOH(Interstitial LOH)的断裂点与复制终止(Ter)序列和GC含量异常的区域显着相关，而T‑LOH(Terminal LOH)多位于G4四链体序列、γ‑H2AX含量高的区域、GC含量高的区域以及非编码RNA基因处。

[0006] 虽然目前已经针对酵母有丝分裂重组的基因组变化规律开展了大量的研究，但因为受限于有丝分裂文库的构建及重组菌株的筛选，关于酵母重组热点和冷点区域的研究还并不充分。合成型酵母体内的SCRaMbLE系统可以快速构建基因组重组文库，其次，PCRTag水印标签的引入为基因组重组菌株重组热点区域的定位提供了简单高效的方法。合成型染色体随机打乱重组的过程与癌症的形成过程十分类似，因此通过对酵母合成型染色体在人工诱导重排过程中的重组规律进行探究，有望为人类染色体疾病相关靶点基因的确定提供理论模型，为抗肿瘤药物的靶点筛选和设计提供参考。通过对比分析合成型二倍体酵母与人为构建的全基因组加倍的四倍体酵母在人工诱导重排中的规律，有助于解析基因组加倍对基因组重组所产生的影响，对癌症中的多倍体化和染色体碎裂研究具有指导性意义。但目前尚未寻找到合适的PCRTag水印标签用于有丝分裂重组热点的研究。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用。

[0008] 本发明采用的方法可适用于所有包含特异性水印标签的染色体重排热点探究。但由于不同物种染色体标签的特异性，对不同染色体进行探究时需要注意选取该条染色体上所对应的水印标签。本发明针对酿酒酵母进行研究，在研究中，采用了含有人工合成染色体的酵母菌株。每条合成型染色体在设计初始引入了不同数量的特异性水印标签，比如synII、synIII、synV、synVI、synX、synXII分别引入了532、186、339、164、490、681对PCRTag标签，这些标签均可用于基因组重组菌株的筛选。但在对有丝分裂重组热点进行检测的过程中，水印标签的选择应当根据染色体的长度来进行，并以最终获得良好的检测效果为目的。

[0009] 本发明针对酵母的V号染色体进行研究，本发明提供的PCRTag标签组合包括：YEL038W_amp1、YEL013W_amp1、YER026C_amp1、YER056C_amp1、YER086W_amp1、YER113C_amp2、YER144C_amp2、YER170W_amp1、YEL032W_amp2、YEL029C_amp1、YEL023C_amp1、YEL019C_amp1中至少两种。一些具体实施例中，本发明所述的PCRTag标签组合包括：
YEL038W_amp1、YEL013W_amp1、YER026C_amp1、YER056C_amp1、YER086W_amp1、YER113C_amp2、YER144C_amp2和YER170W_amp1。

[0010] 本发明提供的PCRTag标签组合中，YEL038W_amp1、YEL013W_amp1、YER026C_amp1、YER056C_amp1、YER086W_amp1、YER113C_amp2、YER144C_amp2和YER170W_amp1均匀的分布在synV染色体上，其中2个PCRTag平均分布在V号染色体的左臂，剩下6个平均分布在V号染色体的右臂上。相对于其他PCRTag标签的组合，能够观测到更多的染色体有丝分裂重组现象。

[0011] 此外，针对在YEL038W_amp1～YEL013W_amp1间发生染色体断裂的菌株，还可以进行10kb细化分析，每10kb重新选择了一个PCRTag，分别验证了上述样本在YEL032W_amp2、YEL029C_amp1、YEL023C_amp1、YEL019C_amp1处的基因组丢失情况。

[0012] 本发明所述的标签组合在有丝分裂重组热点检测中的应用。

[0013] 本发明通过人工干预，实现同源染色体的有丝分裂重组，通过特异性水印标签快速构建重组菌株文库，为研究有丝分裂重组事件提供了便利方法。本发明中，所述有丝分裂为真核生物的有丝分裂。所述真核生物为酵母菌，一些具体实施例中，所述真核生物为酿酒酵母。

[0014] 本发明研究中涉及的菌株包括二倍体酿酒酵母、三倍体酿酒酵母和四倍体酿酒酵母。

[0015] 所述二倍体酿酒酵母含有一条野生型V号染色体(wtV)和一条合成型V号染色体(synV)。三倍体酿酒酵母含有一条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)。四倍体酿酒酵母含有二条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)。

[0016] 本发明还提供了检测酵母有丝分裂重组热点的试剂，其包括检测所述的标签组合的引物。本发明中所述引物包括：

[0017] YEL038W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；

[0018] YEL013W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；

[0019] YER026C_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；

[0020] YER056C_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:7～8所示；

[0021] YER086W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；

[0022] YER113C_amp2的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；

[0023] YER144C_amp2的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；

[0024] YER170W_amp1的扩增引物，其核酸序列如SEQ ID NO:15～16所示。

[0025] 本发明中，所述试剂还包括PCR反应试剂。所述PCR反应试剂包括Taq酶。

[0026] 本发明还提供了检测酵母有丝分裂的重组热点方法，其为以本发明所述的试剂对酵母菌进行检测。

[0027] 本发明以V号染色体为研究对象，对酵母有丝分裂的重组热点进行研究。

[0028] 所述酵母菌包括二倍体酿酒酵母、三倍体酿酒酵母和四倍体酿酒酵母。其中，所述二倍体酿酒酵母含有一条野生型V号染色体(wtV)和一条合成型V号染色体(synV)。三倍体酿酒酵母含有一条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)。四倍体酿酒酵母含有二条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)。

[0029] 所述酵母菌在扩增检测前，经诱导发生重排、构建重排文库。所述诱导采用雌二醇。所述诱导的培养基中雌二醇的浓度为1μmol/L。

[0030] 本发明所述的检测方法包括：以本发明所述的扩增引物，对酵母菌进行扩增。所述扩增的体系包括：上游引物、下游引物、Taq酶、模板DNA和水。

[0031] 根据比较三种菌株的扩增结果，获得基因组有丝分裂的多样性。主要包括统计重排后相邻PCRTag间出现断点的次数，获得样本突变情况。例如：合成型V号染色体的PCRTag条带全部存在，说明检测菌株中所有合成型V号染色体的DNA片段至少存在一个拷贝。合成型V号染色体的PCRTag条带全部未检测到，说明合成型V号染色体在检测菌株中全部发生丢失。合成型V号染色体的PCRTag条带部分存在，表明在三倍体检测菌株中部分合成型V号染色体DNA区域的两个拷贝全部丢失。扩增断点次数多，则说明该区段不稳定，是重组热点区域。而扩增断点次数少，则说明该部分基因组重组时不易丢失，为重组冷点区域。

[0032] 此外，对重排文库进行测序，并进行统计分析。本发明所述的测序包括：通过特异性的提取双端测序获得的全基因组测序读数。所述统计分析包括：利用合成型V号染色体和野生型V号染色体上的PCRTag序列的差异，分析细胞在基因组重排过程中发生的同源染色体拷贝数变异；通过测序深度反应细胞中合成型V号染色体和野生型V号染色体的数目；统计异位重组的方式和位置，分析姐妹染色单体间异位重组导致的不均等重复/缺失；统计同源染色体SNP位点数量，分析间质性杂合性缺失现象。

[0033] 本发明提供了PCRTag标签组合，并提供了其在快速检测真核生物基因组有丝分裂重组热点中的应用。利用该标签组合能够通过特异性水印标签快速鉴定同源染色体的有丝分裂重组热点，为研究真核生物有丝分裂重组事件提供了便利方法。

附图说明

[0034] 图1示不同核型多倍体菌株构建流程；

[0035] 图2示PCRTag检测合成型、野生型染色体示意图；

[0036] 图3示PCRTag检测三倍体菌株V号染色体存在形式；

[0037] 图4示三倍体SCRaMbLE突变体synV存在类型及比例；

[0038] 图5示二倍体相邻PCRTag间出现断点区域的次数统计；

[0039] 图6示二倍体synV 70.5kb～118.1kb间10kb细化断点次数统计；

[0040] 图7示利用PCRTag特异性的识别测序读段检测其所属ORF的方法；

[0041] 图8示三倍体synV完全删除酵母菌株全基因组测序深度图；

[0042] 图9示二倍体酵母姐妹染色单体间异位重组导致的不均等重复/缺失现象；

[0043] 图10示二倍体有丝分裂重组导致的I‑LOH。

具体实施方式

[0044] 本发明提供了标志物组合及其在有丝分裂重组热点检测中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0045] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。本发明中，所采用的菌株皆来自天津大学。PCRTag标签命名参见“Perfect”designer chromosome V and behavior of a  ring derivative.(Science,2017,355(1046):eaaf4704.)和http://syntheticyeast.org/synv/。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0046] 实施例

[0047] 1.重排菌株文库的构建

[0048] 1.1菌株

[0049] ①二倍体酿酒酵母菌株yLHM120作为出发菌株，该菌株含有一条野生型V号染色体(wtV)和一条合成型V号染色体(synV)，来自天津大学。

[0050] ②三倍体酿酒酵母菌株yXZX1892作为出发菌株，该菌株含有一条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)，来自天津大学。

[0051] ③四倍体酿酒酵母菌株yLHM086作为出发菌株，该菌株含有二条野生型V号染色体(wtV)和两条合成型V号染色体(synV)，来自天津大学。

[0052] 1.2诱导重排：

[0053] 从SC‑His平板中挑取携带pCRE4的单个菌落，接种到3mL SC‑His培养基中，30℃振荡培养24小时。

[0054] 室温条件下5000rpm离心2min，吸除上清、收集细胞并用无菌水洗涤三次。

[0055] 将步骤2中的细胞转接到3mL不含组氨酸和葡萄糖、含有2％甘油作为碳源的完全合成(SC)培养基中，并在30℃下过夜振荡培养。

[0056] 室温条件下5000rpm离心2min，吸除上清、收集细胞并用无菌水洗涤三次。

[0057] 重悬细胞于3mL不含组氨酸和葡萄糖、含有2％甘油和2％半乳糖作为碳源的完全合成(SC)培养基中，使初始OD600＝0.6～1.0，添加雌二醇浓度至1μM，在30℃下振荡培养8小时。(诱导酿酒酵母细胞中pCRE4质粒在细胞周期中产生一次CRE重组酶，使细胞中合成型V号染色体的loxPsym位点之间发生DNA重组，产生DNA删除、插入、反转等结构变异，图1)[0058] 用无菌水将细胞进行适当稀释并涂布在SC‑His平板上，以确保在对照和实验(用半乳糖和雌二醇处理)平板上观察到相似数量的菌落，并在30℃下培养72小时，观察和统计菌落数目和菌落大小。

[0059] 2.基因组有丝分裂重组菌株的筛选

[0060] 对菌株文库使用合成型聚合酶链式反应标签(PCRTag)进行分析。在由loxPsym或loxP位点划分的177个区段中(synV染色体上一共有174个loxPsym重组位点和2个loxP重组位点，该176个重组位点将染色体分割为177个区域，从染色体左端起始位置起，个人进行编号1‑177。)。在其中103个区段中，其中至少有一个非必需基因，并且该基因中设计了至少一对PCRTag。

[0061] 选择其中均匀分布的8组非冗余PCRTag对V号染色体进行分析。8个PCRTag序列所属的基因分别为YEL038W、YEL013W、YER026C、YER056C、YER085W、YER113C、YER144C和YER170W。其中2个PCRTag平均分布在V号染色体的左臂，剩下6个平均分布在V号染色体的右臂上(图2)。

[0062] 表1 PCRTag引物一览表

[0063]

[0064]

[0065] 表2酿酒酵母菌落PCRTag分析反应体系(10μL)

[0066] 反应试剂 体积(μL)Primer F(c＝10μΜ) 0.25
Primer R(c＝10μΜ) 0.25
2×Rapid Taq Master Mix 5
Template(Boiled yeast) 1
ddH2O 3.5

[0067] 三倍体对照菌株yXZX1892的PCRTag检测结果显示，合成型PCRTag检测条带和野生型PCRTag检测条带均存在。说明细胞中合成型V号染色体和野生型V号染色体都完整存在。PCRTag检测结果表明基因组重排文库的基因组有丝分裂变化呈现出多样性，合成型V号染色体的存在形式如下：

[0068] 1)检测合成型V号染色体的PCRTag条带全部存在，如图3中的样本yXZX2468的检测结果所示。这说明检测菌株中所有合成型V号染色体的DNA片段至少存在一个拷贝。

[0069] 2)合成型V号染色体的PCRTag条带全部未检测到，如图3中的样本yXZX1105的检测结果所示。说明合成型V号染色体在检测菌株中全部发生丢失。

[0070] 3)检测合成型V号染色体的PCRTag条带部分存在。如图3中的样本yXZX1937的检测结果所示，只有两个合成型PCRTag(基因YEL038W和YER026C的PCRTag)存在。表明在三倍体检测菌株中部分合成型V号染色体DNA区域的两个拷贝全部丢失。

[0071] 接着对基因组重排文库中，合成型V号染色体存在形式不同的实验组菌株进行基因型统计分析。本研究从三倍体酿酒酵母基因组重排文库中筛选出的样本共有274个，分别对筛选文库中不同基因型菌株的个数及相应的比例进行展示。分类统计发现，合成型V号染色体完全存在的样本共有68个，占三倍体总样本的24.82％。合成型V号染色体部分存在的样本有10个，占三倍体总样本的3.65％。合成型V号染色体完全丢失的样本共有196个，占总样本的71.53％。这说明三倍体酿酒酵母对照菌株yXZX1892经基因组重排后，形成不同基因型的概率不尽相同。其中发生合成型V号染色体丢失事件的概率最高，促进了非整倍体酿酒酵母细胞的形成(图4)。

[0072] 3.染色体有丝分裂热点鉴定结果

[0073] 菌株文库使用合成型聚合酶链式反应标签(PCRTag)进行分析。在由loxPsym或loxP位点划分的177个区段中(synV染色体上一共有174个loxPsym重组位点和2个loxP重组位点，该176个重组位点将染色体分割为177个区域，从染色体左端起始位置起，个人进行编号1‑177。)。在其中103个区段中，其中至少有一个非必需基因，并且该基因中设计了至少一对PCRTag。

[0074] 对yLHM120中重排后相邻PCRTag间出现断点的次数进行了统计，分为7种不同的类型(图5)。其中，有33个样本在70.5kb～118.1kb间某一区段出现断点，占部分缺失总样本量的33％，以yFJ1779为例对Type 1进行了阐述，PCR结果表明该菌株在0～79.3kb区段发生了synV染色体的丢失，在YEL033W与YEL032W间出现染色体的断裂(图5中的B)。39％的菌株在118.1kb‑193.1kb间存在断点区域，其中yFJ1809中的合成型V号染色体在着丝粒附近断裂，着丝粒右侧染色体发生丢失。上述两个区段发生染色体断裂重组的比例较大，除此之外，还有15％的样本在193.1kb～251.7kb间发生断裂，12％在251.7kb～312.7kb间发生断裂，8％在312.7kb～372.0kb间发生断裂，6％在372.0kb～433.4kb间发生断裂，17％在433.4kb～
494.0kb间发生断裂。

[0075] 针对yLHM120在70.5kb‑118.1kb间出现断点的33个菌株，验证了这些样本在YEL032W_amp2、YEL029C_amp1、YEL023C_amp1、YEL019C_amp1处的基因组丢失情况(图6)。结果显示，17个菌株在70.5kb～79.3kb间出现断点，6个菌株在79.3kb～87.2kb间出现断点，9个菌株在99.4kb～109.2kb间出现断点，11个菌株在109.2kb～118.1kb间出现断点，没有菌株在87.2kb～99.4kb间出现断点，分别占总样本量的52％、18％、27％、33％、0％。上述统计结果表明70.5kb～79.3kb为该区段的相对重组热点区域，而86.9kb‑99.4kb间DNA序列较为稳定，基因组重组时不易丢失，为重组冷点区域。

[0076] 4、同源染色体拷贝数检测方法的建立

[0077] 全基因组测序是指使用MGISEQ‑2000对菌株基因组进行双端测序。在研究过程中很难从从同时携带合成型V染色体和野生型V染色体的三倍体酿酒酵母的全基因组测序数据中，准确识别合成型V染色体的测序结果。为了克服这一困难，本研究中自行开发出一种高通量分析基因组测序数据的方法。即通过特异性的提取双端测序获得的全基因组测序读数(reads)(图7)。然后将合成型V染色体和野生型V染色体同源区域的覆盖深度定义为同一区段中PCRTag编号的读取次数。利用合成型V号染色体和野生型V号染色体上的PCRTag序列的差异，分析细胞在基因组重排过程中发生的同源染色体拷贝数变异(copy number，CN)。

[0078] 5、同源染色体丢失和复制的检测方法

[0079] 利用PCRTag检测重排菌株中有71.53％的三倍体菌株合成型V染色体完全丢失，所以该染色体变异事件的发生绝不是偶然现象。本研究基于全基因组测序读数的覆盖深度表明多倍体酿酒酵母在染色体重排后V号染色体数目变化，如图8所示。图中蓝色代表合成型V号染色体的测序深度，橙色代表野生型V号染色体的测序深度。横坐标代表相应PCRTag读段所属ORF在V染色体上的区段位置，通过测序深度反应细胞中合成型V号染色体和野生型V号染色体的数目。

[0080] 由测序深度图可以看出，三倍体对照菌株yXZX1892中合成型V号染色体的测序深度为140左右，野生型V号染色体的测序深度为70左右。合成型V号染色体的测序深度是野生型V号染色体的2倍。故细胞中合成型V号染色体的拷贝数目为2，野生型V号染色体的拷贝数目为1，细胞中未发生任何染色体变异事件。实验组菌株yXZX2471中合成型V号染色的测序深度都为0，故细胞中合成型V号染色体的拷贝数都为0，即合成型V号染色体确实发生完全丢失，证实了PCRTag初步检测结果的正确性。进一步分析发现实验组细胞中相应的野生型V号染色体的测序深度都变为140左右，即野生型V号染色体都扩增1倍，即三倍体重排菌株中含有两条野生型V号染色体，形成3n‑1型的非整倍体酵母细胞。这说明在三倍体酵母细胞在基因组重排后确实发生了合成型V号染色体的完全丢失，并且这种染色体变异事件是高频且稳定存在的。

[0081] 6、姐妹染色单体间异位重组导致的不均等重复/缺失现象

[0082] 姐妹染色单体上的易位重组会导致不均等的染色体交换，出现一条同源染色体部分片段被删除或复制，另一条同源染色体保持不变的现象(图9中的A)。根据异位重组的方式和位置，我们将姐妹染色单体间的异位重组进一步划分为四种类型(图9中的B)，第一种是间质缺失，即synV中间的部分片段删除，而wtV保持不变(yFJ1803)。二倍体测序样本中有20个样本发生间质缺失，我们对上述样本间质缺失的断点位置及频次进行了统计，绘制出如图9中C所示的热点分布图，将出现次数大于4的断点定义为缺失断裂热点区域，共检测到
4个热点区域，分别位于105.4kb～106.8kb、118.6kb～122.3kb、446.4kb～446.7kb、
518.0kb～519.1kb。因为已有文献报道过GC含量会影响基因转换，进而影响基因组重组热点的分布，因此我们对断裂位点的GC含量进行了测定，105.4kb～106.8kb、446.4kb～
446.7kb区域的GC含量大于synV的平均值(38％)，分别高出1％、4％，118.6kb～122.3kb、
518.0kb～519.1kb区域的GC含量比synV的平均值分别低1％、2％。

[0083] 如果上述缺失发生在染色体末端，我们则将其定义为末端缺失。如图9所示，yFJ1865在左右两端31.9kb～33.2kb、233.5kb～235.8kb均发生了染色体断裂，具有两个末端缺失断裂位点。二倍体共有20个菌株的synV发生了末端缺失，我们对上述样本中的断点位置进行了统计，23％的菌株在75.1kb～77.5kb、135.9kb～140.0kb处发生了染色体重排，因此将上述两个区域视为二倍体菌株在末端缺失中的高频断裂位点，其中75.1kb～77.5kb的GC含量比平均值高3％，135.9kb～140.0kb的GC含量比平均值低3％。135.9kb～140.0kb位于着丝粒侧翼，该区域含有大量的重复序列，能够促进姐妹染色单体间的异位重组。

[0084] 第三种是间质重复，synV中间部分片段复制一份拷贝，wtV不变。二倍体测试菌株中仅有1个菌株出现间质重复现象(yFJ1798)，它在多个区段均发生了synV的间质重复，主要包括4个区段：123.5kb～124.0kb、130.4kb～131.0kb、131.8kb～133.8kb、191.8kb～192.6kb，除了131.8kb～133.8kb区段GC含量值低于平均值3％，130.4kb～131.0kb GC含量值等于对照，剩下两个区段分别比平均值高出4％、2％。

[0085] 如果重复发生在端粒两侧，则称为末端重复，二倍体中有1个样本发生末端重复(yFJ1843)，在105.4kb～106.8kb处synV发生断裂，左侧0kb～106.8kb间序列发生了复制，右侧145.7kb～536.0kb间发生末端缺失。

[0086] 6、间质性杂合性缺失(I‑LOH)

[0087] 如果重组发生在同源染色体之间，会产生有丝分裂基因转换/交叉互换事件，介导一条同源染色体部分SNP变为0，另一条染色体在同源部分升高至原来的两倍，导致LOH。I‑LOH通常在修复G2时期的DSB时产生，是一小部分区域产生基因转换的产物(图10)。我们在二倍体菌株yFJ1805、yFJ1815、yFJ1836中观察到了I‑LOH现象，其中yFJ1805和yFJ1836分别在321.6kb～339.9kb、344.1kb～357.7kb处synV的SNP降为0，wtV相应增加，yFJ1815在438.8kb～456.1kb、481.9kb～507.8kb处两个位点处发生了基因转化，长度均不超过30kb。

[0088] 我们发现在I‑LOH中，有3个断点位于基因内部，这是在姐妹染色单体发生异位重组时没有检测到的，所有发生异位重组的样本均在两个ORF框间发生染色体断裂。有研究报道，大多数的异位重组是由重复序列之间的同源重组介导的。LoxPsym是一段位于ORF框外34bp的反向回文序列，诱导重排时Cre作用于loxPsym上产生DSB缺口，任意两个loxPsym间就可以通过重复序列之间的这种同源重组修复缺口，因此异位重组倾向于在位于ORF框外的loxPsym间发生，而不易在基因内部发生染色体断裂。相比于有丝分裂基因转换过程，姐妹染色单体间的异位重组对重复序列的要求更高。

[0089] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。