一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材料及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材料及其制备方法和应用，涉及荧光传感药物载体领域。本发明所述材料利用以四苯乙烯为主体的荧光硅氧烷有机分子和硅酸四乙酯通过共缩聚的方式，一步合成发光MSNs介孔材料。所得材料通过表面共价嫁接的方式将缺氧敏感的偶氮苯基团修饰在MSNs表面。将药物甘氨酸和荧光团罗丹明B装载进入介孔孔道内部，并利用环糊精和偶氮苯的包合作用对药物分子进行封装。封装后的材料内部的四苯乙烯可以和罗丹明B形成良好的FRET效应。本发明所述载体材料，在实现缺氧环境释放的同时，利用FRET通过颜色变化对药物释放进行实时监测。

权利要求

1.一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材料，其特征在于，四苯乙烯分子通过共价键连接在MSNs骨架中，罗丹明B和药物装载在介孔孔道内；羧基偶氮苯通过共价键连接在MSNs表面，并在表面包上β‑环糊精对药物进行封装；

所述MSNs的荧光发射波长为480nm；

所述材料在有氧情况下孔壁中的四苯乙烯基团和孔道中的罗丹明基团产生FRET，发橙红色光；在缺氧条件下，偶氮苯断裂，罗丹明随着药物释放，FRET消失，MSNs发蓝绿色光；

所述材料表面修饰偶氮苯基团，并通过与β‑CD之间的包合作用对材料孔内药物进行封装。

2.权利要求1所述载药材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以正硅酸四乙酯(TEOS)为硅烷前驱体，将合成好的连接硅烷偶联剂的四苯乙烯荧光分子作为有机前驱体，共同加入到CTAB水溶液中反应，反应结束后减压过滤、洗涤得MSNs；

将所述MSNs加入到甲苯中，用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷将二氧化硅纳米球氨基化，室温下过夜，离心分离颗粒后，表面活性剂模板CTAB在甲醇/盐酸溶液中回流24h，收集产生的MSN‑NH2颗粒；

将羧基偶氮苯,1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到水/N,N’‑二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中活化，然后与MSN‑NH2颗粒混合搅拌，得MSN‑Azo；

将MSN‑Azo、甘氨酸和罗丹明B分散在水溶液中，将β‑CD加入到混合溶液中通过跟偶氮苯的包合作用进行药物封装得到所述载药材料。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述CTAB、TEOS与水的摩尔比为1：8.75：

10100；

所述TEOS与四苯乙烯硅烷分子的质量比为10：1；

所述EDC、NHS与羧基偶氮苯的质量比为1：1：1；

所述MSN‑Azo、甘氨酸与罗丹明B的质量比为2：2：1～2。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述载药材料和β‑CD的质量比为2：1。

5.一种基于权利要求1所述载药材料制备得到的荧光纳米探针，其特征在于，所述荧光纳米探针具备FRET监测性能。

6.权利要求1所述载药材料或权利要求5所述荧光纳米探针在制备MSNs药物释放和监测、细胞缺氧治疗的工具和/或药物中的应用。

说明书

一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材料及其制备方法

和应用

技术领域

[0001] 本申请涉及荧光传感药物载体领域，特别是涉及一种FRET型 缺氧性药物释放检测MSNs载药材料及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 介孔二氧化硅传感材料在药物的传递、控制释放方面有着非常 重要的应用价值。氧是人体新陈代谢的必须物质，如果没有氧气， 人体每天摄取的糖、脂肪、蛋白质三大营养
素的生物氧化将无法进 行，人的生命也因没有正常生理活动所需的能量而终止。缺氧导致 
体内有氧代谢率下降，无氧酵解加强，机体代谢效率降低，免疫力 下降。例如，脑梗死及其
容易导致脑组织的缺氧，一旦出现缺氧首 先要迅速促使血管的再通以纠正脑乏氧。目前已
经有针对机体缺氧 的药物，然而针对缺氧条件下响应性控制药物释放，以及向特定细 胞
或者组织递送特定药物用于缺氧细胞的治疗仍然面对着挑战。

[0003] 荧光共振能量转移(FRET)是能量供体和受体荧光团之间的一 种成熟的能量转移过程，由于FRET信号对供体和受体之间的距离 非常敏感，FRET的这一种独特功能可用于监
测药物分子客体与荧光 纳米材料宿主之间的微妙相互作用。以介孔二氧化硅纳米粒子 
(MSNs)体系为基础的FRET载药系统现在已经被广泛的研究并且 取得了巨大的成就。但是
大多数的系统为基于pH、氧化还原等条件 的刺激释放，针对缺氧性释放的研究还有待开
发。另外大多数的 MSNs体系只能达到按需释放或者实时监控中的一种。因此设计具 有缺
氧释放并且允许监测药物释放过程的“门阀”MSNs纳米体系将有 利于缺氧过程中药物的递
送性能。多功能性基于FRET原理的 MSNs为缺氧性释放药物载体的控制和监测提供了可能。

发明内容

[0004] 为了实现荧光药物载体所需MSNs缺氧性释放，实时释放检测 等技术问题，本发明提供一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs 载药材料及其制备方法和应用，在MSNs体系中，
孔壁中的四苯乙 烯基团和罗丹明基团之间形成FRET，缺氧条件下，偶氮苯断裂， 罗丹明B
和药物释放，FRET消失，同时利用FRET实时监测药物的 释放。

[0005] 本发明提供了以下技术方案：

[0006] 一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材料，四苯乙烯 分子通过共价键连接在MSNs骨架中，罗丹明B和药物装载在介孔 孔道内；羧基偶氮苯通过共价键连接在MSNs表
面，并在表面包上 β‑环糊精对药物进行封装。

[0007] 优选的是，所述MSNs的荧光发射波长为480nm。

[0008] 优选的是，所述材料在有氧情况下孔壁中的四苯乙烯基团和孔 道中的罗丹明基团产生FRET，发橙红色光；在缺氧条件下，偶氮 苯断裂，罗丹明随着药物释放，FRET消失，
MSNs发蓝绿色光。

[0009] 优选的是，所述材料表面修饰偶氮苯基团，并通过与β‑CD之间 的包合作用对材料孔内药物进行封装。

[0010] 上述载药材料的制备方法，包括以下步骤：以正硅酸四乙酯 (TEOS)为硅烷前驱体，将合成好的连接硅烷偶联剂的四苯乙烯荧 光分子作为有机前驱体，共同加入到CTAB水
溶液中反应，反应结 束后减压过滤、洗涤得MSNs；

[0011] 将所述MSNs加入到甲苯中，用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷将二 氧化硅纳米球氨基化，室温下过夜，离心分离颗粒后，表面活性剂 模板CTAB在甲醇/盐酸溶液中回流24h，收集
产生的MSN‑NH2颗 粒；

[0012] 将羧基偶氮苯,1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到水/N,N’‑二甲基甲酰 胺(DMF)的混合溶液中活化，然后与MSN‑NH2颗
粒混合搅拌， 得MSN‑Azo；

[0013] 将MSN‑Azo、甘氨酸和罗丹明B分散在水溶液中，将β‑CD加 入到混合溶液中通过跟偶氮苯的包合作用进行药物封装得到所述载 药材料。

[0014] 优选的是，所述CTAB、TEOS与水的摩尔比为1：8.75：10100；

[0015] 所述TEOS与四苯乙烯硅烷分子的质量比为10：1；

[0016] 所述EDC、NHS与羧基偶氮苯的质量比为1：1：1；

[0017] 所述MSN‑Azo、甘氨酸与罗丹明B的质量比为2：2：1～2。

[0018] 优选的是，所述载药材料和β‑CD的质量比为2：1。

[0019] 一种基于上述载药材料制备得到的荧光纳米探针，所述荧光纳 米探针具备FRET监测性能。

[0020] 上述载药材料或上述荧光纳米探针在制备MSNs药物释放和监 测、细胞缺氧治疗的工具和/或药物中的应用。

[0021] 本申请的有益效果是：(1)本发明所提供的具有FRET效应的 MSNs药物载体，在有氧情况下孔壁中的四苯乙烯基团和孔道中的 罗丹明基团产生FRET，发橙红色光；在缺氧条
件下，偶氮苯断裂， 罗丹明随着药物释放，FRET消失，MSNs发蓝绿色光，通过光学变 化可以
观察到药物在缺氧条件下的控制释放。

[0022] (2)本发明所提供的具有FRET效应的MSNs药物载体，由于 引入对缺氧环境敏感的偶氮苯对缺氧环境能够敏感的探测并实施药 物释放。利用此材料可推动多孔材料在刺激
下药物释放以及缺氧性 治疗等领域具有较大应用潜力。

[0023] (3)本发明的药物载体材料合成易操作，工艺易控制，原料及 仪器设备使用成本低等。

附图说明

[0024] 图1为实施例1中合成的含四苯乙烯TPEMSN‑NH2材料；

[0025] 图2为实施例2中TPEMSN‑azo与未修饰偶氮苯TPEMSN‑NH2红外光谱对比；

[0026] 图3为实施例3‑实施例5中合成FRET的MSNs药物载体释放 原理；

[0027] 图4为实施例6中TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD利用FRET进 行药物释放图(说明：ChannelⅠ是只开了蓝色和绿色通道， ChannelⅡ是只开了红色通道，Merge是ChannelⅠ和
ChannelⅡ的 拼接图)；

[0028] 图5为实施例7中材料对缺氧细胞的治疗作用，与control组相 比，其余四组实验组与control组均有显著性差异。

具体实施方式

[0029] 下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描 述。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请， 而非对本申请的限定。另外还需要说明的
是，基于本申请中的实施 例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的
所 有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0030] 在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、 结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的 各个位置出现该短语并不一定均是指相
同的实施例，也不是与其它 实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地
和隐 式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

[0031] 本发明提供了一种FRET型缺氧性药物释放检测MSNs载药材 料，其中四苯乙烯分子通过共价键连接在MSNs骨架中，罗丹明B 和药物装载在介孔孔道内。羧基偶氮苯通过共
价键连接在MSNs表 面，并在表面包上β‑环糊精对药物进行封装。其中介孔二氧化硅 MSNs
的骨架中固定四苯乙烯发光分子做为能量供体，孔道中载入 罗丹明B分子作为能量受体。
所述材料表面修饰偶氮苯基团，并通 过与β‑CD之间的包合作用对材料孔内药物进行封装。
表面修饰偶氮 苯对缺氧环境敏感，在缺氧环境下会引发N＝N双键的断裂，环糊精 脱落实
现药物释放。

[0032] 在实施例中，所述MSNs药物载体具有荧光共振能量转移的效 应。

[0033] 具体的，本发明还提供了一种用于缺氧性释放的FRET性能的 荧光纳米MSNs药物载体的超组装制备方法，包括：

[0034] 1)TPEMSNs表面首先修饰氨基，此过程每0.1g的TPEMSNs 载体材料加入1mL的3‑氨丙基三乙氧基硅烷。

[0035] 2)TPEMSN‑NH2表面与偶氮苯的偶联，利用EDC和NHS将羧 基偶氮苯的羧基进行活化，再加入TPEMSN‑NH2进行反应。其中 EDC、NHS与羧基偶氮苯的质量比为1：1：1。

[0036] 3)TPEMSN‑Azo进行药物的装载，将罗丹明和甘氨酸在溶液中 和TPEMSN‑Azo载体共混搅拌，其中TPEMSN‑Azo、甘氨酸与罗丹 明B的质量比为2：2：1～2。

[0037] 4)TPEMSN‑azo@Gly/RhB进行封装，将β‑CD溶解于去离子水 溶液加入到混合溶液中通过跟偶氮苯的包合作用进行药物封装得到 最终载药材料，其中材料和β‑CD的质量比
为2：1。

[0038] 利用上述制备方法所得MSNs药物载体其在缺氧条件下实现药 物释放，FRET消失；载药材料在细胞缺氧2小时后有显著保护作用。

[0039] 本发明还提供了一种MSNs药物载体的制备以及利用其在缺氧 条件下进行药物释放和监测的方法，包括：

[0040] 1)通过高倍透射电镜对MSNs的多孔结构进行表征，通过红外 吸收光谱对MSNs的表面修饰进行确认；

[0041] 2)将MSNs药物载体与细胞共孵化，利用厌氧袋，模拟细胞的 缺氧环境，通过FRET颜色变化，观察药物释放情况；

[0042] 3)将MSNs药物载体与细胞共孵化，利用厌氧袋，模拟细胞的 缺氧环境，通过细胞活性与空白组对比，对细胞缺氧释放进行评估。

[0043] 制备以四苯乙烯为功能团的TPEMSNs的具体步骤为：以十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂，利用氢氧化钠调节水溶液 的酸碱度，制备CTAB的水溶液；以正硅酸四乙
酯(TEOS)为硅烷 前驱体，将合成好的连接硅烷偶联剂的四苯乙烯荧光分子作为有机 前驱
体，共同加入到CTAB水溶液，温和的条件下反应4小时；所 得材料利用乙醇溶液进行洗涤，
得到荧光发射在480nm左右的 TPEMSNs。将制备的TPEMSNs加入到20毫升甲苯中，并用3‑氨
基 丙基三乙氧基硅烷将二氧化硅纳米球氨基化，室温下过夜。离心分 离颗粒后，表面活性
剂模板CTAB在甲醇/盐酸溶液中回流24h，收 集产生的TPEMSN‑NH2颗粒，彻底清洗，真空干
燥。

[0044] 制备以具有FRET效应的MSNs药物载体的具体步骤为：将羧 基偶氮苯,1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑ 羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到水/N,N’‑二甲
基甲酰胺(DMF)的 混合溶液中活化，然后将TPEMSN‑NH2加入到上述溶液继续搅拌， 反应结
束后离心得到TPEMSN‑Azo。将TPEMSN‑Azo、甘氨酸、罗 丹明B分散水溶液中在室温下搅拌，
将β‑CD溶解于加入到混合溶液 中通过跟偶氮苯的包合作用进行药物封装得到最终载药材
料。

[0045] 在一些实施例中，所述CTAB、TEOS与水的摩尔比为1：8.75： 10100。

[0046] 在一些实施例中，所述TEOS与四苯乙烯硅烷分子的质量比为 10：1。

[0047] 在一些实施例中，所述EDC、NHS与羧基偶氮苯的质量比为1： 1：1。

[0048] 在一些实施例中，所述MSN‑Azo、甘氨酸与罗丹明B的质量比 为2：2：1～2。

[0049] 本发明提供了一种FRET效应的MSNs药物载体的超组装制备 方法。

[0050] 本发明提供了一种缺氧条件下MSNs药物释放和监测的方法方 法。

[0051] 本发明还提供一种针对细胞缺氧治疗的新途径。

[0052] 实施例1

[0053] 将CTAB(200mg)和氢氧化钠(700μL,2M)溶解于100mL的去 离子水中，加热到80℃搅拌30分钟。然后将1g的TEOS以及0.1g 四苯乙烯有机硅烷前驱体加入到上述CTAB水溶液，
混合溶液在 80℃下搅拌1小时然后冷却至室温，抽滤得TPEMSNs材料。

[0054] 将制备0.2g的TPEMSNs加入到20mL甲苯中，并用2mL的3‑ 氨基丙基三乙氧基硅烷将二氧化硅纳米球氨基化，室温过夜。离心 分离颗粒后，表面活性剂模板CTAB在甲醇/盐酸
(16:1v/v)溶液中回 流24h，收集产生的TPEMSN‑NH2颗粒(图1)，彻底清洗，真空 干燥。

[0055] 上述杂化介孔材料展现出良好的孔道结构以及强烈的荧光发射。

[0056] 实施例2

[0057] 将50mg羧基偶氮苯，50mgEDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳 二亚胺盐酸盐)和50mgNHS(N‑羟基丁二酰亚胺)加入到10mL水 /DMF的混合溶液中活化12小时，然后将
TPEMSN‑NH2(0.2g)加 入到上述溶液继续搅拌12小时，反应结束后离心得到沉淀并且用乙 
醇洗涤两次。干燥得到TPEMSN‑Azo(图2)。

[0058] 实施例3

[0059] 将纯化的0.1gTPEMSN‑azo，0.1g甘氨酸，0.05g罗丹明B分散 于10mL的水溶液中在室温下搅拌24小时。将0.05g的β‑CD溶解于 10ml去离子水，并将此溶液加入到TPEMSN‑azo@
Gly/RhB溶液中。 室温搅拌12小时，离心，用去离子水和乙醇依次洗涤并在真空下干 燥获
得TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD药物载体(图3)。

[0060] 实施例4

[0061] 将纯化的0.1gTPEMSN‑azo，0.1g甘氨酸，0.1g罗丹明B分散 10mL的水溶液中在室温下搅拌12小时。将0.05g的β‑CD溶解于 10ml去离子水，并将此溶液加入到TPEMSN‑azo@
Gly/RhB溶液中。 室温搅拌12小时，离心，用去离子水和乙醇依次洗涤并在真空下干 燥获
得TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD药物载体。

[0062] 实施例5

[0063] 将纯化的0.1gTPEMSN‑azo，0.1g甘氨酸，0.1g罗丹明B分散 10ml的DMF溶液中在室温下搅拌12小时。将0.05g的β‑CD溶解于 10mL去离子水，并将此溶液加入到TPEMSN‑azo@
Gly/RhB溶液中。 室温搅拌12小时，离心，用去离子水和乙醇依次洗涤并在真空下干 燥获
得TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD药物载体。

[0064] 实施例6

[0065] 将TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD水溶液(0μg/mL，100μg/mL、 50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL)加入到DMEM细胞培养液中，共孵 育6h后，对SH‑SY5Y细胞分别进行缺氧缺糖OGD处理0h，
1h，2h 用倒置荧光焦显微镜观察细胞成像情况，结果如图4所示 TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD
利用FRET进行药物释放图(说明：ChannelⅠ是只开了蓝色和绿色通道，ChannelⅡ是只开了
红色通道， Merge是ChannelⅠ和ChannelⅡ的拼接图)。

[0066] 实施例7

[0067] TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD水溶液(100μg/mL、50μg/mL、 25μg/mL、10μg/mL、0μg/mL)加入到DMEM细胞培养液中，将培 养了2h的SH‑SY5Y细胞用CCK‑8法检测细胞活性，从而确定 
TPEMSN‑azo@Gly/RhB@CD对缺氧损伤的细胞的保护及治疗作用。 不同浓度的含材料的培养
液(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、 10μg/mL、0μg/mL)与24孔板中的SH‑SY5Y细胞(5000个/
孔)共 孵育6h后，将CCK‑8溶液与DMEM混合好，配置成含有10％ CCK‑8的溶液。操作时将细
胞的旧培养基移除，用PBS清洗后，加 入含10％CCK‑8的新鲜培养基，锡纸密封好后再培养
3h，将液体 加入到96孔板，用酶标仪检测其在450nm处的紫外吸收光度值。 所得数据用
SPSS软件进行单因素ANOVA分析，比较方法为Tukey HSD多重比较(P＜0.05)。实验结果如图
5所示，TPEMSN‑azo@ Gly/RhB@CD对缺氧损伤2h后的细胞具有保护及治疗作用。

[0068] 以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利 范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流 程变换，或直接或间接运用在其他相关
的技术领域，均同理包括在 本申请的专利保护范围内。