一种聚古罗糖醛酸硫酸酯-阿霉素聚合物胶束及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110675877.0
文献号 : CN113546041B
文献日 : 2022-04-29
发明人 : 李春霞 , 仇晓雷 , 王世欣 , 范子瑞 , 王定福
申请人 : 中国海洋大学 , 青岛海洋科学与技术国家实验室发展中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺的合成:将聚古罗糖醛酸硫酸酯溶解后,加入羧基活化剂活化搅拌,再加入胱胺二盐酸盐溶液反应,透析、浓缩冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺;所述羧基活化剂为EDC/NHS,所述聚古罗糖醛酸硫酸酯与EDC/NHS的摩尔比为0.5‑10:
1;
(2)聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑丙烯酸甲酯的合成:将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺先后溶解于无水甲酰胺溶液、甲醇溶液后,加入丙烯酸甲酯、三乙胺反应,然后利用沉淀剂收集沉淀,复溶、透析、浓缩冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑丙烯酸甲酯;所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺与无水甲酰胺溶液的质量体积比为1:1‑30;所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺与甲醇溶液、丙烯酸甲酯、三乙胺的质量体积比为1: 2‑6: 2‑5: 1‑5;
(3)聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼的合成:将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑丙烯酸甲酯溶于水合肼溶液中反应,透析、浓缩冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼;所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑丙烯酸甲酯与水合肼溶液的质量体积比为1‑30:10;
(4)聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素的合成:将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼溶于甲酰胺溶液中,加入阿霉素和冰醋酸反应,然后利用沉淀剂收集沉淀,复溶、透析、浓缩冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素;所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼与甲酰胺溶液的质量体积比为1‑30: 10;所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼与阿霉素的质量比为1:
0.2‑10;
(5)聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束的合成:将所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素经过透析和过滤后,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述透析的截留分子量不高于
3500Da;透析至电导率小于3μs/cm。
3.权利要求1所述的制备方法制备得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素,其特征在于,所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素具有如下所示的结构示意式:其中,a≤z≤y≤x≤n,n代表10‑100之间的整数,R=SO3Na。
4.权利要求1‑2任一项所述的制备方法制备得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束。
5.权利要求4所述的聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束通过与P‑选择素结合,在肿瘤部位特异性富集,促进肿瘤细胞对所述聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束的摄入,实现阿霉素在肿瘤细胞中的累积。
说明书 :
一种聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束及其制备方法
和应用
技术领域
背景技术
过程中,P‑selectin通过促进循环癌细胞对远处器官中活化的血小板和内皮的粘附而促进
转移过程。在人类的许多侵袭性肿瘤组织中,P‑selectin高度表达,而正常组织P‑selectin
表达很少;另外较低表达P‑selectin的肿瘤在辐射诱导下也可以导致P‑selectin的过量表
达,这些研究结果表明P‑selectin可能成为癌症药物输送和放射导向药物输送的靶标。
等。基于这些独特的生理特征,我们针对肿瘤微环境中低pH及高浓度的谷胱甘肽,设计pH及
GSH双响应的智能型纳米药物递送系统,实现化疗药物在体内的靶向递送和智能释放,促进
化疗药物在临床的进一步应用。
发明内容
酰腙键(pH响应)偶联,得到了具有pH以及氧化还原响应的聚合物胶束,该聚合物胶束具有
靶向性、稳定性,且能够实现药物的控制释放,其制备方法合成路线设计合理、操作简单。
酯‑胱胺;
淀剂收集沉淀,复溶、透析、浓缩冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑丙烯酸甲酯;
肼;
冻干,得到聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素;
积比为1∶2‑6∶2‑5∶1‑5。
入,实现阿霉素在肿瘤细胞中的释放和累积。
酯‑阿霉素,并进一步获得了具有pH以及氧化还原响应的聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合
物胶束。本发明证实聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束可与肿瘤部位高表达的P‑
selectin特异性结合,使聚合物胶束具有靶向性,与抗肿瘤药物连接后可实现的定向给药,
使药物有目标性的载入病灶部位,降低化疗药物阿霉素的毒副作用,提高阿霉素的生物利
用度。另外,聚合物胶束利用二硫键的谷胱甘肽响应性与酰腙键的pH响应性,实现药物的控
制释放。本发明的聚合物胶束的制备方法简单,易操作,制备成本较低,易于产业化生产,对
难渗透的肿瘤组织部位的药物递送提供了新的策略。
附图说明
糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼体系核磁氢谱,D:聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素核磁氢谱。
具体实施方式
前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。在下述实
施例中,如无特殊说明,所使用的实验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从生物或
化学试剂公司购买。
(0.05mol)胱胺二盐酸盐,加入20mL 0.01M PBS(pH=7.4)溶解,缓慢滴加至预活化的聚古
罗糖醛酸硫酸酯溶液中,50℃反应12h;反应体系呈澄清透明状态,反应结束后反应溶液用
3500Da的透析袋于0.5%的氯化钠水溶液透析24h,接着用去离子水透析至电导率小于3μs/
cm,透析结束浓缩冻干,得到胱胺二盐酸盐接枝的白色粉末状固体聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱
胺(PGS‑SS)1.6g。
应24h;反应结束后加入三倍体积丙酮(150mL)沉淀;离心收集沉淀;复溶,透析(MWCO
3500Da)除盐至电导率小于3μs/cm,浓缩冻干,得到白色粉末状固体聚古罗糖醛酸硫酸酯‑
胱胺‑丙烯酸甲酯0.403g。
于3μs/cm,透析液浓缩,冻干,得到白色粉末的聚古罗糖醛酸硫酸酯‑胱胺‑酰肼0.426g。
酰肼溶液中,加入50μL冰醋酸,反应液呈澄清红色,室温搅拌反应72h,反应结束后,反应液
加入三倍体积丙酮沉淀,离心得到红色沉淀,沉淀加去离子水复溶,用去离子水透析(MWCO
3500Da)至电导率小于3μs/cm,透析液浓缩,冻干,得到红色粉末聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉
素0.198g。
析48h,期间定期换水,透析完成后使用0.45μm滤膜过滤,得到聚合物胶束。
D2O(99.96%)中,25℃条件下进行NMR测试。
聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素的核磁 H‑NMR如图2D所示;以重水溶剂峰(4.80ppm)定标,
5.3ppm是糖环上H1的信号峰、4.5‑4.9ppm分别为糖环上H5、H4、H3、H2的质子信号,化学位移
8.25ppm是阿霉素苯环中质子的信号峰;3.5ppm附近是与N原子相连的碳原子上的‑CH2信号
峰,在3.0ppm附近是胱胺中与‑SS‑相连的‑CH2质子峰,1.5ppm处的是DOX中的5’‑CH3质子峰,
通过聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素核磁氢谱可以证明DOX成功接枝到聚古罗糖醛酸硫酸酯
主链上。
表面面向仪器,测量聚合物胶束粒径。
0.178),Zeta电位约为‑41.1mV.
的透射电镜结构。
冲液、0.01M pH 7.4的PBS和10mM GSH(谷胱甘肽)混合液、0.01M pH 5.0的乙酸钠缓冲液、
0.01M pH 5.0的乙酸钠缓冲液和10mM GSH的混合液,然后置于恒温摇床中,振荡速度200r/
min,37℃。在0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72h从释放介质中取5mL,并加入5mL相应的释放
介质保持总体积不变,测量释放介质中阿霉素的浓度,再根据下述公式计算阿霉素的累计
释放率Er:
常生理状态下药物的泄露已保持在最低水平,减少了潜在的化疗药物阿霉素的毒副作用。
pH 5.0模拟的是肿瘤细胞的内涵体以及溶酶体的酸性环境,而10mM GSH模拟的肿瘤细胞细
胞质中较高浓度的GSH环境,如图5所示,在低pH或高浓度GSH存在下,聚古罗糖醛酸硫酸酯‑
阿霉素聚合物胶束的DOX释放均显著增加;在pH 5.0和10mM GSH状态下,聚合物胶束的DOX
释放达到62.5%。上述结果说明,聚合物胶束具有pH以及氧化还原敏感性,可以显著减少
DOX在全身循环过程中药物泄露,而在到达肿瘤部位后pH及高浓度的GSH可以快速触发阿霉
素释放实现更高的抗肿瘤功效。
析物检测结合的亲和力。
0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL。
片,根据折光率变化记录曲线,实验结果拟合,得到亲和力数值。
应浓度的增加,结合信号也逐渐升高,说明结合量增大,且都表现出快结合快解离,对其响
‑8
应值拟合得到结合动力学常数值为1.19×10 。上述结果表明聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素
聚合物胶束可以通过与P‑selectin之间的亲和力在肿瘤部位特异性富集,达到靶向递送化
疗药物的作用。
合物胶束(DOX的最终浓度为1μg/mL)共孵育0.5h,孵育结束后除去培养基,PBS洗三次,每次
10min使用4%多聚甲醛固定细胞30min,PBS冲洗三次,每次10min,加入5%的BSA封闭
30min,吸走封闭液,加入P‑selectin一抗(PBS配制,1∶200稀释)4℃过夜;PBS冲洗三次,每
次10min。加入二抗避光反应30min。反应结束后,吸走二抗,PBS冲洗三次,每次10min。加入
DAPI室温孵育30min,反应结束后PBS冲洗三次,每次10min。加入少量PBS浸润细胞,使用共
聚焦显微镜检测拍照。
接进入到4T1细胞核中,在细胞中集中在细胞核中,与P‑selectin的分布无关。聚古罗糖醛
酸硫酸酯‑阿霉素聚合物在有水的环境中成聚合物胶束,进入细胞的主要方式是通过细胞
内吞作用,在进入细胞后,在细胞的细胞质(GSH)及细胞的内涵体(低pH)部位释放出阿霉
素,然后进入到细胞核中,从图7B可以看出阿霉素不仅在细胞核中分布,在细胞质中也会存
在,同时与P‑selectin之间的亲和力使聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束与P‑
selectin结合,达到持续促进细胞对聚合物胶束的摄入能力,实现阿霉素在4T1细胞中的有
效累积。
清DMEM/F12(1∶1)培养基中形成肿瘤球,37℃孵育3天,细胞成球后分别在培养基中加入游
离DOX、聚合物胶束(DOX的最终浓度为2μg/mL)分别孵育20min,孵育结束后除去培养基,PBS
洗三次,每次10min使用4%多聚甲醛固定细胞30min,PBS冲洗三次,每次10min,加入DAPI室
温孵育30min,反应结束后PBS冲洗三次,每次10min。处理结束后将各组肿瘤球转移至共聚
焦小皿中,加入少量PBS浸润细胞,使用激光共聚焦显微镜检测拍照。
合物胶束与游离阿霉素相比,可以更加有效的进入肿瘤球的内部,在位于肿瘤球内部的肿
瘤细胞也能够观察到阿霉素的摄入,而游离阿霉素主要是被肿瘤球的外部细胞摄取,难以
进入到肿瘤球的内部细胞,说明聚古罗糖醛酸硫酸酯‑阿霉素聚合物胶束可以更好渗透到
肿瘤组织内部,从而使得聚合物胶束对实体瘤可以实现高效、深度的组织渗透,对难渗透的
肿瘤组织部位的药物递送提供了新的策略。
例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替
换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。