一种脊髓融合剂及其用途

摘要

本发明涉及医药领域，具体涉及一种脊髓融合剂及其用途，所述的脊髓融合剂，包括如下组分：聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，纳米石墨烯和纳米纤维素；上述脊髓融合剂中，各组分之间相互协同发挥恢复白质纤维束及灰质短纤维的连续性，如损伤后比格犬磁共振纤维束成像中治疗组术后可见融合的纤维束跨越损伤区，同时恢复运动功能，如在cBBB评分中，治疗组比格犬运动功能恢复情况好于对照组，并具有统计学意义。

权利要求

1.一种脊髓融合剂，其特征在于，由如下组分组成：由如下质量百分数的组分组成：骨髓间充质干细胞0.01‑1%，施万细胞0.01‑1%，胶质细胞源性神经营养因子0.01‑1%，纳米石墨烯0.01‑1%，纳米纤维素0.1‑2%，其余为聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的脊髓融合剂，其特征在于，由如下质量百分数的组分组成：骨髓间充质干细胞0.01%，胶质细胞源性神经营养因子0.01%，纳米石墨烯1%，纳米纤维素2%，施万细胞0.01%、聚乙二醇96.97%。

3.根据权利要求1‑2任一项所述的脊髓融合剂，其特征在于，所述聚乙二醇的相对分子量为400‑1500。

4.根据权利要求3所述的脊髓融合剂，其特征在于，所述聚乙二醇的相对分子量为400、

600、1000和1500。

5.根据权利要求1或2所述的脊髓融合剂，其特征在于，所述的施万细胞和骨髓间充质干细胞来自自体。

6.一种权利要求1‑5任一项所述的脊髓融合剂的制备方法，其特征在于，按照选定质量百分数取聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，纳米石墨烯和纳米纤维素，混合均匀。

7.权利要求1‑5任一项所述的脊髓融合剂或权利要求6制备的脊髓融合剂在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途；

所述的脊髓损伤的病理表现为脊髓灰质离断、脊髓白质离断、脊髓不完整和损伤平面以下的运动及感觉功能缺陷。

说明书

一种脊髓融合剂及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种脊髓融合剂及其用途。

背景技术

[0002] 脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。

[0003] 脊髓损伤的治疗包括药物治疗、手术治疗、护理和康复训练等。药物治疗如采用皮质类固醇、神经节苷脂、东莨菪碱、神经营养药、脱水药减轻脊髓水肿等。手术治疗主要用于拯救生命、稳定脊柱结构和解除原始损伤造成的椎骨破坏移位、椎管内压升高等对脊髓的进一步损害。

发明内容

[0004] 因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种脊髓融合剂及其用途，所述脊髓融合剂能够促使脊髓灰质及白质的连续，并恢复运动功能。

[0005] 为此，本发明提供了如下的技术方案：

[0006] 一种脊髓融合剂，包括如下组分：聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，纳米石墨烯和纳米纤维素。

[0007] 所述的脊髓融合剂，包括如下质量百分数的组分：骨髓间充质干细胞0.01‑1%，施万细胞0.01‑1%，胶质细胞源性神经营养因子0.01‑1%，纳米石墨烯0.01‑1%，纳米纤维素0.1‑2%，其余为聚乙二醇。

[0008] 所述的脊髓融合剂，包括如下质量百分数的组分：骨髓间充质干细胞0.01%，胶质细胞源性神经营养因子0.01%，纳米石墨烯1%，纳米纤维素2%，施万细胞0.01%、聚乙二醇96.97%。

[0009] 所述的脊髓融合剂，所述聚乙二醇的相对分子量为400‑1500。

[0010] 所述的脊髓融合剂，所述聚乙二醇的相对分子量为400、600、1000和1500。

[0011] 所述的脊髓融合剂，所述的施万细胞和骨髓间充质干细胞来自自体。

[0012] 本发明提供了一种所述的脊髓融合剂的制备方法，按照选定质量百分数取聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，纳米石墨烯和纳米纤维素，混合均匀。

[0013] 本发明提供了所述的脊髓融合剂或制备的脊髓融合剂在制备治疗中枢神经系统损伤的药物中的用途。

[0014] 所述的用途，在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。

[0015] 所述的用途，所述的脊髓损伤的病理表现为脊髓灰质离断、脊髓白质离断、脊髓不完整和/或损伤平面以下的运动及感觉功能缺陷。

[0016] 本发明技术方案，具有如下优点：

[0017] 1.本发明提供的一种脊髓融合剂，包括如下组分：聚乙二醇，骨髓间充质干细胞，施万细胞，胶质细胞源性神经营养因子，纳米石墨烯和纳米纤维素；上述脊髓融合剂中，聚乙二醇能够形成相对的疏水结构域分布在断端附近，作为保护屏障，一方面迅速包裹破损的细胞，促进临近磷脂层的再塑起到维持细胞结构的支架功能，防止细胞质流失，为膜修复过程争取时间和物质基础；另一方面能减少细胞膜的线性弹性，增加破裂细胞膜发生对接的几率。此外研究还发现，PEG包裹住细胞，能给细胞营造出一个缺氧的状态，并通过降低细胞生长率以减少能量 消耗，短期内通过氨基酸代谢提高能量供应，远期可以通过细胞自噬保持能量平衡维持细胞稳态，增强细胞对H2O2的抵御作用。PEG还可以引发伸展蛋白（syntaphilin）的表达升高，进一步使正向移动的线粒体停靠在轴突膜内陷形成小泡的区域及断端附近发挥产能作用，促进小泡的生成和融合，以促进脊髓重建；骨髓间充质干细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复；施万细胞促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成；胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）促进神经细胞存活、神经细胞轴突再生以及突触形成，并对神经元有着重要的保护作用；纳米石墨烯，用于术后康复功能治疗中的电刺激有协同作用，以及有助于损伤后的修复；纳米纤维素（CNF)是由葡萄糖单元所组成，适用于生命健康领域，在本发明的含有PEG的脊髓融合剂中起骨架网络作用，改善融合剂体系的流变性，在不提高PEG分子量的前提下，不改变渗透性，改善粘结性能，从而使脊髓融合剂能够更好地在脊髓损伤处发挥作用。综上，通过上述各组分之间相互协同发挥恢复脊髓灰质及白质的连续以及恢复运动功能。

[0018] 2.本发明提供的一种脊髓融合剂，包括如下质量百分数的组分：骨髓间充质干细胞0.01‑1%，施万细胞0.01‑1%，胶质细胞源性神经营养因子0.01‑1%，纳米石墨烯0.01‑1%，纳米纤维素0.1‑2%，其余为聚乙二醇；上述各组分之间相互协同发挥，将离断的白质纤维束及灰质短纤维恢复连续性，如损伤后比格犬磁共振纤维束成像中治疗组术后可见融合的纤维束跨越损伤区，脊髓恢复了连续性，同时恢复运动功能，如在cBBB评分中，治疗组比格犬运动功能恢复情况好于对照组，并具有统计学意义。

附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0020] 图1为本发明实验例1中损伤后比格犬运动功能恢复对比图（n=4）。

具体实施方式

[0021] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

[0022] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

[0023] 下述实施例中的聚乙二醇为无菌液体原液，由 sigma公司提供；骨髓间充质干细胞提取自自体骨髓；施万细胞提取自自体腓肠神经；胶质细胞源性神经营养因子为市售产品（纯度为98%以上），纳米石墨烯为市售产品；纳米纤维素（CNF）由国家造纸化学品工程技术研究中心提供，为液态，纯度为98%以上。

[0024] 实施例1

[0025] 本实施例提供了一种脊髓融合剂，配方如下：

[0026] 骨髓间充质干细胞（细胞总数为106个）0.01g，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）6
0.01g，纳米石墨烯1g，施万细胞（细胞总数为10个）0.01g，纳米纤维素（CNF）2g，聚乙二醇
600为96.97g。

[0027] 本实施例还提供了上述的脊髓融合剂的制备方法，包括：按照上述配方取各原料在无菌的条件下混合均匀。

[0028] 实施例2

[0029] 本实施例提供了一种脊髓融合剂，配方如下：

[0030] 骨髓间充质干细胞（细胞总数为106个）1g，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）1g，6
纳米石墨烯0.01g，施万细胞（细胞总数为10个）1g，纳米纤维素（CNF）0.1g，聚乙二醇400为
96.89g。

[0031] 本实施例还提供了上述的脊髓融合剂的制备方法，包括：按照上述配方取各原料在无菌的条件下混合均匀。

[0032] 实施例3

[0033] 本实施例提供了一种脊髓融合剂，配方如下：

[0034] 骨髓间充质干细胞（细胞总数为106个）0.5g，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）6
0.5g，纳米石墨烯0.5g，施万细胞（细胞总数为10 个）0.5g，纳米纤维素（CNF）1g，聚乙二醇
1000为 97g。

[0035] 本实施例还提供了上述的脊髓融合剂的制备方法，包括：按照上述配方取各原料在无菌的条件下混合均匀。

[0036] 实施例4

[0037] 本实施例提供了一种脊髓融合剂，配方如下：

[0038] 骨髓间充质干细胞（细胞总数为106个）0.8g，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）6
0.7g，纳米石墨烯0.6g，施万细胞（细胞总数为10 个）0.6g，纳米纤维素（CNF）1.5g，聚乙二醇1500为95.8g。

[0039] 本实施例还提供了上述的脊髓融合剂的制备方法，包括：按照上述配方取各原料在无菌的条件下混合均匀。

[0040] 实验例1

[0041] 本实验例考察了本发明的脊髓融合剂在治疗动物脊髓损伤中的作用，包括如下步骤：

[0042] 1.材料和方法

[0043] 1.1动物选择及分组：6月龄雌性比格犬8只，随机分为对照组和治疗组，每组4只。

[0044] 1.2实验药物：治疗组药物：实施例1中的脊髓融合剂，其中骨髓间充质干细胞提取自比格犬自体骨髓，施万细胞提取自比格犬自体腓肠神经；对照组药物：生理盐水。

[0045] 2.模型构建：对照组和治疗组（简称PEG组）的比格犬构建T10水平脊髓完全离断模型，于断端运用脊髓融合剂（治疗组药物2ml）采用局部滴注治疗，对照组用2ml生理盐水治疗；

[0046] 3.术后观察：在术后第3、10、17、21、25、29、32、37、45、53、59天进行cBBB评分（cBBB评分标准参见“Adaptation of the Basso–Beattie–Bresnahanlocomotor rating scale foruse in a clinical model of spinal cord injury in dogs”，Rachel B. Song, D. Michele Basso, Ronaldo C. da Costa, Lesley C. Fisher,Xiaokui Mo, Sarah A. Moore，Journal of Neuroscience Methods 268 (2016) 117–124）；

[0047] 在术后第8周进行核磁检测脊髓连续性及扩散张量成像（DTI）检测纤维连续程度。

[0048] 4、统计学分析

[0049] 5、实验结果：

[0050] 5.1损伤后比格犬运动功能恢复情况：

[0051] 对照组以及治疗组损伤后比格犬运动功能恢复的cBBB评分见下表1：

[0052] 表1 对照组以及治疗组的cBBB评分

[0053]

[0054] 表1 对照组以及治疗组的cBBB评分续表

[0055]

[0056] 由上述表1和图1所示，治疗组比格犬运动功能恢复情况好于对照组，并具有统计学意义（P<0.05)。

[0057] 5.2损伤后比格犬磁共振纤维束成像（DTI）

[0058] 对照组以及治疗组损伤后比格犬核磁T2W1像对比，对照组脊髓连续性并无恢复连接（A1),而PEG的脊髓则恢复了连续性（B1）。磁共振纤维束成像（DTI）对比图，对照组脊髓断端无纤维束连接（A2），而治疗组术后可见融合的纤维束跨越损伤区（B2）。

[0059] 以上研究结果表明，使用本发明的脊髓融合剂能够迅速使离断的白质纤维束及灰质短纤维发生再连接，并能够在短期内恢复损伤平面以下的运动及感觉功能。

[0060] 实验例2

[0061] 本实验例考察了本发明的脊髓融合剂中组分聚乙二醇和纳米纤维素的协同作用。

[0062] 1.实验原料

[0063] 表2实验所用主要原料

[0064] 实验原料 规格/型号 来源CNF 200912D61 杭州市化工研究院
PEG‑600 ‑ sigma公司提供
纯水 ‑ 杭州市化工研究院

[0065] 2.实验器材

[0066] 表3 实验器材

[0067]名称 型号 厂家
高压蒸汽灭菌锅 LDZX‑50KBS 上海申安医疗器械有限公司
超净工作台 SW‑CJ‑2D 苏州净化设备有限公司
均质乳化机 FA25 上海弗鲁克科技有限公司

[0068] 3.实验步骤

[0069] （1）将纳米纤维素、烧杯、试管、蒸馏水、均质机转子、移液枪枪头放入高压灭菌锅进行121℃，30分钟的灭菌，将均质乳化机、移液枪在紫外环境下静置2小时，将PEG放置在50℃水浴锅内，防止凝固；

[0070] （2）按下表配制CNF/PEG溶液体系，CNF和PEG用均质乳化机进行20秒的分散。整个过程在无菌室进行。

[0071] 表4不同浓度CNF的PEG/CNF体系配制表

[0072]实验组 PEG600，ml CNF，g (14%wt)
1# 15 0
2# 15 0.11
3# 15 0.56
4# 15 1.15

[0073] 4.检测

[0074] （1）在光滑不锈钢板上划出两根平行线A与B，间距15cm；

[0075] （2）用塑料滴管吸取不同实验组的液体体系，各滴一滴在水平不锈钢板的A线上，各滴之间间距约3cm，

[0076] （3）提起不锈钢板垂直于地面，并开始计时，每有一滴液体通过B线则计次并记录通过时间。

[0077] 5.实验结果

[0078] 各组液滴经过B线所需要的时间见表5：

[0079] 表5 不同组液滴经过B线所需时间

[0080]实验组 经过B线所需时间
1# 5分33秒
2# 5分39秒
3# 11分01秒
4# 14分11秒

[0081] 由以上可以得出，PEG中添加CNF可以改变体系的粘稠度，并且随着CNF含量的提高，体系的粘稠度增高，即在不提高PEG分子量的前提下，不改变渗透性，采用PEG和 CNF配合即可改善粘结性能，继而可以得出其在脊髓融合剂中可以起到促进脊髓融合剂附着在脊髓损伤处发挥作用。

[0082] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。