根肿菌效应蛋白PBRA_2565及其应用

摘要

本发明属于生物技术及作物栽培和病害防治领域，具体公开了一种根肿菌效应蛋白PBRA_2565，其通过调控榨菜根际微生物可以减轻根肿病的发病率，在防治根肿病方面具有应用价值。

权利要求

1.一种根肿菌效应蛋白PBRA_2565在十字花科作物根肿病防治中的应用，其中所述的根肿菌效应蛋白PBRA_2565的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，是将根肿菌效应蛋白PBRA_2565施用于所述作物的根部。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将根肿菌效应蛋白PBRA_2565与肥料共同施用。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述作物选自芸薹属芥菜。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述作物为茎瘤芥。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过转基因技术将所述根肿菌效应蛋白PBRA_2565编码基因导入十字花科作物中进行表达来实现。

说明书

根肿菌效应蛋白PBRA_2565及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物技术领域及作物栽培和病害防治领域，具体而言，涉及根肿菌效应蛋白及其应用。

背景技术

[0002] 根肿病是十字花科植物最具破坏性的病害，在世界范围内造成了巨大经济损失。该病的病原菌为云薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)，专性寄生，在寄主植物根部细胞内发育形成休眠孢子。根肿菌调节植物代谢过程，刺激植物分泌生长素，导致根部形成肿瘤，致使植株的水分和营养吸收能力下降。发病植株根瘤表皮开裂，土壤中其他病原真菌和细菌进入根部，导致根部腐烂，植株死亡。同时大量的休眠孢子被释放到土壤中(Kageyama&Asano,2009)。根肿菌的休眠孢子可在土壤中存活最长达20年。由于根肿菌属于内寄生，且在土壤中长期休眠，导致该病极难防治，一旦发生，难以消除。随着十字花科作物种苗的调运，根肿病在我国的传播范围日益扩大，主要分布在东北地区、华中地区、西南地区、长江中上游地区等地(李金萍等,2012)，严重威胁我国十字花科蔬菜的生产。

[0003] 茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)为十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种，以其为原料加工而成的榨菜是世界三大腌菜之一。“涪陵榨菜”已经成为我国的特色农业产品，创造了巨大的经济效益(高明泉等,2002)。然而，在茎瘤芥栽培过程中受到根肿病严重危害，每年导致大量的产量和经济损失，成为生产上亟待解决的问题。目前在生产上主要防治的方法有轮作，清除和烧毁病株，施用石灰调节土壤酸碱度，草木灰土盖种和化学防治等。此外，由于该病作用于茎瘤芥根部加之重庆地区土壤粘度较大、石块较多、冬季雨水充足使土壤的翻耕难度大，农药难以发挥作用。同时农药残留等问题也日益突出。抗病品种选育为十字花科植物抗根肿病提供了有效解决办法，如油菜、大白菜等已培育出抗病品种，但由于茎瘤芥属于野生四倍体，在抗病品种选育上难度大，目前尚未选育出抗病品种。因此，解析茎瘤芥根肿病发病机理，从多方面对茎瘤芥根肿病进行综合防治尤为重要。

[0004] 根肿菌生活史分为：休眠孢子休眠和萌发阶段；根毛和表皮细胞侵染阶段；皮层侵染阶段。根肿菌生活史每个阶段会分泌蛋白效应子来促进其侵染寄主植物。丝氨酸蛋白酶Pro1参与第一阶段的休眠孢子萌发(Feng et al,2010)。在根毛和表皮细胞侵染阶段，根肿菌可能分泌蛋白酶和蛋白酶抑制子，如富含半胱氨酸的蛋白酶、甲基转移酶，抑制植物的免疫反应，阻止寄主植物细胞程序性死亡，提高侵染成功率(Siemens et al,2011)。在初生原质团和次生原质团形成阶段，根肿菌分泌一系列蛋白效应子调节植物激素分泌，如细胞分裂素生物合成、生长素稳态、水杨酸和茉莉酸代谢(Malinowski et al,2012)，激发根部细胞生长、延伸和分化，刺激细胞形成肿瘤。在游动孢子成熟阶段，根肿菌表达具有几丁质结合结构域效应子，清除几丁质片段，抑制植物的病原体分子激发的免疫反应。在次生游动孢子和次生原质团形成阶段，根肿菌可能表达控制植物防御反应和干扰植物分生组织活性的效应子(Ludwig‑Müller et al,2015)。然而，在休眠孢子土壤休眠阶段和释放游动孢子侵染阶段，根肿菌如何克服土壤微生物的影响，是否分泌效应子来提高与其他微生物生态竞争能力有待揭示。

[0005] 效应子是植物病原菌在侵染植物过程中产生的有助于其侵染和定殖的小分子物质，对植物生理或免疫进行调控，以阻止植物抗性反应(Jones&Dangl,2006)。大多数植物病原菌效应子属于分泌蛋白，富含半胱氨酸，含有N‑端信号肽,氨基酸残基大约为50～300个,序列特异性高(Stergiopoulos et al,2009；Bolton et al,2010)。此外，植物病原菌产生的次生代谢产物和小分子RNA也具有效应子的功能(Wang et al,2016)。某些植物内生菌、共生菌，甚至腐生菌也能够产生效应子同源的分子物质(Rovenich et al,2014)。效应子能帮助病原菌突破植物自身的屏障，成功侵染植物。

[0006] Snelders等认为植物病原菌效应子可分为三类：植物靶标效应子、多靶标效应子(可作用于植物和微生物)和微生物靶标效应子(Snelders et al,2018)。第一类效应子仅操纵植物的生理过程，调节植物的抗病反应过程。第二类蛋白效应子能够对植物和根际微生物起调控作用，具有广谱活性，调节植物和微生物高度保守的生理过程。第三类蛋白效应子专一作用于微生物某些特定的生理过程，或导致局部的营养缺乏或阻断植物和有益微生物的交流。此外，植物病原菌通过此类效应子招募合作微生物来共同对抗竞争者或协同定殖植物。

[0007] 植物周围生存着大量的微生物，特别是根际微生物数量最为丰富。植物通过根系分泌物吸引有益微生物，在根际形成一道微生物屏障，抵抗病原菌侵染(Koprivova et al，2019；Huanget al,2019；Rudrappa et al,2008；Berendsen et al,2012；Berendsen et al,2018)。在侵染植物之前，首先要面对植物微生物的屏障。植物病原菌利用蛋白效应子抑制某些拮抗微生物，调整植物微生物群落的组成，打破微生物屏障，从而成功侵染植物(Snelders et al,2018)。这种对微生物具有调控活性的效应子称为微生物效应子。微生物效应子在植物病原菌侵染寄生阶段和非寄生阶段(腐生或休眠)起着重要作用。在寄生阶段，病原菌利用微生物效应子调整植物根际微生物组成。腐生阶段病原菌可能利用效应子抑制其他微生物，从而维持自己生存优势(Snelders et al,2018)。因此，微生物效应子在土传病原菌侵染和生存中具有重要意义。

[0008] 土传病原菌生活在土壤中，没有寄主存在的情况下，土传病原菌以腐生或休眠状态生存，它们与环境中的微生物共同竞争同一生态位。土壤中的微生物会抑制植物病原菌。小麦全蚀病的自然消退现象是土壤中假单胞菌数量的上升，抑制禾顶囊壳小麦专化型的繁殖(Berendsen et al,2012)，降低了土壤中病原菌的数量。植物病原菌为了在土壤中占据优势生态位，也会抑制拮抗微生物。小麦叶枯病原菌的Zt6效应子具有双重功能，对小麦具有致病性，诱发小麦细胞程序性死亡。该效应子还具有抗菌活性，能够抑制土壤中细菌、酵母和丝状真菌等。这表明该效应子能够帮助病原菌侵染小麦，还能够参与对其他微生物生态位竞争(Kettles et al,2017)。大丽轮枝菌在侵染寄主植物时分泌VdAve1效应子，抑制植物周围的拮抗菌，如鞘脂菌属、新鞘脂菌属、鞘脂单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属。大丽轮枝菌腐生生活时表达VdAMP2效应子，可抑制土壤中枯草芽孢杆菌和瓦楞假丝酵母的生长，提高其在土壤中的生态适应性，增加其在土壤中的相对生物量(Snelders et al,2020)。由此可见，土传病原菌通过效应子参与土壤微生物生态竞争，以获得优势生态位。根肿菌是典型的土传病害，能够在土壤中长期休眠，可能与土壤中其他微生物存在竞争，这种机制有待揭示。

[0009] 根肿菌属于专性寄生物，生活在植物细胞内，与植物内生菌占有同一生态位，因此存在营养和空间竞争，势必对植物内生微生物造成一定影响。Tian等研究发现根肿菌侵染茎瘤芥后改变内生真菌群落组成，降低内生真菌群落多样性，其中土传病原真菌数量上升，如镰刀菌(Tian et al,2019)。Lebreton等研究发现根肿菌侵染大白菜后导致根际和根内微生物群落变化。根肿菌侵染后，根际的Flavisolibacter和Streptomyces，根内具有抗菌活性的芽孢杆菌数量显著下降(Lebreton et al,2019)。Wang等分析表明，根肿菌侵染茎瘤芥，调节其生理特性，从而改变内生细菌群落结构。健康根系中Rhodanobacter为优势内生细菌，而根瘤优势内生细菌为Pseudomonas。根瘤的可溶性糖、可溶性蛋白、甲醇、过氧化物酶和超氧化物歧化酶显著高于健康根系，表明根肿菌侵染改变了寄主的生理特性，其中可溶性糖、可溶性蛋白、甲醇与根瘤的内生细菌群落密切相关(Wang et al,2020)。根际土壤微生物也能够影响根肿病的发生。Daval等发现根际微生物能够在基因转录水平上调控欧洲油菜和根肿菌互作，影响根肿菌某些致病效应子和油菜抗病相关蛋白的表达，从而减轻根肿病的发生(Daval et al,2020)。

[0010] 根肿菌在土壤中长期存活，且抗逆性强，还能联合其他土传病原菌共同侵染寄主。这表明根肿菌能够改变寄主根际微生物群落，招募某些微生物共同对抗竞争者或协同定殖寄主。鉴于土传病原菌能够分泌效应子调控微生物的组成，根肿菌可能也存在相似的机制。
因此，有必要深入揭示根肿菌通过调节根际微生物群落，联合某些微生物共同侵染寄主的机制，为后续开发根肿菌协同致病菌作为根肿病防控的新型靶标，促进根肿病科学防治具有重要意义。

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发明内容

[0039] 本发明通过根肿菌对茎瘤芥早期侵染过程中筛选发现2个差异表达根肿菌效应子基因(PBRA_2565和PBRA_6677)，进一步研究表明其可以通过调控榨菜根际微生物可以减轻根肿病的发病率，在防治根肿病方面具有应用价值。

[0040] 因此，本发明提供一种根肿菌效应蛋白PBRA_2565，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0041] 进一步提供所述的根肿菌效应蛋白PBRA_2565的编码基因。更具体地，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0042] 本发明提供含有所述的编码基因，优选为表达载体，更具体为细菌、真菌或植物表达载体，更进一步为大肠杆菌、酵母表达载体。

[0043] 还提供含有所述的编码基因或所述重组载体的宿主细胞，更具体为细菌、真菌或植物细胞，更进一步为大肠杆菌、酵母细胞。

[0044] 本发明还提供所述的根肿菌效应蛋白PBRA_2565在十字花科作物根肿病防治中的应用。

[0045] 在一个具体实施方式中，是将根肿菌效应蛋白PBRA_2565施用于所述作物的根部，优选与肥料共同施用。优选地，所述作物选自芸薹属芥菜，更具体为茎瘤芥。

[0046] 在另一个实施方式中，通过转基因技术将所述根肿菌效应蛋白PBRA_2565编码基因导入十字花科作物中表达来实现，更优选地，靶向所述作物的根部组成型表达或受病原菌侵染时诱导表达。

附图说明

[0047] 图1根肿菌侵染茎瘤芥根系形态观察。

[0048] 其中，A：根肿菌休眠孢子；B：根肿菌孢子吸附在茎瘤芥根系表面；C：根肿菌初级游动孢子；D：根肿菌初级游动孢子侵染茎瘤芥根毛；E：根肿菌初级游动孢子进入茎瘤芥根毛内部(星号所示部位)；F：根肿菌在茎瘤芥根毛中产生次级孢子囊(星号所示部位)；G：根毛尖端破裂，次级孢子囊被释放(星号所示部位)；H：分裂中的次级孢子囊；I：分裂产生的小的次级孢子囊(星号所示部位)；J：次级孢子囊释放出的次级孢子(星号所示部位)；K：两个次级孢子结合形成的可快速游动的双核原质团(星号所示部位)；L：次级原质团侵染茎瘤芥根毛幷使根毛发生形变(星号所示部位)；M：次级原质团在茎瘤芥皮层细胞大量繁殖；N：死亡茎瘤芥根细胞中充满大量根肿菌休眠孢子；O：根肿菌侵染茎瘤芥后产生肿根(最右侧为对照未肿大根系，左侧为接种后的肿胀根系)。

[0049] 图2差异表达基因数量分析图。

[0050] 图3PBRA_2565和PBRA_6677蛋白结构域分析。

[0051] 图4PBRA_2565基因融合pGEX‑4T‑1过表达载体构建。

[0052] 其中，A:PBRA_2565扩增产物凝胶电泳条带，M为Marker D2000；1为PBRA_2565扩增条带；B：PBRA_2565连接目的载体pGEX4T‑1菌落PCR结果检测，M为Marker D2000；1‑10为10个单菌落PCR产物扩增条带；N为阴性对照，P为阳性对照；C：PBRA_2565‑pGEX4T‑1构建成功的载体酶切检测，M为Marker D2000；1为PBRA_2565‑pGEX4T‑1双酶切后条带，其中a为酶切下来的pGEX4T‑1载体，b为酶切下来的PBRA_2565片段；D：pGEX4T‑1载体图谱。

[0053] 图5根肿菌PBRA_6677基因融合pGEX‑4T‑1过表达载体构建。

[0054] 其中，A:PBRA_6677扩增产物凝胶电泳条带，M为Marker D2000；1为PBRA_6677扩增条带；B：PBRA_6677连接目的载体pGEX4T‑1菌落PCR结果检测，M为Marker D2000；1‑9为9个单菌落PCR产物扩增条带；N为阴性对照，P为阳性对照；C：PBRA_6677‑pGEX4T‑1构建成功的载体酶切检测，M为Marker D2000；1为PBRA_6677‑pGEX4T‑1双酶切后条带，其中a为酶切下来的pGEX4T‑1载体，b为酶切下来的PBRA_6677片段；D：pGEX4T‑1载体图谱。

[0055] 图6PBRA_2565和PBRA_6677蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[0056] 图7PBRA_2565和PBRA_6677粗蛋白抑菌效果分析。

[0057] 其中，A:PBRA_2565粗蛋白处理；B：PBRA_6677粗蛋白处理；CK：空载体粗蛋白处理；T2：Bacillus megeterium；T3：Pseudomonas sp.；T4：Fictibacillus barbarucys；T5：
Pseudomonas aeruginosa；T8：Fictibacillus enciensis；T12：Massukua sp.；C1：
Acinetobacter pittii；C2：Bacillus aryabhattai；C3：Enterobacter hormaechei；C7：
Enterobacter sp.；C9：Achromobacter animicus；C10：Bacillus sp.；C17：Lelliottia leotgai；C19 Pseudomonas baetical。

[0058] 图8PBRA_2565和PBRA_6677与茎瘤芥根系土壤微生物互做分析。

[0059] 图9根肿菌接菌液和效应蛋白接种后茎瘤芥发病情况。其中，A:接种根肿菌；B:接种根肿菌+PBRA_2565粗蛋白；C:根肿菌+PBRA_6677粗蛋白)。

具体实施方式

[0060] 下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不构成对本发明的限制。

[0061] 1、根肿菌对茎瘤芥早期侵染过程中发现2个差异表达根肿菌效应子基因[0062] 利用水培养体系，观察了根肿菌侵染茎瘤芥根系的生理过程。具体过程如下：

[0063] 用无菌水配制0.8％(m/v)的琼脂培养基质，将榨菜品种永安小叶的种子用50％乙醇消毒30秒，用无菌水冲洗5次后均匀撒播在含有0.8％琼脂的培养基质中，将播种后的培养皿放置于光照培养室中进行萌发培养，培养温度为22℃，光照强度6000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。榨菜种子在培养皿中萌发生长2天可生长成为含2片子叶的幼苗，子叶完全伸展的幼苗用于根肿菌接种实验。

[0064] 利用水培养体系，观察了根肿菌侵染榨菜根系的生理过程。首先从榨菜肿根中提取出根肿菌的休眠孢子并进行显微观察鉴定(图1中A)，然后将提取出的根肿菌对培养皿中萌发3天的榨菜幼苗根系进行水培养接种，在不同时间点观察根肿菌对榨菜根系的侵染情况。观察发现接种后12小时即可观察到根肿菌孢子吸附在榨菜根系表面(图1中B)；48小时后可观察到比根肿菌休眠孢子要大的萌发后释放的游动孢子(图1中C)，释放的初级游动孢子吸附在根毛表面，开始对榨菜根毛进行侵染(图1中D)；78小时后可观察到根肿菌的初级游动孢子进入根毛细胞内部(图1中E)；8天后可观察到后续多个侵染过程，依次为在根毛内部产生圆球状的次级孢子囊(图1中F)，次级孢子囊形成后，榨菜根毛细胞破裂将孢子囊释放到外界环境(图1中G)，被释放的次级孢子囊继续发育生长，体积变大的同时内部产生更多的次级孢子，生长的孢子囊可进行分裂产生许多小的次级孢子囊(图1中H和I)；小的次级孢子囊成熟后将次级孢子释放到环境中(图1中J)；释放到环境中的次级孢子两两质配融合成双核的原质团，双核的原质团呈梭型，在水中可快速游动(图1中K)；双核原质团开始对榨菜根毛进行侵染，该过程使大量被侵染的榨菜根毛发生弯曲形变，将双核原质团包裹起来，进而原质团进入榨菜根毛内部(图1中L)；接种14天后，可观察到进入根毛内部的菌体到达榨菜根系皮层部位，并在皮层中大量繁殖(图1中M)；如在侵染过程中寄主植物的根系死亡，根肿菌则在细胞内产生大量的休眠孢子，进入休眠阶段(图1中N)；根肿菌侵染榨菜28天后，即可观察到榨菜根系发生肿大，产生大量肿根，尤其是接近下胚轴部分的植物根系，肿根尤为明显(图1中O)。

[0065] 观察结果如图1所示，观察发现接种根肿菌后3天到5天为侵染早期根肿菌与茎瘤芥根毛相互识别的阶段，基于形态学观察结果对接种根肿菌3天的茎瘤芥根系取样进行转录组测序(以仅加等量水处理3天的茎瘤芥根系为对照)，通过转录组测序检测根肿菌对茎瘤芥早期侵染过程中基因的表达变化情况。

[0066] 通过转录组测序共检测到9210个基因，其中对照组(未侵染茎瘤芥的根肿菌)共有9176个基因表达，处理组(侵染茎瘤芥的根肿菌)共有8572个基因表达，对照组和处理组有
8538个基因共同表达。共检测到差异表达基因247个，占总差异表达基因数的2.68％，其中上调表达基因数为42个，下调表达基因数为205个(见图2)。转录组测序结果显示，相比于对照组，侵染茎瘤芥的根肿菌中有两个效应因子基因显著下调表达，分别为PBRA_2565和PBRA_6677。转录组测得PBRA2565的表达量：处理组FPKM值为4.75，对照组FPKM值为1.38，log2(处理组/对照组)为‑1.70；转录组测得PBRA6677的表达量：处理组FPKM值为4.32，对照组FPKM值为1.26，log2(处理组/对照组)为‑1.88。

[0067] 2、根肿菌效应子PBRA_2565和PBRA_6677基因分析

[0068] PBRA_2565的CDS序列全长为537bp，编码178个氨基酸，其中信号肽长度为51，在氨基端编码17个氨基酸；PBRA_6677的CDS序列全长为687bp，编码228个氨基酸，其中信号肽长度为54，在氨基端编码18个氨基酸。

[0069] 其中，PBRA_2565的CDS序列如下：

[0070] ATGGCGTACTGGTTGGTCATCACGCTGGCGGTGCTCAGCGGCGCGGACGCGTTCCCGATCCCGTTTAGCAGTTGTGCAGGGAACCAGGCTGATGACGCGTCCCGCCTTGTGATCAAATCCATTGACATCTCGCCGTATCCCGTGAAGCCTGGTGGGTCGGCGCTGGCCAACATCGGCCTGTCCATCAAGAAGAAGGTGGACCATGGCAGCCACTACGACCTGAAGATCTACATGGACAAGTACGAGCTCGTACACGAAAGCGGCGACCTGTGCGCGCTCAGCGCCACCTTCACGTGCCCGAAGGACGCCGATGACAGCGCCGTTCTTCAGTATAAGTTCCAGTTTCCCAGAGTCCCGTTCGCCGGCAGCCTTCGCCTTCATCTAATGATTTGGAACCAGAACAACCAGGAGCTCTGCTGTGTCGACTTCTCGATCGACGTGAGGCTGGTCGACGGCAAGACCGTGATGGTGGAGAAGGACTACCTGATGGAAGAGGTGCAGAAGCTTATCGACGAGTACAGCGGCGCTGATATGTAG。

[0071] PBRA_002565的氨基酸序列如下：

[0072] MAYWLVITLAVLSGADAFPIPFSSCAGNQADDASRLVIKSIDISPYPVKPGGSALANIGLSIKKKVDHGSHYDLKIYMDKYELVHESGDLCALSATFTCPKDADDSAVLQYKFQFPRVPFAGSLRLHLMIWNQNNQELCCVDFSIDVRLVDGKTVMVEKDYLMEEVQKLIDEYSGADM。

[0073] PBRA_6677的CDS序列如下：

[0074] ATGCTGGGCGCCACGACATTGCTGATCGCCTCCCTGATTGCTGCCTGCAACGGGCAGTCATGTCGAGGTCCAGGATTCATCATCACTGGATGTAACCCGGACTTGCCCATCACCGATCGCTGCGGTGTCGCCGCCGATGGAGCACCCTGTCCATTTGGAACCTGCTGCTCCGAATTCGGGTTTTGCGGGCGCAGCGCTGTTCACTGTGGTGGCGAGCAATACATTCCACAATGGGGTCCACCGCGAGACGACGGGCGGTGCGGAGAGGCATTCAGCTACGCTGGGTGCGATGACGATTTTATCTGCATCGCCACCTGGTGCGTCAGTTCCGACTCTGTCCCCGGTGCGTCACCCGTGAATCCGACGTCGGCAACGCCGACCGGAACGTCTGACACCACCAACCCACAACCTGTTCCTTCCGGCTCGGCTGAGGTCGACCCCAGTTCATCTGAGCATCCCAGATCAGGGAACAATGGTGTCACTAGGGAAGCGTCCAGCTCGGGAACAGGAAGCAGCACCAGCAGAGGAGGGCCTGCTCAACTAGCCGCGTTTGAAAGAGGTCAGGATATCACCGTCCCATATTCGACGGGTACCGACCAATCTTCAACTGTGCGTCGACACATCGCTCCATCCTGGACCTGGGCGCTTGTCACTACAGGCGCGTTCATCGTCATGGCCATGCAATAA。

[0075] PBRA_006677的氨基酸序列如下：

[0076] MLGATTLLIASLIAACNGQSCRGPGFIITGCNPDLPITDRCGVAADGAPCPFGTCCSEFGFCGRSAVHCGGEQYIPQWGPPRDDGRCGEAFSYAGCDDDFICIATWCVSSDSVPGASPVNPTSATPTGTSDTTNPQPVPSGSAEVDPSSSEHPRSGNNGVTREASSSGTGSSTSRGGPAQLAAFERGQDITVPYSTGTDQSSTVRRHIAPSWTWALVTTGAFIVMAMQ。

[0077] 使用在线分析软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白结构域(见图3)，PBRA_2565含有ML Super familily，ML(MD‑2相关脂质识别)是在MD‑1、MD‑2、GM2A、Npc2以及多种植物、动物和真菌蛋白中发现的一个新结构域，ML蛋白参与LPS(革兰氏阴性细菌的脂多糖)信号转导和脂质代谢，PBRA_2565效应子不在目前已知的典型效应子范围，属于其他类型效应子；PBRA_6677含有几丁质结合域，效应蛋白AVR4含有几丁质结合域，能避免叶霉菌受番茄产生的几丁质酶的降解(van Esse et al.，2007)，推测其属于AVR4类无毒效应蛋白。

[0078] 3、PBRA_2565和PBRA_6677效应子的原核表达与粗蛋白提取

[0079] 以带有GST标签的载体pGEX‑4T‑1为目的载体，分别与PBRA_2565和PBRA_6677的CDS序列整合在一起，构建这两个蛋白的融合表达载体(如图4和图5所示)。

[0080] 将构建成功的载体转入大肠杆菌BL21菌株中，将阳性克隆在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中活化后继续液体培养，利用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，取少量菌体进行聚丙烯凝胶电泳检测蛋白表达情况，电泳检测结果显示，PBRA_2565在35‑45kD之间具有显著诱导条带，PBRA_6677在35‑45kD之间也有小量诱导条带(图6)。

[0081] 检测到蛋白表达后，重新接种诱导表达含有PBRA_2565、PBRA_6677以及空载体的菌株，离心收集菌体后，按20ml PBS/g重悬菌体，超声破碎功率：270W，超声5s，间歇5s，全程20min，整个超声过程中样品置于冰浴中，超声后，12000g、4℃离心15min，收集上清备用。

[0082] 4、PBRA_2565和PBRA_6677效应子对茎瘤芥根系土壤微生物调控作用分析[0083] 采集茎瘤芥不同发病程度的土壤样品，混匀后分别取不同浓度梯度的土壤悬液100μL涂布在NB平板上，每种浓度梯度3次重复。置于37℃恒温培养箱中培养24‑48h，将长好菌落的依据不同形态(颜色，大小，透明度等)进行划线培养挑取单菌落纯化。将多次纯化的单菌落进行收集，采用27F和1428R引物进行16S片段扩增，测序后用NCBI数据库Blast查询和比对核苷酸序列，对菌种进行分子鉴定。测序后通过Blast查询和比对去掉相同的菌株，共分离到14个属的菌株，主要为芽孢杆菌、假单胞杆菌、假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌等属细菌(表1)。

[0084] 表1茎瘤芥根际分离可培养细菌鉴定

[0085]

[0086] 将茎瘤芥根际分离到的细菌涂布于NB平板上，取出‑80℃条件下保存的超声破碎后的PBRA_2565、PBRA_6677、空载体的粗蛋白(OD600＝0.3)，将小块滤纸剪成圆形，灭菌后浸泡在粗蛋白中，然后分别将含有PBRA_2565和PBRA_6677的粗蛋白(空载体破碎的粗蛋白为对照)的滤纸接种在涂布细菌的培养基上，4天后观察是否有抑菌圈形成。

[0087] 结果表明(图7)，PBRA_2565对编号为T8和T12的菌株具有抑制作用，两个菌株分别为(Fictibacillus enciensis)和Massukua sp.；PBRA_6677的粗蛋白对编号为T2和C19的菌株具有抑制作用，两个菌株分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megeterium)和细菌假单胞菌(Pseudomonas baetical)。

[0088] 将在茎瘤芥根际分离到的细菌菌株进行液体培养活化后，每个菌株按照1:1000的比例接种到液体NB培养基中，每个培养基中接种等量的PBRA_2565和PBRA_6677的粗蛋白(空载体破碎的粗蛋白为对照)，于37℃条件下，以200rpm的转速培养15小时后测定菌落OD值，分析PBRA_2565和PBRA_6677的粗蛋白对茎瘤芥根际微生物生长是否有促进作用。

[0089] 结果表明(图8)，PBRA_2565对T8(Fictibacillus enciensis)的菌株有显著抑制作用，对C2(阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai)有极显著促生作用；PBRA_6677对T2(巨大芽孢杆菌Bacillus  megeterium)有显著的抑制作用，对T4(Fictibacillus barbarucys)、T5(铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、C1(皮特不动杆菌Acinetobacter pittii)、C2(阿氏芽胞杆菌Bacillus aryabhattai)、C10(芽孢杆菌属Bacillus sp.)有显著的促生作用。

[0090] 本实验说明这两个效应子可以抑制和促进榨菜根际微生物生长，可能通过调控(抑制或促进生长)榨菜根际微生物来调控根肿病的侵染和发病。

[0091] 5、PBRA_2565和PBRA_6677效应子与根肿菌侵染茎瘤芥相关性分析

[0092] 提取根肿菌休眠孢子，制备成终浓度为OD600＝0.8孢子液，待用，采用石英砂作为培养基质，在石英砂中待幼苗生长至两片子叶大小时，分别接种根肿菌1mL和根肿菌1mL+1ml OD600＝0.3的效应子粗蛋白。30天后，每个处理9个样观察统计发病率和病情指数(表2、图9)，根肿菌接的茎瘤芥发病程度最为严重，发病率高达78％，病情指数为58.33；接种根肿菌和PBRA_2566效应子粗蛋白的茎瘤芥发病率为33％，病情指数22.22；接种根肿菌和PBRA_
6677效应子粗蛋白的茎瘤芥发病率为22％，病情指数为19.44。

[0093] 表2茎瘤芥发病情况统计分析

[0094]

[0095] 这表明这两个效应子蛋白可以减轻根肿病的发病率的病情指数(即危害程度)，其作用方式可能是通过调控榨菜根际微生物实现的。