一种利用双氧水提取黑木耳多糖的方法

摘要

本发明公开了一种利用双氧水提取黑木耳多糖的方法，所述黑木耳多糖的提取方法为：以黑木耳粉为原料，以过氧化氢水溶液为提取剂，在80‑100℃提取80‑120min，提取液分离纯化，获得黑木耳多糖。本发明方法制备的黑木耳多糖产品纯度高，多糖含量可高达65％以上，且自由基清除率、还原力等抗氧化活性高；线虫体内脂肪的积累减少44.62％。

权利要求

1.一种利用双氧水破壁提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述黑木耳多糖的提取方法为：以黑木耳粉为原料，以过氧化氢水溶液和维生素c为提取剂，在pH6.8‑7.2、80‑100℃条件下提取80‑120 min，提取液分离纯化，获得黑木耳多糖；所述过氧化氢水溶液中过氧化氢质量浓度为1.2‑1.6%，所述过氧化氢水溶液体积用量以黑木耳粉质量计为80‑120 mL/g；

所述维生素c加入量与过氧化氢水溶液中过氧化氢质量比为1：2‑6。

2.如权利要求1所述的提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述黑木耳粉是将黑木耳子实体置于50℃烘箱烘干至质量含水量低于12%，粉碎，过150 200目筛，即为黑木耳粉。

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3.如权利要求1所述的提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述黑木耳粉提取前先溶胀再提取，所述溶胀是指：将黑木耳粉加入去离子水中，25℃溶胀12 h，得到预处理后的黑木耳浆。

4.如权利要求1所述的提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述提取液分离纯化的方法为：将提取液8000 rpm离心20 min，取上清液，加入4倍体积的95%乙醇，4 ℃静置12 h后，

3000 rpm离心10 min，取沉淀，溶解于去离子水中后，采用sevag法脱蛋白至280 nm没有吸收峰，浓缩、冷冻干燥，得到黑木耳多糖。

5.如权利要求4所述的提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述sevag法脱蛋白按如下步骤进行：将沉淀溶于去离子水后置于分液漏斗中，加入Sevag试剂，上下剧烈振荡2 min后，静置分层，取上层，在280 nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280 nm没有吸收峰，将上层浓缩至原体积的25‑35%，冷冻干燥，获得黑木耳多糖；所述Sevag试剂是体积比4:1的氯仿和正丁醇混合液；所述Sevag试剂与去离子水体积比为1：3‑4。

6.如权利要求4所述的提取黑木耳多糖的方法，其特征在于所述冷冻干燥为下列方法之一：（1）初始温度为‑30℃，当真空度为80 Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1 h，然后温度每升高10℃保持1 h，一直升温至20℃，保持24 h至干燥；（2）初始温度为‑30℃，真空度为

80 Pa干燥。

7.一种根据权利要求1‑6任意一项所述的方法制备得到的黑木耳多糖。

8.一种权利要求7所述黑木耳多糖在制备降体脂药物中的应用。

说明书

一种利用双氧水提取黑木耳多糖的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用双氧水破壁提取黑木耳多糖的方法。(二)背景技术

[0002] 黑木耳Auricularia auricula(L.exHook.)Underwood，属于担子菌纲，木耳目、木耳科、木耳属，是世界上人工栽培的第一个菌菇品种，公元600年前后起源于中国，至今已有1400多年历史。黑木耳质地柔软，味道鲜美，营养丰富。中国食用菌协会对全国27个省、自治区、直辖市的统计调查显示，2016年我国食用菌总产量为3596.66万吨，其中黑木耳跃居第二大种类，产量679.54万吨，占国内菌菇总产量18.89％，成为菌菇产业发展的热点。

[0003] 黑木耳作为担子菌纲菌菇，其细胞壁组成复杂且质地坚韧。细胞壁破碎是从天然资源中提取有价值代谢产物(如多糖等)的重要过程，一直是制约多糖等代谢产物生产的瓶颈，极具挑战性。担子菌纲的真菌，其异常坚韧的细胞壁结构成为其强保护层与屏障，能否有效破壁，将直接影响壁内多糖的产量与结构特征。而多糖的生物活性与其初级结构和空间构象密切相关，一旦多糖的结构特征被破坏，其生物活性就会显著下降，甚至丧失。因而，真菌破壁迫切需要的预处理手段为：破壁过程不破坏多糖“活性片段”的完整性、产量高，不引入杂质、无污染、对设备要求低且能耗少等。

[0004] 真菌细胞壁不同于植物细胞壁，其细胞壁破碎难度远大于植物细胞壁，适用于植物细胞壁的破碎方法用于真菌细胞壁的破碎往往效果不佳。破壁后壁内产品的质量与生物活性直接受破壁方式与工艺参数的影响，合理有效地破壁手段与破壁条件不仅能增加产品的产量，而且能达到增强产品生物活性的效果。真菌细胞壁是排列在细胞质膜表面的多孔高分子复合物，含有抗应力的几丁质微纤维、线性葡萄糖聚合物或葡聚糖以及多种细胞壁蛋白(图1)。

[0005] 图1的化学成分示意图中，几丁质由β‑1→4‑连接的氨基葡萄糖与乙酰葡萄糖胺构成，相邻的几丁质糖链通过氢键连接成呈反平行排列、长度超过1μm的微纤丝。几丁质微纤丝具有巨大的拉伸强度，当几丁质被破坏时，细胞将失去渗透稳定性并可能断裂。壳聚糖(也称β‑1→4‑氨基葡萄糖)，是一种脱乙酰糖的聚合物，许多真菌除含有几丁质外，也能产生脱乙酰壳聚糖。β‑1→3‑葡聚糖通常是细胞壁中含量最丰富的聚合物，其β‑1→3‑糖苷键能使聚合物发生扭曲，3条葡聚糖链形成三重螺旋，通过氢键连接在一起。细胞壁结构中的β‑1→3‑葡聚糖与β‑1→6‑葡聚糖连接，形成高度支化的弹性聚合物网络。细胞壁中的结构蛋白是连接有N‑和O‑键碳水化合物的糖蛋白，包括富含甘露糖的甘露糖蛋白及含有甘露糖与半乳糖残基的其他糖蛋白。细胞壁中的糖蛋白通过糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定与质膜相连，并与几丁质微纤丝和葡聚糖交联。透射电子显微镜下，真菌细胞壁呈现出离散的层，但这并不意味着细胞壁具有胶合板状的结构，将不同种类的分子分开。真菌细胞壁更像是一种纤维增强聚合物(如玻璃纤维)，每层内有多个交织的组件。

[0006] 针对真菌细胞壁结构的复杂性与坚韧性，采用的破壁手段通常有机械法、物理法、化学法、生物酶法以及复合法破壁等。机械法破壁手段有超声辅助、高压匀质、微波辅助、高速珠磨、蒸汽破法等，它们的共性是通过外界力量如声波、压力、电磁波、速度等进行有效破壁。不同的机械手段各有优势与不足，但大多具有对设备要求高、能耗大、破壁不充分、局部高温等缺点。物理法破碎手段有温差法、压力差法等，前者(如反复冻融)简单易行、较为常用，但需足够大(通常大于80℃)温差，仅适于实验室操作。化学法是借助洗涤剂、渗透剂或者有机溶剂，使细胞破碎或细胞壁变脆弱，包括酸热或碱法破壁、酸碱结合破壁、化学试剂(如酒精、二甲基亚砜、甲醇等)破壁。其操作便利，对设备要求不高，但易引入杂质且存在安全性及环境污染等问题。生物酶法是利用不同种类酶的破壁位点差异，攻击真菌细胞壁的壁层，同时缓冲液渗透压的变化使细胞膜破裂，释放出胞内质。由于真菌细胞壁结构复杂，单一生物酶很难有效破壁，多种酶依次攻击细胞壁可使目标物产量增加。复合法破壁是上述4类方法中的两种或两种以上方法的结合，虽然可提高产量，但增加了操作工序与生产成本。

[0007] 过氧化氢是一种清洁绿色高效的氧化剂与典型的环保剂，其价格低廉、无污染、对设备要求低且能源消耗少；其易分解成水与氧气，在整个单元操作过程中不会留下任何残留物。在最新版“食品安全国家标准食品添加剂使用标准”(GB2760‑2014)中，增加其作为加工助剂使用于食品工业中。

[0008] 过氧化氢在木质素脱除、膳食纤维改性、天然大分子多糖降解等方面的研究不断受到关注，尤其是多糖降解方面的文献逐年增加，发现过氧化氢能使降解后多糖的生物活性增强。但有关过氧化氢在多糖降解或膳食纤维改性方面的研究均采用碱性条件，并且用于真菌细胞壁破壁预处理方面的研究还鲜有报道。

[0009] 黑木耳是一种比较独特的食药用菌，其多糖具有极高的药用价值。针对黑木耳极其坚韧与多层次的细胞壁结构特征，本发明根据担子菌纲黑木耳细胞壁的结构特点，即，具有复杂的空间网络结构，细胞壁层厚且异常坚韧，很难被常规的物理或化学条件破坏等，以多糖得率为响应值，辅以BBD的设计方法优化提取条件，SEM扫描电镜观察低浓度双氧水作用于细胞壁的表面特征，以获得高得率、强生物活性(DPPH、ABTS自由基清除率等抗氧化活性与降体脂作用)的黑木耳多糖，可实现黑木耳加工的新利用。(三)发明内容

[0010] 本发明目的是提供一种利用双氧水破壁提取黑木耳多糖的方法，以黑木耳为原料，以过氧化氢水溶液为提取剂，以多糖得率为响应值，通过BBD的设计方法与SEM扫描电镜，获得高得率、强生物活性(DPPH、ABTS自由基清除率等抗氧化活性与降体脂作用)的黑木耳多糖。

[0011] 本发明采用的技术方案是：

[0012] 本发明提供一种利用双氧水破壁提取的黑木耳多糖，所述黑木耳多糖的提取方法为：以黑木耳粉为原料，以过氧化氢水溶液为提取剂，在pH6.8‑7.2、80‑100℃条件下提取80‑120min，提取液分离纯化，获得黑木耳多糖。优选提取条件为pH7.0，90℃提取120min。

[0013] 进一步，所述过氧化氢以质量浓度30％溶液形式加入，所述过氧化氢水溶液中过氧化氢质量浓度为0.2‑2.0％，优选1.2‑1.6％，所述过氧化氢水溶液体积用量以黑木耳粉质量计为40‑120mL/g，优选80‑120mL/g。

[0014] 进一步，所述提取剂中还加入维生素c，所述维生素c加入量与过氧化氢水溶液中过氧化氢质量比为1：1‑10，优选1：2‑6。

[0015] 进一步，所述黑木耳粉是将黑木耳子实体置于50℃烘箱烘干至质量含水量低于12％(优选质量含水量为11.2％)，粉碎，过150～200目筛，即为黑木耳粉。

[0016] 进一步，所述黑木耳粉提取前先溶胀再提取，所述溶胀是指：将黑木耳粉加入去离子水中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆；所述去离子水与过氧化氢水溶液总体积作为提取剂。

[0017] 进一步，所述黑木耳多糖提取方法为：将黑木耳粉加入去离子水中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆；再将黑木耳浆中加入过氧化氢水溶液和维生素c中提取。

[0018] 进一步，所述提取液分离纯化的方法为：将提取液8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，即将沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至原体积的25‑35％，冷冻干燥，获得黑木耳多糖。所述Sevag试剂与去离子水体积比为1：3‑4。

[0019] 进一步，所述冷冻干燥为下列方法之一：(1)初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥；(2)初始温度为‑30℃，真空度为80Pa干燥。

[0020] 本发明还提供一种所述黑木耳多糖在制备降体脂药物中的应用。

[0021] 与现有方法相比，本发明的有益效果主要体现在：

[0022] 1.以多糖得率为指标进行响应面优化，结合多糖的分子量分布范围，可制得产品纯度高，多糖含量可高达65％以上，且自由基清除率、还原力等抗氧化活性高；

[0023] 2.针对担子菌纲黑木耳胶质菌细胞壁的壁层厚且呈多层网状，质地坚韧的结构特点，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁，常规提取方法多糖得率低、分子量分布宽，粘度高不利于实际应用等问题，利用双氧水高效破壁且独具的脱色与降低多糖分子量的优势，结合BBD的设计方法与SEM扫描电镜的细胞壁破壁形态，充分保证细胞壁的可控破碎效果，形成疏松多孔的状态，不仅有利于壁内多糖的充分溶出，还有利于制备分子量分布窄，破壁过程不破坏多糖“活性片段”的完整性、产量高的活性多糖，同时具有整个操作过程不引入杂质、无污染、对设备要求低且能耗少等诸多优势。

[0024] 3.双氧水破壁黑木耳制备的多糖产品无异味、感官性状好，无需脱色等后处理。操作在中性条件下进行，没有酸碱等化学试剂的引入。操作中所使用浓度低，操作结束后易分解成水与氧气，在整个单元操作过程中不会留下任何残留物。操作中加入维生素C有助于黑+木耳多糖的有效溶出及生物活性的增强，黑木耳多糖的提取得率与ABTS 清除率与不加维+
生素C相比，得率由69.77％提高到73.90％，ABTS 清除率由92.81％提高到97.28％。双氧水+
加维生素C破壁的处理方式可使黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性(ABTS清除率、DPPH自由基清除率)与秀丽隐杆线虫的降脂作用显著提高。与阴性对照组相比，双氧水加维生素C处理提取的黑木耳多糖可使线虫体内脂肪显著下降(p<0.05)，线虫体内脂肪的积累减少
44.62％；与正常组线虫比较无差异(p>0.05)。黑木耳多糖的提取得率与体外抗氧化能力比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了26.11倍、1.76倍、2.49倍、2.67倍，线虫荧光强度(反映体脂的积累程度)比传统的采用热水提取的黑木耳多糖降低了1.28倍；比传统的采用机械粉碎的粗粉提取的黑木耳多糖分别提高了1.32倍、1.13倍、2.49倍、1.08倍，线虫荧光强度(反映体脂的积累程度)比传统的采用热水提取的黑木耳多糖降低了1.04倍。跟生物酶法及现代新机械破壁法比较，黑木耳多糖的提取得率比纤维素酶法提高了3.47倍，比超低温微波协同破壁法提高了2.78倍，比超声破壁法提高了1.52倍。该工艺条件温和，绿色环保，符合保健食品的生产要求。
(四)附图说明

[0025] 图1真菌细胞壁结构(左：化学成分示意图；右：细胞壁透射电子显微照片)。

[0026] 图2苯酚‑硫酸法测定葡萄糖含量的标准曲线。

[0027] 图3双氧水破碎不同单因素对提取黑木耳多糖得率的影响。

[0028] 图4单因素轨迹图。

[0029] 图5各因素交互作用的响应面和等高线图。

[0030] 图6超声破碎不同单因素对提取黑木耳多糖得率的影响。

[0031] 图7超低温微波协同破碎不同单因素对提取黑木耳多糖得率的影响。

[0032] 图8黑木耳细胞壁表面特征电镜图片(第一行从左到右分别代表黑木耳子实体与超声波破碎处理的黑木耳滤渣；第二行从左到右分别代表双氧水破壁与超低温‑微波合并处理的黑木耳滤渣，放大倍数×1000)。

[0033] 图9黑木耳多糖表面特征电镜图片(从左到右分别代表超声波破碎、双氧水破壁与超低温‑微波处理提取的黑木耳多糖，放大倍数×5000)。

[0034] 图10葡聚糖标准曲线以及超声波、双氧水与超低温‑微波法黑木耳多糖的洗脱曲线。

[0035] 图11尼罗红染色线虫(从左到右依次为：正常组、阴性组、超低温‑微波协同处理组、超声破壁处理组与双氧水处理组，比例尺＝200μm)。(五)具体实施方式

[0036] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0037] 本发明实施例中双氧水以质量浓度30％双氧水形式加入。

[0038] 实施例1

[0039] 1材料与试剂

[0040] 黑木耳(黑龙江省萝北县延军农场小兴安岭产)。

[0041] 苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、过硫酸钾、氯仿、正丁醇、丙酮、硫酸亚铁、氯化亚铁、无水三氯化铁、铁氰化钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖、1,1‑二苯基‑2‑苦肼基(DPPH)、双氧水、水杨酸、Tris碱、邻苯三酚、菲咯嗪(Ferrozine)、尼罗红荧光染料、抗坏血酸(Vc)、2,2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑啉磺酸‑6)铵盐(ABTS)，实验所用水为去离子水。

[0042] N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和大肠杆菌(Escherichia coli)OP50由浙江大学动物科学学院惠赠。

[0043] 2实验仪器

[0044] JP‑250A‑2型高速多功能粉碎机，上海市久品工贸有限公司；FA224上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH‑S数显恒温水浴锅，金坛市国旺实验仪器厂；SHA‑B数显恒温振荡器，常州天瑞仪器有限公司；L535‑1低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；TG16‑WS台式高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；紫外可见光分光光度计i3，海能仪器；SHZ‑D(III)型循环水式多用真空泵，郑州科率仪器设备有限公司；VS‑840K‑U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；智能生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；itachi SU8010型场发射扫描电镜(SEM)；BZ‑X800型荧光显微镜，日本基恩士公司；KeyenceRE‑52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DHG‑9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海精密实验设备有限公司。

[0045] 3实验方法

[0046] 3.1黑木耳粉

[0047] 将黑木耳子实体置于50℃烘箱烘干至质量含水量为11.2％，粉碎，过150～200目筛，即为黑木耳粉。

[0048] 3.2双氧水与机械法破壁提取黑木耳多糖工艺的优化

[0049] 3.2.1双氧水法破壁提取黑木耳多糖工艺的优化

[0050] 取黑木耳粉，分别以料液比、双氧水浓度、处理温度、处理时间为单因素，置于水浴摇床中以120rmp的转速处理黑木耳粉，以多糖得率为响应值进行单因素实验，具体方法如下：

[0051] (1)处理温度：称取黑木耳粉(过150～200目筛)2.0g，按1g/60mL料液比加入质量浓度为1.0％的双氧水，pH7.0，控制温度分别为30℃、45℃、60℃、75℃或90℃，提取1.5h后，8000rpm离心20min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚‑硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。

[0052] (2)料液比：称取黑木耳粉(过150～200目筛)2.0g，分别按1/40、1/60、1/80、1/100或1/120(g/mL)料液比加入质量浓度为1.0％的双氧水，pH7.0，控制温度为60℃，提取1.5h。其他步骤同步骤(1)。

[0053] (3)双氧水浓度：称取黑木耳粉2.0g(过150～200目筛)，按1/60(g/mL)料液比分别加入质量终浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％与2.0％的双氧水，pH7.0，控制温度为60℃，提取1.5h。其他步骤同步骤(1)。

[0054] (4)处理时间：称取黑木耳粉2.0g(过150～200目筛)，按1g/60mL料液比加入质量终浓度为1.0％的双氧水，pH7.0，控制温度为60℃，处理时间分别为40min、60min、80min、100min与120min。其他步骤同步骤(1)。

[0055] (5)多糖含量检测方法：参照GB/T 15672‑2009。

[0056] 多糖得率(％)＝[c*V*F*10‑6/M*(1‑w)]*100。

[0057] 式中，c—根据标准曲线(图2)得到的待测多糖样品的浓度(μg/mL)；V—提取多糖样品的上清液体积(mL)；F—稀释倍数；M—黑木耳粉的质量(g)；W—黑木耳粉的含水量(％)。

[0058] 3.2.2超声破碎法破壁提取黑木耳多糖工艺的优化

[0059] 称取黑木耳粉(过150～200目筛)1.0g，以去离子水为提取溶剂，分别以液料比(40、60、80、100、120、140、160、180、200mL/g)、处理时间(5、10、15、20、25、30min)、超声功率(50、100、150、200、250W)为单因素，置于超声破壁仪中处理黑木耳，处理结束后，8000rpm离心20min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚‑硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。

[0060] 3.2.3超低温‑微波法破壁提取黑木耳多糖工艺的优化

[0061] 称取黑木耳粉(过150～200目筛)2.0g，加入70mL去离子水，分别以冷冻时间15、30、45、60、75、90、105、120min)、微波功率(70、210、350、490、700W)、微波时间(30、60、90、
120、150s)为单因素。置于超低温冰箱(‑80℃)放置不同时间，然后取出，置于微波炉中解冻，即采用解冻档，时间2min。再采用不同微波功率处理不同时间，处理结束后，8000rpm离心20min，记录上清液体积。取1.0mL上清液，采用苯酚‑硫酸法检测上清液中多糖含量，并折算为得率。

[0062] 3.3响应面设计

[0063] 根据单因素结果，选取影响黑木耳多糖得率显著的三个因素为自变量，黑木耳多糖得率为响应值，采用Box‑Behnken Design方法(三因素三水平)设计响应面实验。

[0064] 3.4扫描电镜(SEM)观察黑木耳料渣与黑木耳多糖显微结构

[0065] (1)双氧水法：称取黑木耳粉(过150～200目筛)2.0g，按1g/104mL料液比加入质量终浓度为1.41％的双氧水，pH7.0，控制温度90℃，提取120min后，8000rpm离心20min，收集沉淀和上清液。沉淀置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在5％以下)，获得黑木耳料渣0.33g。上清液按体积比1:4(V/V)加入95％乙醇醇沉，4℃静置10h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于100mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白至280nm没有吸收峰(具体是将沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)30mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰)，将上层浓缩至体积为50mL，即为黑木耳多糖液。再将黑木耳多糖液置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持
1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在5％以下)，获得黑木耳多糖1.3g。

[0066] (2)超声波法：称取黑木耳粉(过150～200目筛)1.0g，以液料比140mL/g加入去离子水，置于超声破壁仪中，超声功率200W，处理时间30min，处理结束后，8000rpm离心20min，收集沉淀和上清液。沉淀置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在5％以下)，获得黑木耳料渣0.39g。上清液按体积比1:4(V/V)加入95％乙醇醇沉，4℃静置10h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于100mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白至280nm没有吸收峰(同步骤(1))，浓缩至体积为50mL，即为黑木耳多糖液。再将黑木耳多糖液置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在
5％以下)，获得黑木耳多糖0.41g。

[0067] (3)超低温微波法：称取黑木耳粉(过150～200目筛)2.0g，加入70mL去离子水，先置于超低温冰箱(‑80℃)冷冻60min，取出置于微波炉中解冻，即采用解冻档，时间2min。再在微波功率350W下微波处理90s后，8000rpm离心20min，收集沉淀和上清液。沉淀置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在5％以下)，获得黑木耳料渣0.98g。上清液按体积比1:4(V/V)加入95％乙醇醇沉，4℃静置10h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于100mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白至280nm没有吸收峰(同步骤(1))，浓缩至体积为50mL，即为黑木耳多糖液。再将黑木耳多糖液置于真空冷冻干燥机中，初始温度为‑30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至‑20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至干燥(含水量在5％以下)，获得黑木耳多糖
0.47g。

[0068] 分别取黑木耳料渣与黑木耳多糖2mg，用MC1000离子溅射仪(icn sputter)上镀膜，在itachi SU8010型场发射扫描电镜(SEM)中观察。

[0069] 3.5黑木耳多糖分子量测定

[0070] 采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)，选用TSKgel Super Multi PW‑M色谱柱，示差折光检测器检测，流动相为纯水，柱温40℃，流速为0.6mL/min。分别用去离子水配制六种标准分子量的Dextran标准品，浓度均为10mg/mL，进样量20μL。六种Dextran标准品分子量依次为Mw＝670000，Mw＝158100，Mw＝91100，Mw＝31200，Mw＝20100，Mw＝4300，Mw＝1200，Mw＝505。以保留时间为横坐标，LogM为纵坐标，绘制标准曲线。用去离子水配制10mg/mL步骤3.4方法制备黑木耳多糖(即分别采用超声波、双氧水、超低温‑微波法制备的黑木耳多糖)作为待测样品，按上述条件进样，求得洗脱时间(TR)，通过标准曲线的回归方程计算多糖的分子量。

[0071] 3.6体外抗氧化指标检测

[0072] 按3.4三种方法提取黑木耳多糖液，按3.2.1的方法检测多糖含量后，用去离子水稀释成多糖含量0.5mg/mL的多糖溶液，测定以下抗氧化指标：

[0073] (1)ABTS+清除率的测定。制备ABTS工作液，即将ABTS储备液1mL(7.4mmol/L，溶剂为去离子水)与K2S2O8 1mL(2.6mmoL/L，溶剂为去离子水)储备液混匀，静置过夜，即为ABTS工作液。取1.0mL ABTS工作液，用PBS(pH 7.4)稀释至734nm处吸光度值为0.7±0.02，即为ABTS使用液。取1.0mL多糖溶液(0.5mg/mL)，与ABTS使用液4mL混合均匀，常温避光静置6min，于734nm波长测吸光度。95％乙醇代替样品做为空白，与样品等浓度的Vc溶液作阳性+
对照。ABTS清除率的计算公式如下：清除率＝(A空白‑A样品)/A空白×100％。

[0074] (2)DPPH自由基清除率的测定。取2mL多糖溶液(0.5mg/mL)于试管中，加入DPPH(0.1mmol/L)的无水乙醇溶液2mL，于涡旋振荡器上混合均匀，室温下避光静置30min。517nm处测定吸光度，记为A样品。去离子水代替多糖溶液做空白，记为A空白；去离子水代替DPPH试剂做对照，记为A对照；与样品等浓度的Vc溶液作阳性对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

[0075] 清除率＝(A空白‑A样品+A对照)/A空白×100％

[0076] 3.7体内生物活性指标检测

[0077] 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)生长培养基(NGM培养基)的配制：1000mL的NGM培养基含2.5g蛋白胨，3g NaCl，17g琼脂，25mL PBS缓冲液(pH 6.0,1M)，975mL去离子水，灭菌后加入1mL胆固醇水溶液(5mg/mL)，1mL MgSO4水溶液(1M)，1mL CaCl2水溶液(1M)。

[0078] 1000mL的LB培养基含10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，以5M NaOH调至中性，溶剂为蒸馏水。

[0079] 1000mL的M9缓冲液含l5.12 g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、5g NaCl、0.25g MgSO4·7H2O，溶剂为去离子水。

[0080] 裂解液：0.5mL去离子水，0.3mL NaClO，0.2mL 10mol/L NaOH水溶液，现配现用。

[0081] 线虫培养：E.coli OP50接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，置于4℃备用。秀丽隐杆线虫N2接种于涂布了E.coli OP50且细菌生长良好的NGM培养基上，于20℃恒温培养72h后，可见培养基上有大量成虫和幼虫。

[0082] 线虫同步化：选择线虫生长良好的平板，吸取1.5mL M9缓冲液于平板上，洗涤平板数次直至将大部分虫体洗下，吸取1mL线虫悬浊液于1.5mL EP管中，3000rpm离心1min，弃去上清液，用0.25mL去离子水复溶沉淀。然后加入0.15mL裂解液，漩涡振荡5min，4000rpm离心1min，弃去上清液，再加入1mL M9缓冲液复溶，涡旋洗涤，4000rpm离心1min，重复洗涤直至无次氯酸钠的味道。将裂解出的虫卵置于未涂布OP50的NGM培养基上，于20℃培养箱中培养
16h后，为L1期线虫。用M9缓冲液将虫体洗下，置于已涂布OP50的NGM培养基上，在20℃培养箱中培养48h，得同步化完成的L4期线虫。

[0083] 黑木耳多糖对线虫体内脂肪的影响：选择同步化后L4期线虫生长良好的平板，切块接种于涂布了E.coli OP50且细菌生长良好的NGM培养基平板上，于20℃恒温培养5d，用M9缓冲液将线虫洗下，设置正常对照组(正常线虫，没有加葡萄糖培养的线虫)、阴性对照组与三种不同破壁方法提取的黑木耳多糖组。正常对照组，线虫洗下后，转移至新的NGM培养基平板上，于20℃恒温培养3d。阴性对照组，将线虫洗下后，转移至新的含1.0mol/L葡萄糖的NGM培养基平板上，于20℃恒温培养3d。三种不同破壁方法提取的黑木耳多糖组，线虫洗下后，转移至含0.5mg/mL的黑木耳多糖溶液(3.4方法制备的冷冻干燥的多糖，用去离子水配制成浓度为0.5mg/mL的溶液)的NGM培养基平板上，于20℃恒温培养3d。每组取1个平板的线虫量，使用M9缓冲溶液清洗线虫3次后，加入M9缓冲溶液制成1mL线虫悬浊液。加入50μL多聚甲醛，放置1h。再洗净多聚甲醛，吸取50μL线虫悬浊液于96孔板中加入10μL尼罗红工作液静止15min，在显微镜下进行观察。尼罗红工作液的配制：用丙酮制备尼罗红荧光染色储备液(0.5mg/mL)，并在4℃下避光保存。使用前用去离子水按体积比1:40的比例稀释储备液形成工作溶液。

[0084] 4实验结果

[0085] 4.1双氧水与机械法破壁提取黑木耳多糖的单因素实验及响应面优化

[0086] 4.1.1双氧水法破壁提取黑木耳多糖的单因素实验及响应面优化

[0087] 处理温度、料液比、双氧水浓度与处理时间对黑木耳多糖提取得率的影响见图3。

[0088] 如图3所示，当温度由30℃逐渐升高至75℃时，多糖得率基本没有变化，当温度继续升高至90℃时，多糖得率显著增加，考虑到实际操作的可行性，双氧水破壁处理时，温度设定为90℃。在其它3种单因素试验基础上，根据中心组合试验原理，采用Design‑Expert.V8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验。响应面实验因素水平见表1，实验设计及结果见表2。

[0089] 表1双氧水破壁提取黑木耳多糖的实验设计因素水平表

[0090]编码水平 A:料液比(mL/g) B:双氧水浓度(％) C:处理时间(min)
‑1 80 1.2 80
0 100 1.4 100
1 120 1.6 120

[0091] 表2双氧水破壁提取黑木耳多糖实验设计及及实验结果

[0092]

[0093]

[0094] 对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到以多糖得率(Y)为响应值的回归方程：

[0095] Y＝66.56+1.93A+0.79B+5.21C+0.97AB‑0.058AC+1.33BC‑4.57A2‑10.83B2‑2.32C2[0096] 对回归方程进行方差分析，结果见表3。

[0097] 表3双氧水破壁提取黑木耳多糖得率的回归模型分析

[0098]

[0099] 方程相关系数R2＝0.9960，说明模型相关性良好；调整相关系数R2adj＝0.9908，说明方程能解释99.08％的响应值变化，拟合程度良好；变异系数为1.24％，表明模型可信度较高；精密度值大于4.0视为合理，本试验精密度为34.412，表明其为一个适宜的信号；因此，可以用该方程推测试验结果。

[0100] 由方差分析结果可知，3个因素中一次项A、B、C对响应值影响极显著；二次项中A2、2 2
B、C对响应值曲线效应影响极显著；交互项AB、BC对响应值曲面效应影响极显著，交互项AC对响应值曲面效应影响不显著，表明料液比和过氧化氢浓度、过氧化氢浓度和处理时间之间均存在明显的协同增效作用，而料液比和处理时间之间则无协同增效效应；由F值大小可推断3个因素对抑菌率影响的主次顺序为：C>A>B，即处理时间＞料液比＞过氧化氢浓度；即处理时间和料液比(AC)的交互效应强于料液比＞过氧化氢浓度(AB)。

[0101] 采用降维分析法进行单因素效应分析，即将回归方程中的两个因素固定在零水平，分别得到3个因素的单因素模型如下：

[0102] Y＝66.56+1.93A‑4.57A2

[0103] Y＝66.56+0.79B‑10.83B2

[0104] Y＝66.56+5.21C‑2.32C2

[0105] 根据以上方程得到各因素的单因素轨迹见图4。

[0106] 图4表明处理时间、过氧化氢浓度和料液比对多糖得率的影响，随料液比和处理时间的增加，多糖得率均呈先明显增大，随之增大平缓，最后缓慢降低的变化趋势，两因素在‑1～1水平间多糖得率的影响均存在极大值，但所有变化都不显著。双氧水浓度对应曲线在该范围内不断增大，该陡峭曲线表明多糖得率的响应对此因素比较敏感。

[0107] 方差分析结果知交互项AB、BC对响应值曲面效应影响极显著，为考察其交互效应，采用降维分析得回归方程如下：

[0108] Y＝66.56+1.93A+0.79B+0.97AB‑4.57A2‑10.83B2

[0109] Y＝66.56+0.79B+5.21C+1.33BC‑10.83B2‑2.32C2

[0110] 依据回归方程作交互因素的响应面和等高线图如图5。

[0111] 响应面图坡度大表明因素对响应值影响大，等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响较大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反。图5中，料液比与过氧化氢浓度、过氧化氢浓度和处理时间两组的交互效应等高线趋近椭圆，表明两者存在明显交互作用。

[0112] 利用模型优化的最佳条件为：液料比为104.32mL/g，处理时间为120min，双氧水浓度为1.414％(质量分数)，此条件下多糖溶出率可达69.7671％。结合实际实验室条件，最优调整为：液料比104mL/g，处理时间为120min，双氧水浓度为1.41％。为了进一步验证该模型与实际情况的有效性与准确性，按响应面试验优选出的提取条件进行3次平行实验，黑木耳多糖得率可以达到69.77％±0.43％，与预测值一致，说明响应面分析方法可靠，与实际情况拟合较好，从而验证了回归方程的有效性。

[0113] 4.1.2超声法破壁提取黑木耳多糖的单因素实验及响应面优化

[0114] 超声波功率、处理时间与料液比对黑木耳多糖提取得率的影响见图6。

[0115] 由图6可知，随着处理时间的增大，黑木耳多糖的得率逐渐增大，当处理时间达到仪器使用的上限30min时，黑木耳多糖的得率最高，该因素对响应值不存在中心点；同时，超声功率对黑木耳多糖的得率亦随着功率增加而增大，功率达200W时得率最高，功率继续增加到250W时，得率虽有下降，但与功率为200W时的得率间没有显著差异。因而，不需要对超声破碎的条件进行响应面优化处理。根据单因素实验结果，超声破壁的最佳条件设为：超声功率200W，处理时间30min，液料比140mL/g。在此条件下，黑木耳多糖得率可以达到48.67％±0.37％。

[0116] 4.1.3超低温微波协同破壁提取黑木耳多糖的单因素实验及响应面优化

[0117] 微波功率、冷冻时间与微波时间对黑木耳多糖提取得率的影响见图7。

[0118] 由图7可知，随着冷冻时间与微波时间的延长，黑木耳多糖的得率均呈现逐渐增大至最高点后逐渐降低的趋势，最高点时黑木耳多糖的得率与其它水平的得率间没有显著差异。因而，不需要对超声破碎的条件进行响应面优化处理。根据单因素实验结果，超低温微波协同破壁的最佳条件设为：冷冻时间60min，微波功率350W，微波时间90s。在此条件下，黑木耳多糖得率可以达到26.58％±0.56％。

[0119] 通过以上双氧水与机械法破壁提取黑木耳多糖的单因素与优化实验，在各自最佳提取条件下，双氧水破壁能使黑木耳多糖得率达到69.77％，远高于超声破壁的48.67％与超低温微波协同破壁的26.58％。

[0120] 4.2扫描电镜(SEM)观察黑木耳细胞壁与黑木耳多糖表面特征

[0121] 黑木耳子实体，超声破碎(同3.2.2)、超低温微波协同破壁(同3.2.3)以及双氧水破壁(同3.2.1)在最优破壁提取条件下获得的黑木耳滤渣的SEM图像见图8。由图8可知，黑木耳子实体的胞壁及菌丝体基本完好，没有裂纹与孔洞。超声波破壁的样品表面疏松、呈絮片状结构、表面有轻微破裂。双氧水处理的样品细胞壁破损程度大，表面呈蜂窝状，具有清晰的多孔结构，与得率结果吻合。超低温‑微波协同处理的样品表面疏松、呈絮状、具有孔洞结构。

[0122] 不同的破壁处理手段对细胞壁内多糖的显微结构也有一定影响。如图9，超声波破碎提取的多糖呈条片状，表面形态略为粗糙。双氧水破壁提取的多糖似层云堆积，表面疏松呈絮状。超低温‑微波处理提取的黑木耳多糖呈冰棱状，表面有条片刀削现象。可见，不同的破壁处理手段不仅对黑木耳细胞壁的显微结构影响不同，对细胞壁内多糖的显微结构也有较大影响。细胞壁内多糖的产量、分子结构和生物活性强烈依赖于所采用的破碎处理方式，且破壁过程可能会引起多糖糖链断裂，使多糖的化学组成、分子量、糖苷键类型与构象、生物活性等发生显著变化，提示几种破壁方式获得的多糖的生物活性也存在差异。

[0123] 4.3三种方法制备的黑木耳多糖的分子量分布与分子量大小对比

[0124] 在三种破壁方法的最优处理条件下制备黑木耳多糖，采用高效凝胶渗透色谱法检测三种多糖的分子量分布情况，在保持进样条件相同的情况下，测得已知分子量的葡聚糖标准品的保留时间TR，绘制TR和LogMw绘制的标准曲线见图10。基于标准葡聚糖的分子量与2
保留时间之间的关系，得出标准方程为：LogMw＝‑0.5295RT+13.362(R＝0.9981)。通过此标准方程计算出超声波破碎、双氧水破壁与超低温‑微波处理提取的黑木耳多糖的分子量分别为208.64kDa，237.44kDa与279.24kDa。由图10，三种多糖的分子量分布与分子量大小均不同，说明不同破壁处理手段对细胞壁内多糖糖苷键的断裂程度不同，进而推测多糖的生物活性亦存在差异。

[0125] 4.4三种方法制备的黑木耳多糖的体外抗氧化效果对比

[0126] 在三种破壁方法的最优处理条件下制备黑木耳多糖，ABTS+清除率与DPPH自由基清除率见下表4。

[0127] 由表4可知，三种破壁方法获得的黑木耳多糖对ABTS+与DPPH自由基清除能力均随+着多糖浓度的增加而加强，均具有浓度依赖关系。其中，双氧水破壁提取的多糖，其ABTS 清除能力与超低温‑微波处理提取的黑木耳多糖相近，没有统计学上的差异，但清除能力优于超声波破碎提取的多糖。同样，双氧水破壁提取的多糖，其DPPH自由基清除能力与超低温‑微波处理提取的黑木耳多糖亦相近，没有统计学上的差异，但清除能力优于超声波破碎提取的多糖。由此可见，双氧水处理除能极大提高黑木耳多糖的得率，还可以保证破壁过程不破坏多糖“活性片段”的完整性，所提取的多糖仍具有较强的自由基清除能力。

[0128] 表4三种黑木耳多糖清除自由基的效果

[0129]

[0130]

[0131] 4.5三种破壁方法制备的黑木耳多糖对线虫体内脂肪的影响效果

[0132] 超低温‑微波协同处理、超声破壁处理与双氧水处理提取的多糖对线虫体内脂肪的影响见表5与图11。

[0133] 表5三种方法制备的黑木耳多糖对线虫体内脂肪的影响

[0134]

[0135] 注：各组间存在显著差异时用不同字母a及b表示(p<0.05)；各组间没有差异用相同字母表示(p>0.05)

[0136] 据相关数据显示，目前我国肥胖人口数量居全球首位，肥胖已成为我国的公共卫生问题。现已知降低体重能够减少患心血管疾病、糖尿病等的风险，延缓疾病的进程，因此饮食干预是减少肥胖，利于病人康复的有效措施之一。尼罗红染色剂是一种亲脂性的恶嗪类荧光染料，过与脂类物质的结合并发出荧光检测信号，荧光信号越强表明脂肪含量越高。由表5可知，葡萄糖诱导的高脂肪线虫，其体内脂肪含量显著高于正常对照组。与阴性对照组相比，超低温‑微波协同处理与双氧水处理提取的黑木耳多糖均可使线虫体内脂肪显著下降(p<0.05)，与正常组线虫比较无差异(p>0.05)；而超声破壁处理提取的多糖对线虫体内脂肪水平没有效果，其脂肪水平显著低于正常线虫(p>0.05)。实验结果表明，双氧水破壁可以有效地缓解线虫体内脂肪的积累。

[0137] 实施例2

[0138] 黑木耳预处理：取10g黑木耳粉(过150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0139] 黑木耳多糖提取：取预处理后的黑木耳浆310g，加入690mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢49mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.41％，加入维生素C3.675g，调pH至7.0，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为104mL/g，在90℃水浴振荡条件下处理时间120min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖7.39g。

[0140] 采用实施例1中3.2的检测方法，黑木耳多糖得率平均值为73.90％；采用实施例1+中3.6的检测方法，黑木耳多糖对ABTS清除率为97.28％、DPPH自由基清除率为91.27％；采用实施例1中3.7的检测方法，黑木耳多糖可使线虫经尼罗红染色的荧光强度降至
43.25A.U.，且与阴性对照组比较差异显著(p<0.05)。

[0141] 比较例1

[0142] 将10g黑木耳粉(150‑200目筛)，按料液比1g:30mL加入去离子水300mL，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0143] 预处理后的黑木耳浆310g加入去离子水300mL，在80℃条件下提取4h，离心(8000rpm,20min)，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于60mL去离子水中后，采用实施例2sevag法脱蛋白至280nm没有吸收峰，浓缩至体积为20mL后，冷冻干燥(初始温度为‑30℃，真空度为80Pa)，获得水提法黑木耳多糖0.283g，多糖得率、体外抗氧化性与体内生物活性分析测试同实施例1，结果见表6。

[0144] 表6不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标

[0145]

[0146] 由表6可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及体外抗氧化性与降脂作用影响很大，双氧水提取可使黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性与降脂作用明显提高，其中提取得率与体外抗氧化性比传统的采用热水提取的黑木耳多糖分别提高了26.11倍、1.76倍、2.49倍；线虫荧光强度比传统的采用热水提取的黑木耳多糖降低了1.28倍。

[0147] 比较例2

[0148] 将实施例2中，黑木耳粉改为过40目筛，其他操作同实施例2，黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性与降脂作用指标见表7。

[0149] 表7不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标

[0150]

[0151] 由表7可知，黑木耳预处理工艺对多糖的提取得率有一定影响，粉碎后过150‑200目筛的预处理方式可使黑木耳多糖的提取得率提高，比传统的机械粉碎的粗粉提取的黑木+耳多糖提高了1.32倍；ABTS 与DPPH自由基清除率分别提高了1.13倍、1.08倍；线虫荧光强度比机械粉碎粗粉提取的黑木耳多糖降低了1.04倍。

[0152] 比较例3

[0153] 将实施例2黑木耳预处理改为：取10g黑木耳粉(过150～200目筛)不经溶胀，直接用双氧水+维生素c破壁处理，其他同实施例2，黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性与降脂作用指标见表8。

[0154] 表8不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标

[0155]

[0156] 由表8可知，黑木耳预处理工艺对多糖的提取得率有一定影响，黑木耳粉溶胀预处理方式可使黑木耳多糖的提取得率提高，比未经溶胀预处理提取的黑木耳多糖提高了1.28+倍；ABTS与DPPH自由基清除率分别提高了1.05倍、1.06倍；线虫荧光强度比机械粉碎粗粉提取的黑木耳多糖降低了1.05倍。

[0157] 比较例4

[0158] 将10g黑木耳粉(同实施例2)采用实施例2方法预处理后，加入0.8g纤维素酶，以去离子水为提取剂(不加双氧水和维生素c)，在作用温度55℃、最佳pH 4.8、最佳料液比1g/60mL条件下作用3.0h。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性与降脂作用指标，见表9。

[0159] 表9不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标

[0160]

[0161] 由表9可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率有很大影响，双氧水处理方式可使黑木耳多糖的提取得率明显提高，比纤维素酶处理提取的黑木耳多糖提高了3.47+倍；ABTS与DPPH自由基清除率分别提高了1.04倍、1.01倍；线虫的降脂作用没有差异。

[0162] 比较例5

[0163] 按实施例2方法中的预处理与提取方法，不加维生素C，其他操作相同。采用实施例1方法检测黑木耳多糖的提取得率、体外抗氧化性与降脂作用指标，见表10。

[0164] 表10不同处理提取黑木耳多糖的得率及体内外生物活性指标

[0165]

[0166] 由表10可知，黑木耳多糖的提取工艺对多糖的提取得率及体外抗氧化性有一定影响，提取时加维生素C的提取方式可使黑木耳多糖的提取得率及体外抗氧化性明显提高，比不加维生素C提取的黑木耳多糖分别提高了1.06倍、1.56倍、1.04倍；线虫荧光强度没有差异。

[0167] 实施例3

[0168] 准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀10h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0169] 预处理后的黑木耳浆310g，加入468mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢32mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.20％，加入维生素C1.92g，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为80mL/g，调pH至7.0，在90℃水浴振荡条件下处理时间120min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑+
30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖7.22g。多糖得率平均值为72.2％，ABTS 清除率为
96.18％、DPPH自由基清除率为89.61％，线虫经尼罗红染色的荧光强度为45.31A.U.。

[0170] 实施例4

[0171] 准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀14h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0172] 预处理后的黑木耳浆310g，加入468mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢32mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.20％，加入维生素C 4.8g，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为80mL/g，调pH至7.0，在85℃水浴振荡条件下处理时间120min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑+
30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖6.92g。多糖得率平均值为69.2％，ABTS 清除率为
96.87％、DPPH自由基清除率为91.17％，线虫经尼罗红染色的荧光强度为44.01A.U.。

[0173] 实施例5

[0174] 准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀10h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0175] 预处理后的黑木耳浆310g，加入836mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢64mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.60％，加入维生素C 4.8g，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为120mL/g，调pH至7.0，在95℃水浴振荡条件下处理时间80min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑+
30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖7.18g。多糖得率平均值为71.8％，ABTS 清除率为
96.10％、DPPH自由基清除率为88.82％，线虫经尼罗红染色的荧光强度为44.79A.U.。

[0176] 实施例6

[0177] 准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀14h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0178] 预处理后的黑木耳浆310g，加入836mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢64mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.60％，加入维生素C 6.4g，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为120mL/g，调pH至7.0，在90℃水浴振荡条件下处理时间100min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心
10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖7.21g。多糖得率平均值为72.1％，+
ABTS 清除率为96.27％、DPPH自由基清除率为90.32％，线虫经尼罗红染色的荧光强度为
45.06A.U.。

[0179] 实施例7

[0180] 准确称取10g黑木耳粉(150～200目筛)加入300mL去离子水中，25℃溶胀12h，得到预处理后的黑木耳浆310g。

[0181] 预处理后的黑木耳浆310g，加入653mL去离子水，再加入质量分数为30％的过氧化氢47mL，此时黑木耳浆中过氧化氢的浓度为1.40％，加入维生素C 2.35g，混匀，此时黑木耳与提取液的液料比为100mL/g，调pH至7.0，在95℃水浴振荡条件下处理时间80min。8000rpm离心20min，取上清液，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h后，3000rpm离心10min，取沉淀，溶解于600mL去离子水中后，采用sevag法脱蛋白，具体为：沉淀去离子水溶液置于分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，v:v)15mL，上下剧烈振荡2min后，置于铁架台上静置至上下分层，取上层，在280nm处检测是否有吸收峰，继续用Sevag试剂洗脱至上层在280nm没有吸收峰，将上层浓缩至体积为200mL，获得黑木耳多糖液，冷冻干燥(初始温度为‑+
30℃，真空度为80Pa)，获得黑木耳多糖7.17g。多糖得率平均值为71.7％，ABTS 清除率为
95.18％、DPPH自由基清除率为88.23％，线虫经尼罗红染色的荧光强度为44.12A.U.。