一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104、裂解酶LysP53及其应用转让专利
申请号 : CN202110760643.6
文献号 : CN113549610B
文献日 : 2022-11-11
发明人 : 危宏平 , 杨航 , 李唱唱 , 余军平 , 蒋梦薇
申请人 : 中国科学院武汉病毒研究所
摘要 :
本发明公开了一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104、裂解酶LysP53及其应用。所述抗菌肽P104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗菌肽P104的基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述裂解酶LysP53的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述裂解酶LysP53的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗菌肽P104和所述裂解酶LysP53在体外对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌；同时所述裂解酶LysP53能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶的活性高，因此，所述抗菌肽P104和所述裂解酶LysP53在抗感染类药物的研发中具有较好的应用前景。
权利要求 :
1.一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104，其特征在于，所述抗菌肽P104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的具有广谱裂解活性的抗菌肽P104，其特征在于，所述抗菌肽P104的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，其特征在于，所述裂解酶LysP53包含权利要求1所述的抗菌肽P104，所述裂解酶LysP53的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求3所述的具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，其特征在于，所述裂解酶LysP53的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求3或4所述的具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，其特征在于，扩增所述裂解酶LysP53核苷酸序列的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
6.含有权利要求4所述裂解酶LysP53基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为原核表达载体pET28a‑LysP53。
7.含有权利要求6所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.如权利要求3或4所述的具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，其特征在于，所述裂解酶LysP53的制备方法包括如下步骤：S1、从噬菌体P53基因组中扩增裂解酶LysP53基因；
S2、构建表达所述裂解酶LysP53基因的重组表达载体pET28a‑LysP53；
S3、将所述重组表达载体pET28a‑LysP53转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到表达所述裂解酶LysP53基因的工程菌；
S4、使用IPTG进行诱导表达，获得重组基因表达产物；
S5、将重组基因表达产物，经镍柱纯化分离，得到所述裂解酶LysP53。
9.权利要求1所述的具有广谱裂解活性的抗菌肽P104和/或权利要求3所述的具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53在裂解革兰氏阴性菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括以下几种：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。
说明书 :
一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104、裂解酶LysP53及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物制剂领域，具体涉及一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104、裂解酶LysP53及其应用。
背景技术
[0002] 抗生素曾被认为是治疗细菌感染性疾病最有力的武器，然而随着抗生素的滥用现象日益严重，细菌耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远低于耐药菌产生的速度。可作为替代的新抗生素又为数极少，且费用昂贵，造成临床上大量耐药菌感染者因无药可医而死亡，在这样严峻的抗生素耐药形式作用下，作为可替代抗生素成为新型抗菌制剂的噬菌体，引起国内外学者的重视。
[0003] 噬菌体是一类以微生物(细菌、真菌、放线菌或螺旋体)为宿主的病毒，没有细胞结构，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，必须依赖宿主进行复制和增殖。噬菌体作为细菌的天然杀手，广泛存在于自然界中，是地球上最丰富多样的生物体，它们的数量大约是细菌的10倍。近一个多世纪以来，噬菌体治疗的安全性和有效性已经在大量动物试验中得到了证实。裂解性噬菌体在感染宿主细菌细胞后即立即启动自身早期基因的表达，通过这些早期基因表达产物降解宿主DNA，从而终止宿主的基因表达，夺取宿主的DNA复制机器大量合成自身核酸；当产生足够的噬菌体后，这些核酸被当作模板产生大量的噬菌体结构蛋白，这些结构蛋白对噬菌体基因组进行加工和包装，产生下一代噬菌体颗粒。一旦噬菌体调控蛋白积累到一定水平，即启动噬菌体的穿孔素大量表达，穿孔素在宿主细胞内形成孔洞，导致噬菌体裂解酶穿过内膜并接近细胞壁，将细胞壁裂解，从而达到裂解细菌的目的。
[0004] 除了完整的噬菌体颗粒可以作为抗菌剂外，噬菌体编码的肽聚糖水解酶—裂解酶(lysin)也是一类极具开发潜力的新型抗菌分子。裂解酶是双链DNA噬菌体在感染宿主的后期编码的一类水解酶，可以水解细菌细胞壁肽聚糖，导致细菌裂解并释放子代噬菌体。革兰氏阳性细菌裂解酶有比较系统和成熟的研究，众多天然裂解酶和嵌合裂解酶在动物感染模型中被证实安全有效，其中抗耐药金黄色葡萄球菌感染的多个裂解酶已进入到临床试验阶段。裂解酶的高效性、特异性、低耐药性以及与现有抗生素的协同作用等优势使其成为新的、极具前景的抗菌药物。
[0005] 目前，关于噬菌体裂解酶的应用主要是裂解革兰氏阳性菌，例如：金黄色葡萄球菌、李斯特菌和肠球菌等，对革兰氏阴性菌具有裂解活性的噬菌体裂解酶研究较少。因此，有必要开发新的、对革兰氏阴性菌具有高效裂解活性的噬菌体裂解酶。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104、裂解酶LysP53及其应用。所述抗菌肽P104和所述裂解酶LysP53在体外对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌。
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104。
[0008] 一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104，所述抗菌肽P104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 进一步地，所述抗菌肽P104的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53。
[0011] 一种具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，所述裂解酶LysP53包含上述抗菌肽P104，所述裂解酶LysP53的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012] 进一步地，所述裂解酶LysP53的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013] 进一步地，扩增所述裂解酶LysP53核苷酸序列的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0014] 本发明还提供了一种含有所述裂解酶LysP53基因的重组表达载体。
[0015] 一种含有所述裂解酶LysP53基因的重组表达载体，所述重组表达载体为原核表达载体pET28a‑LysP53。
[0016] 本发明又提供了一种含有所述重组表达载体的宿主细胞。
[0017] 一种含有所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0018] 进一步地，所述裂解酶LysP53的制备方法包括如下步骤：
[0019] S1、从噬菌体P53基因组中扩增裂解酶LysP53基因；
[0020] S2、构建表达所述裂解酶LysP53基因的重组表达载体pET28a‑LysP53；
[0021] S3、将所述重组表达载体pET28a‑LysP53转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到表达所述裂解酶LysP53基因的工程菌；
[0022] S4、使用IPTG进行诱导表达，获得重组基因表达产物；
[0023] S5、将重组基因表达产物，经镍柱纯化分离，得到所述裂解酶LysP53。
[0024] 本发明最后提供了一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104和/或具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53在裂解革兰氏阴性菌中的应用。
[0025] 进一步地，所述革兰氏阴性菌包括以下几种：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0027] 本发明提供了一种具有广谱裂解活性的抗菌肽P104和具有广谱裂解活性的裂解酶LysP53，所述抗菌肽P104和所述裂解酶LysP53在体外对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌；同时所述裂解酶LysP53能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶的活性高，因此，所述抗菌肽P104和所述裂解酶LysP53在抗感染类药物的研发中具有较好的应用前景。
附图说明
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029] 图1为本发明实施例1中抗菌肽P104色谱纯度图；
[0030] 图2为本发明实施例2中裂解酶LysP53纯化后的SDS‑PAGE胶图；
[0031] 图3为本发明实施例3中裂解酶LysP53裂解A.baumannii WHG40137的时间变化结果图；
[0032] 图4为本发明实施例4中裂解酶LysP53裂解不同生长时期A.baumannii WHG40137活性结果图；
[0033] 图5为本发明实施例5中裂解酶LysP53在不同pH时裂解A.baumannii WHG40137活性结果图；
[0034] 图6为本发明实施例6中裂解酶LysP53在体外裂解不同革兰氏阴性菌菌株广谱性的结果图；
[0035] 图7为本发明实施例7中裂解酶LysP53在不同EDTA浓度下杀灭A.baumannii WHG40137的活性结果图；
[0036] 图8为本发明实施例8中裂解酶LysP53在小鼠皮肤表面杀灭A.baumannii WHG40137的活性结果图；
[0037] 图9为本发明实施例8中抗菌肽P104和裂解酶LysP53在体外裂解不同革兰氏阴性菌菌株广谱性的结果图。
具体实施方式
[0038] 下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 本发明所使用的试剂、革兰氏阴性菌株和设备，如无特殊说明，均可市售获得。
[0040] 本发明所用的实验方法，如无特别说明，均是常规的实验方法；所用的引物、测序工作均在上海生工生物技术有限公司完成；抗菌肽P104在上海强耀生物科技公司合成。
[0041] 本发明抗菌肽P104基因序列和裂解酶LysP53基因序列来源于噬菌体P53基因组，该基因组序列已经上传到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上，登录号为MW590698。
[0042] 实施例1抗菌肽P104的合成
[0043] 经过发明人大量的试验分析，发明人从噬菌体P53基因组中找到一段抗菌肽P104，所述抗菌肽P104的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗菌肽P104的基因序列如SEQ ID NO.3所示。所述抗菌肽P104由上海强耀生物科技公司合成，合成后的抗菌肽P104的纯度为98.58％，分子量为3885.57，所述抗菌肽P104的纯度经高效液相色谱法测定，抗菌肽P104色谱纯度图见图1，其分析结果如下表1所示，
[0044] 表1抗菌肽P104液相色谱检测成分表
[0045] 保留时间(min) 峰面积 纯度(％)12.085 19368 0.7814
12.198 2443361 98.58
12.460 15928 0.6426
总和 2478657 100
12.198 2443361 98.58
12.460 15928 0.6426
总和 2478657 100
[0046] 所述高效液相色谱法液相条件如下：
[0047] 色谱柱：Kromasil 100‑5‑C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：流动相A为0.1％TFA乙腈溶液，流动相B为0.1％TFA水溶液，进行梯度洗脱，梯度程序洗脱见表2；流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量10μL，检测波长220nm。
[0048] 表2梯度程序洗脱表
[0049]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 20 80
20 50 50
20.1 100 0
0 20 80
20 50 50
20.1 100 0
[0050] 实施例2裂解酶LysP53的表达与纯化
[0051] 经过发明人大量的试验分析，发明人从噬菌体P53基因组中找到一段裂解酶LysP53，所述裂解酶LysP53的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述裂解酶LysP53的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0052] 2.1重组表达载体的构建
[0053] 根据裂解酶LysP53的基因序列，采用现有技术中的常规引物设计软件，设计如下引物序列：
[0054] 53P37‑F:ctttaagaaggagatataccatggATGACGATGACAACAAAACGTA(如SEQ ID NO.5所示，具有NcoI酶切位点)；
[0055] 53P37‑R:tggtggtggtggtggtgctcgagCCCCGCCAATTCAAAGTGTGGGCT(如SEQ ID NO.6所示，具有XhoI酶切位点)。
[0056] 目的基因片段可以由生物公司合成，也可以以噬菌体P53基因组为模板，进行目的基因的扩增，本发明以噬菌体P53基因组为模板，进行目的基因的扩增，所述扩增体系为50μ2+
L反应体系，具体包括如下组分：10×buffer(Mg 浓度为20mmol/L)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，53P37‑F(10μmol/L)2μL，53P37‑R(10μmol/L)2μL，DNA模板0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，ddH20 36.3μL；PCR反应条件：98℃预变形5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s 30个循环，72℃延伸5min。反应结束后，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、测序验证后，使用NcoI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶进行酶切，然后与经过相同NcoI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶进行酶切的载体pET28a相连，得到重组表达载体pET28a‑LysP53，然后将重组表达载体pET28a‑LysP53转入到大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆子，进行测序验证。
L反应体系，具体包括如下组分：10×buffer(Mg 浓度为20mmol/L)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，53P37‑F(10μmol/L)2μL，53P37‑R(10μmol/L)2μL，DNA模板0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，ddH20 36.3μL；PCR反应条件：98℃预变形5min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s 30个循环，72℃延伸5min。反应结束后，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、测序验证后，使用NcoI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶进行酶切，然后与经过相同NcoI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶进行酶切的载体pET28a相连，得到重组表达载体pET28a‑LysP53，然后将重组表达载体pET28a‑LysP53转入到大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆子，进行测序验证。
[0057] 2.2裂解酶LysP53的表达纯化
[0058] 将测序正确并含有pET28a‑LysP53的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μg/mL卡那霉素的500mL LB培养基中培养至OD600为0.5～0.6，然后用0.5mM异丙基β‑D‑硫代半乳糖苷(Thermo Scientific)诱导16h；之后在4℃、8000rpm的条件下，离心10min，收集细胞，并用20mM咪唑洗涤一次，重悬于20mM咪唑中；细胞通过细胞破碎仪在冰上破碎，在4℃、8000rpm的条件下，离心20min，上清液通过0.22μm滤膜过滤后，过镍柱进行亲和层析，收集250mM咪唑洗脱后的片段，在4℃的条件下，置于20mM Tris缓冲液(pH 6.8)透析过夜，得到所述裂解酶LysP53，所述裂解酶LysP53纯化后的SDS‑PAGE胶图见图2。
[0059] 从图2中可以看出，所述裂解酶LysP53的大小约为24kDa。
[0060] 实施例3时间对裂解酶LysP53裂解A.baumannii WHG40137活性的影响
[0061] 将鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137培养至对数期(OD600nm＝0.4～0.6)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀溶于上述缓冲液中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53的终浓度为100μg/ml，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育，分别在不同的时间点取样，进行点板计数，得到的结果见图3。
[0062] 从图3的结果可以看出，孵育15min后，实验组中鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137大幅度降低，孵育1h后，鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137浓度降为10cfu/ml，结果表明，裂解酶LysP53对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137有较好的裂解活性。
[0063] 实施例4裂解酶LysP53裂解不同生长时期A.baumannii WHG40137活性的结果[0064] 将鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137培养至对数期(OD600nm＝0.4～0.6)和稳定期(OD600nm＝1.2～1.4)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀溶于上述缓冲液中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53的终浓度为100μg/ml，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育1h后进行点板计数，得到的结果见图4。
[0065] 从图4的结果可以看出，裂解酶LysP53对处在对数期的鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性更高。
[0066] 实施例5不同pH对裂解酶LysP53裂解A.baumannii WHG40137活性的影响
[0067] 将鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137培养至对数期(OD600nm＝0.4～0.6)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀重悬与不同pH的上述缓冲液(pH为5‑8)中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53的终浓度为100μg/ml，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育1h后进行点板计数，得到的结果见图5。
[0068] 从图5的结果可以看出，在pH为5.0‑6.5时，裂解酶LysP53对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性更高，菌液浓度降为10cfu/ml；随着溶液pH的升高(7.0‑8.0)，裂解酶LysP53对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性降低，结果表明，裂解酶LysP53在酸性条件下对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性更高。
[0069] 实施例6裂解酶LysP53在体外裂解不同革兰氏阴性菌菌株广谱性的结果
[0070] 将多种鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌株培养到稳定期(OD600nm＝1.2～1.4)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀溶于上述缓冲液中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53的终浓度为100μg/ml，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育1h后进行点板计数，得到的结果见图6。
[0071] 从图6的结果可以看出，裂解酶LysP53对多种鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌均具有较好的裂解效果，结果表明，裂解酶LysP53对革兰氏阴性菌的裂解具有广谱性。
[0072] 实施例7不同EDTA浓度对裂解酶LysP53裂解A.baumannii WHG40137活性的影响[0073] 将鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137培养至稳定期(OD600nm＝1.2～1.4)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀溶于上述缓冲液中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53的终浓度为100μg/ml，添加EDTA至终浓度分别为0、62.5、125、250、500μM，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育，分别在不同的时间点取样，进行点板计数，得到的结果见图7。
[0074] 从图7的结果可以看出，随着EDTA的浓度的增大，裂解酶LysP53对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性更高，结果表明，EDTA对裂解酶LysP53裂解鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137具有显著的促进作用。
[0075] 实施例8裂解酶LysP53在小鼠皮肤表面裂解A.baumannii WHG40137的活性结果[0076] 6‑8周龄雌性BALB/c小鼠通过腹腔注射40mg/kg的戊巴比妥麻醉，然后用电动剃须2
刀刮去背部2cm 的毛。将裸露的皮肤暴露在65℃的水中12s即可达到部分烧伤。取浓度为
8
10CFU/ml的鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137 10μL接种于烧伤部位，定殖24h后，小鼠随机分为三组，第一组小鼠12只，每只小鼠的烧伤部位加入14μg裂解酶LysP53；第二组小鼠
12只，每只小鼠的烧伤部位加入4μg米诺环素，第三组小鼠9只，每只小鼠的烧伤部位加入等量的缓冲液，治疗后4小时，小鼠颈椎脱位处死取皮。切除感染皮肤，用含有0.1％Triton X‑
100的1ml PBST浸润2分钟，并用组织细胞破坏机(NewZongKe，武汉)进行组织匀浆，然后稀释涂布于含有4μg/ml庆大霉素和2μg/ml美罗培南的LB平板，培养过夜后进行计数，到的结果见图8。
刀刮去背部2cm 的毛。将裸露的皮肤暴露在65℃的水中12s即可达到部分烧伤。取浓度为
8
10CFU/ml的鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137 10μL接种于烧伤部位，定殖24h后，小鼠随机分为三组，第一组小鼠12只，每只小鼠的烧伤部位加入14μg裂解酶LysP53；第二组小鼠
12只，每只小鼠的烧伤部位加入4μg米诺环素，第三组小鼠9只，每只小鼠的烧伤部位加入等量的缓冲液，治疗后4小时，小鼠颈椎脱位处死取皮。切除感染皮肤，用含有0.1％Triton X‑
100的1ml PBST浸润2分钟，并用组织细胞破坏机(NewZongKe，武汉)进行组织匀浆，然后稀释涂布于含有4μg/ml庆大霉素和2μg/ml美罗培南的LB平板，培养过夜后进行计数，到的结果见图8。
[0077] 从图8的结果可以看出，相比于米诺环素，裂解酶LysP53对鲍曼不动杆菌A.baumannii WHG40137的裂解活性更高，两者具有显著的差异性。
[0078] 实施例9抗菌肽P104和裂解酶LysP53在体外裂解不同革兰氏阴性菌菌株广谱性的结果。
[0079] 将多种鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌株培养到稳定期(OD600nm＝1.2～1.4)，低温离心收集沉淀后，用Tris‑HCl缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀溶于上述缓冲液中，得到A.baumannii WHG40137菌液，取实施例2制得的裂解酶LysP53与实施例1中制得的抗菌肽P104分别与上述菌液混合，使得裂解酶LysP53和抗菌肽P104的终浓度分别为100μg/ml，同时以等量缓冲液和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育1h后进行点板计数，得到的结果见图9。
[0080] 从图9的结果可以看出，裂解酶LysP53和抗菌肽P104对鲍曼不动杆菌的裂解活性更强，对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌均有一定的裂解效果，结果表明，裂解酶LysP53和抗菌肽P104对革兰氏阴性菌的裂解具有广谱性。
[0081] 以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。