基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法转让专利
申请号 : CN202111108253.7
文献号 : CN113549712B
文献日 : 2022-03-08
发明人 : 欧小华 , 吕坚 , 缪夏萍 , 周彬斌 , 黄晓强 , 李扬扬 , 于世辉 , 欧玮辉 , 沈君达 , 程雅婷
申请人 : 广州金域医学检验中心有限公司 , 香港城市大学深圳研究院 , 广州国家实验室 , 广州市金域转化医学研究院有限公司 , 广州金域医学检验集团股份有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,包括:(1)、正向引物;所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)、纳米银针SERS基底,所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得;所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示;所述纳米银针是通过电化学工艺制备而成,包括以下步骤:先将银针依次在乙醇、丙酮和水中超声清洗;再将银针置于1M±0.1M硝酸中进行电化学处理,即得;所述电化学处理包括5个 10个周期,每个周期的~
操作方法为:将银针置于阳极电流持续8秒 10秒,再置于阴极电流持续8秒 10秒。
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2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述正向引物的5’端有FAM修饰。
3.根据权利要求1或2所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括溶解剂、RT‑基础扩增试剂和激活剂。
4.一种基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法,其特征在于,所述方法获取拉曼光谱信号的位移差异,包括以下步骤:(1)、采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号,所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得;
所述纳米银针是通过电化学工艺制备而成,包括以下步骤:先将银针依次在乙醇、丙酮和水中超声清洗;再将银针置于1M±0.1M硝酸中进行电化学处理,即得;所述电化学处理包括5个 10个周期,每个周期的操作方法为:将银针置于阳极电流持续8秒 10秒,再置于阴极~ ~
电流持续8秒 10秒;
~
(2)、将步骤(1)的纳米银针SERS基底插入包含待检测样品的反应溶液中,进行恒温扩增;
(3)、恒温扩增反应结束后,取出纳米银针SERS基底,采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号,并与步骤(1)采集的拉曼光谱信号进行比较,检测拉曼光谱信号的位移差异。
5.根据权利要求4所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方‑1
法,其特征在于,步骤(3)中检测所述拉曼光谱信号的位移差异>4cm ,或检测所述拉曼光‑1
谱信号的位移差异≤4cm 。
6.根据权利要求4所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法,其特征在于,步骤(1)中所述纳米银针SERS基底的制备方法,包括以下步骤:(a)、将5’端有巯基修饰的反向引物与三(2‑羧乙基)膦混合,室温25min 35min进行还~
原;
(b)、将还原后的反向引物于60℃ 70℃孵育8min 12min,马上置冰盒上冷却,冷却后平~ ~
衡到室温;
(c)、在反向引物中插入纳米银针,室温反应25min 35min,使反向引物共价连接于纳米~
银针上,即得。
7.根据权利要求4所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法,其特征在于,步骤(2)中所述恒温扩增为:38℃ 44℃恒温反应20min 30min。
~ ~
8.根据权利要求4所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述包含待检测样品的反应溶液的制备方法,包括以下步骤:(a)、将15μl 25μl溶解剂、2.0μl 3.0μl正向引物、24.5μl 26.5μl待检测样品充分震荡~ ~ ~
混匀,离心,得到反应预混液;
(b)、将反应预混液加入至RT‑基础扩增试剂中,充分震荡混匀,至RT‑基础扩增试剂彻底溶解;
(c)、再加入1.5μl 2.5μl激活剂,充分震荡混匀,离心,得到总体积为50μl的包含待检~
测样品的反应溶液。
说明书 :
基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法
技术领域
背景技术
分子振动、转动方面信息,是一种快速无损检测技术,具有制样简单、水的干扰小、非侵入、
实时检测等优点,在核酸检测、病原微生物检测、肿瘤精准分子诊断等领域展现出良好的应
用潜力。
交形成三明治检测结构进行DNA检测[ Y.W.C. Cao, R.C. Jin, C.A. Mirkin,
Nanoparticles with raman spectroscopic fingerprints for DNA and rna
detection, Science 297 (2002) 1536‑1540];又如以银纳米颗粒为核酸标记探针拉曼分
子并包裹二氧化硅壳(Ag nanorice@MGITC@SiO2)作为SERS探针,利用光刻技术在硅圆片上
形成三角状金纳米膜作为SERS活性检测基底,实现了乙型肝炎病毒检测[ Y. Liu, P.Y.
Wu, Meditating metal coenhanced fluorescence and sers around gold
nanoaggregates in nanosphere as bifunctional biosensor for multiple DNA
targets, Acs Appl. Mater. Interface 5 (2013) 5832‑5844.];Cui小组以银纳米棱镜
作为基底,以4‑MBA拉曼活性分子作为标记、探针寡核苷酸修饰的金纳米颗粒作为SERS探
针,在水溶液中直接进行DNA检测[ M. Li, S.K. Cushing, H.Y. Liang, S. Suri, D.L.
Ma, N.Q. Wu, Plasmonic nanorice antenna on triangle nanoarray for surface‑
enhanced raman scattering detection of hepatitis b virus DNA, Anal. Chem. 85
(2013) 2072‑2078];Mirkin小组采用固态金属膜SERS基片构建检测多元基底,分别制作标
记不同的拉曼探针分子、与目标检测物互补的探针链结合的SERS探针,开展多种病原检测
[ R.C. Jin, Y.C. Cao, C.S. Thaxton, C.A. Mirkin, Glass‑bead‑based parallel
detection of DNA using composite raman labels, Small 2 (2006) 375‑380]。随着
SERS研究的深入及多学科领域的交叉发展,SERS技术有望广泛应用于核酸检测以及整个生
物医学检测领域,为生命科学提供一种强大的分析技术。
高度,不管对新型冠状病毒的临床检测还是进行实验室研究,如何快速、高效的检测新型冠
状病毒核酸成为重中之重。
需要研发检测更方便、更快捷的核酸检测试剂盒及检测方法。
基底进行新冠肺炎病毒的核酸检测。
(Nanoscale, 2016, 8, 17365–17373)中公开了一种基于SERS的核酸检测方法,其是通过
在SERS基底上面修饰发卡结构,一端通过‑SH连在SERS基底上,一端修饰拉曼报告分子,由
于发卡结构,报告分子比较靠近于SERS基底,因此有较强的SERS信号。当特征序列过来,发
卡结构打开,报告分子远离SERS基底,因此SERS信号减弱,故可通过SERS信号的强弱变化来
判断目标序列以及其浓度。但是由于修饰探针的浓度影响,SERS信号没有具体的数值。
~
(也称作“hot spots”),Science上也有论文报道SERS信号的80%来自于极少数 hot spots
的贡献(Science, 321 (2008) 388‑392),但是,现在的控制工艺很难控制到10纳米以下的
结构,因此真正意义上超高均一性的SERS基底比较难以实现,这也是为什么行业将强度的
重复性的范围定义在20%的原因之一(ACS Nano 2020, 14, 28−117)。
减弱不明显,当目标核酸的量很小时,难度将变得更大。
在检测过程中可能会有热运动,分解或者其他变化。
影响极大。
发明内容
理,即得;所述电化学处理包括5个 10个周期,每个周期的操作方法为:将银针置于阳极电
~
流持续8秒 10秒,再置于阴极电流持续8秒 10秒。
~ ~
测。
≤4cm 。
行还原;
后平衡到室温;
纳米银针上,即得。
30min。
震荡混匀,离心,得到反应预混液;
待检测样品的反应溶液。
果:
有巯基修饰的反向引物与纳米银针进行共价结合而得),其中纳米银针SERS基底中所使用
的纳米银针是通过电化学工艺制备而成,不会出现纳米颗粒团聚现象,使得拉曼光谱信号
得以更好地聚焦,具有较好的信号稳定性,再配合特定的针对新型冠状病毒的特异性引物,
从而可以实现新型冠状病毒核酸的快速便捷检测。
针SERS基底插入包含待检测样本的溶液中进行恒温扩增,阳性样本经恒温扩增反应后,会
在纳米银针SERS基底表面进行富集,而阴性样本经恒温扩增反应后,不会在纳米银针SERS
基底表面富集,因此,经便携式拉曼光谱仪进行检测后,采集拉曼光谱信号;计算两次拉曼
‑1 ‑1
光谱信号的位移差异>预设标准4 cm 还是≤预设标准4cm ,可以实现阴阳性样本的快速
区分。
挑战,因此,本发明的检测方法更简单、更准确、更可靠。
附图说明
银针SERS基底(共价连接有反向引物)的拉曼光谱信号图谱;C:检测阴性待测物(即不含有
新型冠状病毒核酸的样本)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱;D:检测阳性待测物
(即新型冠状病毒全长核酸标准品)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱。
曼光谱信号图谱,检测阴性样本1(即不含有新型冠状病毒的核酸样本)的纳米银针SERS基
底的拉曼光谱信号图谱,检测阳性样本1(即新型冠状病毒全长核酸标准品)的纳米银针
SERS基底的拉曼光谱信号图谱;b:检测阴性样本2和3、阳性样本2和3的纳米银针SERS基底
的拉曼光谱信号图谱;c:三个批次实验的拉曼强度分析; d: 三个批次实验的拉曼光谱信
号位移分析。
具体实施方式
发明公开内容的理解更加透彻全面。
所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市
售产品。
施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列
项目的任意的和所有的组合。
病毒进行核酸检测,包括以下步骤:
针灸银针置于申请人实验室自制的电化学反应池中(电化学反应池中装有1M的硝酸)进行
批量电化学处理,即可得到表面具有银纳米阵列结构的银针,且优势取向为面心立方Ag。所
述电化学处理包括5个周期,每个周期的操作方法为:将针灸银针置于阳极电流持续8秒 10
~
秒,再置于阴极电流持续8秒 10秒。本发明电化学工艺制备的纳米银针的表面结构,如图2
~
所示。对纳米银针的检测区域进行放大,可以看出,通过电化学工艺处理后的区域,银针表
面呈现纳米结构,纳米蚀刻银针的宽带散射光谱与便携式拉曼光谱仪中最常用的激发激光
波长(785 nm)良好匹配,使其与低成本便携式拉曼光谱仪高度兼容。
过程),依赖于制备者的操作习惯(不同人制备出来的颗粒常常不同),比较难以用大容器进
行批量制备(加热和均一性不好,洁净度比较难达到要求);贵金属纳米颗粒较容易颗粒团
聚,一旦颗粒出现团聚,会对拉曼光谱信号造成干扰,且检测相对比较复杂,不利用新学者
掌握。
于呈单一的针状,不会出现颗粒团聚现象,可以使得拉曼光谱信号得以更好地聚焦,具有较
好的信号稳定性。而且纳米银针本身作为取样器,极大地简化了操作步骤,有利用应用推
广。
混匀并于掌上离心机瞬离。
肺炎病毒PCR检测试剂盒进行检测,确认为新冠肺炎阴性),预混液总体积48μl,充分震荡混
匀并于掌上离心机瞬离。
上反应30min;目标待测物在纳米银针SERS基底上进行恒温扩增和富集;
应体系,放置于便携式拉曼光谱仪上进行检测,降低检测背景反应体系的影响(现有技术是
基于贵金属纳米颗粒的,当完成反应后在背景反应体系中进行检测,背景反应体系中存在
反应的酶和副产物,可能会对结果产生影响,但纳米银针SERS基底无法放在背景反应体系
中进行检测,需取出放到拉曼光谱仪上进行检测,这是必须过程,同时也降低了背景反应体
系的影响),实现信号的二次扩大,高效增加检测信号的特异性。作为对照,同时对没有与反
向引物共价连接的纳米银针(空白纳米银针)也进行了检测。
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有特征峰信号;共价连接有反向引物的纳米银针SERS基底,发现其特征峰位于729 cm 位
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置;阳性待测物(即新冠病毒全长核酸标准品)的特征峰前移至715cm ,计算阳性待测物与
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纳米银针SERS基底特征峰的位移差异为14cm ,位移差异>4 cm (位移差异预设标准为4
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cm ),确定待测物为阳性;阴性待测物(即不含有新冠病毒的核酸样本)的特征峰前移至
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725cm ,计算阴性待测物与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异=4cm ,位移差异≤4 cm
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,确定待测物为阴性。
性样本(即不含有新型冠状病毒的核酸样本)(来源于金域新冠临检实验室,已采用经获批
的新冠肺炎病毒PCR检测试剂盒进行检测,确认为新冠肺炎阴性)。结果如图5所示。
没有特征峰信号;共价连接有反向引物的纳米银针SERS基底,发现其特征峰位于729 cm 位
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置;阳性样本1(即新冠病毒全长核酸标准品)的特征峰前移至718cm ,计算阳性样本1与纳
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米银针SERS基底特征峰的位移差异为11cm ,位移差异>4 cm ,阴性样本1(即不含有新冠
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病毒的核酸样本)的特征峰前移至728cm ,计算阴性样本1与纳米银针SERS基底特征峰的位
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移差异=1cm ,位移差异<4 cm 。
本2和3与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异为9cm ,位移差异>4 cm ,阴性样本2和3
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(即不含有新冠病毒的核酸样本)的特征峰前移至728cm ,计算阴性样本2和3与纳米银针
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SERS基底特征峰的位移差异=1cm ,位移差异<4 cm 。说明,本发明的试剂盒的检测方法,
具有较好的可重复性。
中,阳性样本峰强度低于阴性样本,这反应了在SERS检测过程中,拉曼峰强度容易受到微环
境(例如:光漂白,分子的脱附,SERS基底热效应等)的影响,不太稳定。
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谱信号与阴性样本的拉曼光谱信号相比,均有大于4cm 的位移,且都是移向更低波数,说
明,拉曼光谱信号位移可以作为稳定的判定依据。
在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护
范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。