本发明公开了一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，属于分子生物学领域，本发明包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶加ddATP修复；步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA的CpG岛；步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A‑Tailing；步骤四，用DNA连接酶进行甲基化接头连接，混合样本；步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶；步骤六，甲基化文库PCR富集；步骤七，切胶回收；本发明解决了现有技术福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题，具有广大的应用前景和市场价值。
1.一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的肠癌或肺癌组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复：
1）每个样本取15ng FFPE DNA，然后用水补齐到17µl，加到96孔板中，按照如下反应体系进行DNA末端修饰反应：DNA 17µl，Klenow Exo‑ 0.5µl，1mM ddATP 0.5µl，10X CutSmart buffer 2µl；
2）在每个样本孔中加入3µl的DNA末端修饰反应混合物；
4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 30℃10分钟；程序2 37℃10分钟；程序3 70℃5分钟；程序4 4℃hold；
1）按照如下反应体系进行限制性内切酶消化反应：上步产物20µl，MspI 0.5µl，10X CutSmart 0.1µl，水0.4µl；
4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 37℃30分钟；程序2 75℃10分钟；程序3 4℃hold；
步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A‑Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3’端：
上步产物21µl，KlenowExo‑ 0.5µl，dNTP 0.4µl，10X CutSmart 0.2µl，水0.9µl；其中dNTP由10mM dATP，1mM dCTP，1mM dGTP 组成；
4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 30℃10分钟；程序2 37℃10分钟；程序3 70℃5分钟，程序4 4℃hold；
步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合：
1）按照如下反应体系进行接头连接反应：上步产物23µl，100mM ATP 0.1µl，T4连接酶
0.2µl，10X CutSmart buffer 0.3µl，0.15µM甲基化接头 2.4µl；
甲基化接头购买合成后，使用lowTE缓冲液溶解至100µM作为母液储存，再取部分母液稀释至0.15µM的工作液；
3）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为25℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 16℃1‑3小时；程序2 70℃10分钟；程序3 4℃hold；
5）将24个不同标签序列标记的样本全部转移到一个1.5ml离心管中混合，然后用30µl lowTE缓冲液洗涤每个样本孔，并最终与样本混合；
6）在每个混合的样本文库中加入1.8倍的VAHTS DNA Clean Beads磁珠，在室温下旋转试管30分钟，以促进磁珠和文库DNA的结合；
7）短暂离心样本管，将样本管置于DynaMagTM‑2磁力架上分离磁珠，室温分离10分钟，小心取出上清溶液，注意不要碰到磁珠；
待乙醇完全挥发后，用40μl lowTE缓冲液洗脱文库DNA；
步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于‑80℃下：
1）根据QIAGENEpiTect快速亚硫酸氢盐转换试剂盒的产品说明书进行甲基化处理，使用了两个周期的亚硫酸氢盐转化方案，程序如下所示：程序1 98℃5分钟；程序2 60℃20分钟；程序3 98℃5分钟，程序4 60℃20分钟，程序5 20℃hold；
当热循环仪温度降至20℃后，应尽快进入试剂盒的纯化步骤以减少DNA损失；
2）用30µl的TE缓冲液洗脱转化完成的DNA；亚硫酸氢盐转化后的DNA应立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于‑80℃下；
步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本中的条带在170‑400bp的DNA片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成；其中，将DNA文库在4％agarose TAE‑gel琼脂糖凝胶上电泳2小时，在1：10000稀释的SYBR Green I中染色1小时；根据DNA ladder切胶回收
170‑400bp的DNA片段；用QIAGEN MinElute凝胶纯化试剂盒纯化170‑400bp的DNA片段，去除包含PCR引物序列、引物二聚体和大片段序列的非目标序列；
所述步骤四中的甲基化接头包括：RRBS‑1，RRBS‑2，RRBS‑3，RRBS‑4，RRBS‑5，RRBS‑6，RRBS‑7，RRBS‑8，RRBS‑9，RRBS‑10，RRBS‑11，RRBS‑12；RRBS‑1的上游序列如SEQ01，下游序列如SEQ13；RRBS‑2的上游序列如SEQ02，下游序列如SEQ14；RRBS‑3的上游序列如SEQ03，下游序列如SEQ15；RRBS‑4的上游序列如SEQ04，下游序列如SEQ16；RRBS‑5的上游序列如SEQ05，下游序列如SEQ17；RRBS‑6的上游序列如SEQ06，下游序列如SEQ18；RRBS‑7的上游序列如SEQ07，下游序列如SEQ19；RRBS‑8的上游序列如SEQ08，下游序列如SEQ20；RRBS‑9的上游序列如SEQ09，下游序列如SEQ21；RRBS‑9的上游序列如SEQ10，下游序列如SEQ22；RRBS‑10的上游序列如SEQ11，下游序列如SEQ23；RRBS‑11的上游序列如SEQ12，下游序列如SEQ24；
所述步骤一中的石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本；
所述步骤六中的甲基化文库PCR富集的具体方法包括：在对文库富集前，取部分亚硫酸氢盐转化后的文库进行PCR循环数优化；将得到的PCR反应混合物分别分配到各个PCR孔中，离心PCR板孔，进行后续PCR扩增，从10个PCR循环数开始，依次递增2个循环至确立可以获得可靠文库的最适循环数；再将剩余的亚硫酸氢盐转化后的文库根据最适循环数进行扩增，纯化，洗脱文库DNA；
所述步骤六中的甲基化文库PCR富集的扩增引物包括：Universal Primer SEQ25，RRBS‑R701 SEQ26，RRBS‑R702 SEQ27，RRBS‑R703 SEQ28，RRBS‑R704 SEQ29，RRBS‑R705 SEQ30和RRBS‑R706 SEQ31。
一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库
的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法。
背景技术
[0002] DNA甲基化是在真核生物体中一种DNA化学修饰，可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传表现。DNA甲基化通常出现在CpG二核苷酸，通过甲基转移酶的作用增加在胞嘧啶的5’碳位增加一个甲基基团。甲基化可以通过亲代细胞遗传给子代细胞，也可以在细胞中从头合成。甲基化程度作为一种可逆的DNA修饰方式，参与基因表达的调控，异常的高甲基化或低甲基化会引起各种疾病，所以可以作为细胞和生物体健康的检测标准。
[0003] 通过结合基因组DNA的亚硫酸氢盐转化技术和高通量测序技术，可以对基因组的甲基化进行测序。简化代表性甲基化测序通过使用对甲基化不敏感的酶富集CpG岛区域，再通过亚硫酸氢盐转化、测序，可以实现单碱基检测的高分辨率和测序数据的高利用率。
[0004] 基于甲基化信号的高灵敏、位点多、有组织特异性等特点，在临床实践中可以广泛应用于癌症早筛、疗效监控、组织溯源等领域。在临床实践中，石蜡包埋是一种常见的保存组织样本的手段，可以长时间保存组织细胞的形态特征，便于病理诊断。然而，福尔马林浸泡过程中，对细胞核中基因组DNA的损伤较大，造成提取出的基因组DNA有较多断裂的小片段，这些断裂的基因组DNA连接接头、进入文库，造成了大量的数据浪费，稀释了酶切对于CpG岛的富集作用。所以，利用传统RRBS构建FFPE DNA文库失败率较高，给甲基化测序技术在临床上的发展和推广带来了阻碍。市场需要一种能够阻碍基因组DNA与甲基化接头的连接，使酶切富集CpG岛区域的效果得到放大的同时，通过使用相同的缓冲液，使操作流程简单，减少试剂和人员成本，减少反复纯化造成的DNA损失，并且容易转化成自动化建库流程的技术，本发明解决这样的问题。
发明内容
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，本发明通过DNA末端修饰加双脱氧ATP（ddATP）以阻止非酶切DNA片段与后续甲基化接头连接，从而能够解决福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，包括如下步骤：
[0008] 步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复；
[0009] 步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA；
[0010] 步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A‑Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3’端；
[0011] 步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合；
[0012] 步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于‑80℃下；
[0013] 步骤六，甲基化文库 PCR富集；
[0014] 步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本，条带在170‑400bp的DNA 片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成。
[0015] 进一步的，步骤一中的石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本。
[0016] 进一步的，末端修饰酶包括：Klenow Exo‑酶、DNA聚合酶中的一种或多种的组合。
[0017] 进一步的，步骤二中的限制性内切酶为MspI、HaeIII中的一种或多种的组合。
[0018] 进一步的，步骤四中的甲基化接头为两条单链互补核酸在98℃水浴5分钟，关闭水浴锅，自然冷却到室温25℃完成退火后，形成的Y型双链结构，两条单链核酸中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的，Y型接头的底部核酸的5’端做磷酸化处理；3’端包含一个6个核苷酸组成的标签序列。
[0019] 进一步的，甲基化接头包括：RRBS‑1，RRBS‑2，RRBS‑3，RRBS‑4，RRBS‑5，RRBS‑6，RRBS‑7，RRBS‑8，RRBS‑9，RRBS‑10，RRBS‑11，RRBS‑12；RRBS‑1的上游序列如SEQ01，下游序列如SEQ13；RRBS‑2的上游序列如SEQ02，下游序列如SEQ14；RRBS‑3的上游序列如SEQ03，下游序列如SEQ15；RRBS‑4的上游序列如SEQ04，下游序列如SEQ16；RRBS‑5的上游序列如SEQ05，下游序列如SEQ17；RRBS‑6的上游序列如SEQ06，下游序列如SEQ18；RRBS‑7的上游序列如SEQ07，下游序列如SEQ19；RRBS‑8的上游序列如SEQ08，下游序列如SEQ20；RRBS‑9的上游序列如SEQ09，下游序列如SEQ21；RRBS‑9的上游序列如SEQ10，下游序列如SEQ22；RRBS‑10的上游序列如SEQ11，下游序列如SEQ23；RRBS‑11的上游序列如SEQ12，下游序列如SEQ24。
[0020] 进一步的，步骤四中的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
[0021] 进一步的，步骤六中的甲基化文库 PCR富集的具体方法包括：在对文库富集前，取部分亚硫酸氢盐转化后的文库进行PCR循环数优化；将得到的PCR反应混合物分别分配到各个PCR孔中，离心 PCR板孔，进行后续PCR扩增，从10个PCR循环数开始，依次递增2个循环至确立可以获得可靠文库的最适循环数；再将剩余的亚硫酸氢盐转化后的文库根据最适循环数进行扩增，纯化，洗脱文库DNA。
[0022] 进一步的，步骤六中的甲基化文库 PCR富集的扩增引物包括：Universal Primer SEQ25，RRBS‑R701 SEQ26，RRBS‑R702 SEQ27，RRBS‑R703 SEQ28，RRBS‑R704 SEQ29，RRBS‑R705 SEQ30和RRBS‑R706 SEQ31。
[0023] 采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
[0024] 本发明的方法可用于大规模利用FFPE样本构建甲基化文库，生成96个FFPE DNA简化代表性甲基化文库的整个过程仅需要3天，大大节省了甲基化文库的构建时间；
[0025] 本发明的方法，一个样本集可以混合24个基因组DNA甲基化文库和VAHTS DNA Clean Beads磁珠去除接头二聚体的方法，消除了单细胞甲基化文库的繁琐和电泳选择带来的损耗，允许大规模的文库生成，且易于自动化设置，从而降低每个样本的总成本；
[0026] 本发明的方法通过用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复，避免了FFPE DNA中的短片段大量连接接头，提高接头和酶切位点结合的效率，提高CpG岛的覆盖度，使酶切富集CpG岛区域的效果得到放大，从而以更经济高效的方式提供甲基化信息；
[0027] 本发明的方法能够以较低含量、短片段多的FFPE DNA作为研究的起始材料，可以使用病理研究后的剩余样本，不需要重复采样；
[0028] 本发明的方法可以回溯研究既往病例的肿瘤甲基化情况，从而获得更多的肿瘤甲基化数据。
附图说明
[0029] 图1为本发明的方法流程原理示意图。
[0030] 图2是本发明FFPE DNA文库构建实验流程示意图。
[0031] 图3是本发明实验一使用Agilent生物分析仪高灵敏度DNA分析试剂盒对RRBS文库的质控图。
具体实施方式
[0032] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0033] 如图1、2所示，一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，包括如下步骤：
[0034] 步骤一，取石蜡包埋FFPE固定的组织样本，用洁净的刀片刮下，放在细胞裂解液中消化，消化后的细胞将DNA释放出来，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复；作为一种优选，建议石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本，样本没有具体的包埋时间限制，但通常情况下包埋时间越久，对组织的损伤越大，不利于建库后的文库质量，所以建议样本包埋限定在一定的时间段内最佳。。
[0035] 步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA的CpG岛；作为一种实施例，限制性内切酶为MspI、HaeIII中的一种或多种的组合。
[0036] 步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A‑Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3’端；末端修饰酶包括：Klenow Exo‑酶、DNA聚合酶中的一种或多种的组合，从酶功能角度看，Klenow Exo‑酶、DNA聚合酶都是可以实现；作为一种优选，末端修饰酶为Klenow Exo‑酶；Klenow Exo‑酶缺失3’‑5’外切酶活性，如果酶有3’‑5’外切酶活性的话，末端修复后就是一个平末端的文库，难与下游的接头序列接上。
[0037] 步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合；
[0038] 作为一种优选，DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
[0039] 甲基化接头为两条单链互补核酸，该甲基化接头在使用前稀释到0.15μM，保存于‑80℃；甲基化接头退火形成Y型双链结构的条件为：98℃水浴5分钟，关闭水浴锅，自然冷却到室温25℃，形成的Y型双链结构，两条单链核酸中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的，Y型接头的底部核酸的5’端做磷酸化处理；3’端包含一个6个核苷酸组成的标签序列。
[0040] 步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于‑80℃下；
[0041] 作为一种优选，使用的亚硫酸氢盐转化试剂盒为QiaGen EpiTect fast bisulfite conversion kit，在转化后温度降至20℃后，立即进入亚硫酸氢盐转化的DNA文库的纯化步骤。
[0042] 步骤六，甲基化文库 PCR富集；
[0043] 作为一种实施例，甲基化文库 PCR富集的具体方法包括：
[0044] 反应体系和PCR程序如下表1和2：
[0045] 反应体系 表1
[0046]
[0047] 需要说明的是：文库扩增的PCR正反引物用TE缓冲液稀释到25µM，在‑20℃条件下可以保存1年时间。
[0048] PCR程序 表2
[0049]
[0050] 然后再对PCR富集后的文库进行纯化；作为一种优选，使用1.3x VAHTS DNA Clean Beads进行纯化。
[0051] 作为一种优选，甲基化文库 PCR富集的具体方法包括：在对文库富集前，取部分亚硫酸氢盐转化后的文库进行PCR循环数优化，这样能确保足够的文库DNA生成，同时避免过度扩增引入较高的duplication；将得到的PCR反应混合物分别分配到各个PCR孔中，离心 PCR板孔，进行后续PCR扩增，从10个PCR循环数开始，依次递增2个循环至确立可以获得可靠文库的最适循环数；再将剩余的亚硫酸氢盐转化后的文库根据最适循环数进行扩增，具体扩增过程如实验一中所示，纯化，洗脱文库DNA。纯化作为一种优选，带有不同标签序列的接头添加到样本上后，将样本混合到同一管中进行磁珠纯化。优选使用1.8x VAHTS DNA Clean Beads进行纯化。
[0052] 步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本，条带在170‑400bp的DNA 片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成。
[0053] 具体过程如下所述：
[0054] 1）使用4％agarose TAE‑gel进行凝胶电泳对每一个混合样本，条带在170‑400bp的DNA 片段进行切胶回收，使用的回收试剂盒为QiaGen MinElute gel purification kit；
[0055] 2）再对切胶回收的文库进行质控和混合，质控为使用Agilent高敏芯片对文库的片段大小和浓度进行质控，混合为对带有不同标签序列的文库根据数据量的分配进行等比例摩尔量混合；
[0056] 3）测序上样量应按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成，作为一种优选，混合的测序文库应掺入30％‑50％的phiX平衡文库以确保文库多样性。
[0057] 用以下具体的实施过程验证本发明的技术效果：
[0058] 文库构建具体过程：
[0059] 以不同包埋时间内的FFPE作为材料，获得基因组DNA，样本信息如下表3：
[0060] 表3
[0061]
[0062] 步骤一、DNA末端修饰
[0063] 1. 每个样本取15ng FFPE DNA，然后用水补齐到17µl，加到96孔板中。按照下表4反应体系进行DNA末端修饰反应：
[0064] 表4
[0065]
[0066] 注：将Klenow Exo‑、ddATP(1mM)和10x CutSmart buffer按照样本数量提前混合来避免加样造成的样本间误差。下面的限制性内切酶消化、末端修复和接头连接反应用类似的方法提前混合试剂。
[0067] 2. 在每个样本孔中加入3µl的DNA末端修饰反应混合物。
[0068] 3. 通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心。
[0069] 4. 将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下表5程序进行孵育反应：
[0070] 表5
[0071]
[0072] 5. 孵育结束后，离心30秒。
[0073] 步骤二、限制性内切酶消化
[0074] 1. 按照下表6反应体系进行限制性内切酶消化反应：
[0075] 表6
[0076]
[0077] 2. 在每个样本孔中加入1µl消化混合物。
[0078] 3. 通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心。
[0079] 4. 将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序表7进行孵育反应：
[0080] 表7
[0081]
[0082] 5. 孵育结束后，离心30秒。
[0083] 步骤三、末端修复
[0084] 1. 按照下表8反应体系进行末端修复反应：
[0085] 表8
[0086]
[0087] 2. 在每个样本孔中加入2µl末端修复混合物。
[0088] 3. 通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心。
[0089] 4. 将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序表9进行孵育反应：
[0090] 表9
[0091]
[0092] 5. 孵育结束后，离心30秒。
[0093] 步骤四、接头连接
[0094] 1. 按照下表10反应体系进行接头连接反应：
[0095] 表10
[0096]
[0097] 甲基化接头购买合成后，使用low TE溶解至100µM作为母液储存，再取部分母液稀释至0.15µM的工作液。
[0098] 表11 接头序列信息
[0099]
[0100] 在每个样本中加入0.5µl接头连接混合物和2.5µl接头。
[0101] 2. 通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心。
[0102] 3. 将样本放入热循环仪中，热盖温度设为25℃，按照以下程序表12进行孵育反应：
[0103] 表12
[0104]
[0105] 4. 孵育结束后，离心30秒。
[0106] 5. 将24个不同标签序列标记的样本全部转移到一个1.5ml离心管中混合，然后用30µl low TE洗涤每个样本孔，并最终与样本混合。
[0107] 6. 在每个混合的样本文库中加入1.8倍的VAHTS DNA Clean Beads磁珠，在室温下旋转试管30分钟，以促进磁珠和文库DNA的结合。
[0108] 7. 短暂离心样本管，将样本管置于DynaMagTM‑2(Life Technologies)磁力架上分离磁珠，室温分离10分钟，小心取出上清溶液，注意不要碰到磁珠。
[0109] 8. 用1毫升80％新鲜配制的乙醇清洗磁珠两次。
[0110] 9. 待乙醇完全挥发后，用40μl low TE缓冲液洗脱文库DNA。
[0111] 步骤五、亚硫酸氢盐转化
[0112] 1. 根据QIAGEN EpiTect快速亚硫酸氢盐转换试剂盒的产品说明书进行甲基化处理，并进行了一些修改，使用了两个周期的亚硫酸氢盐转化方案，如下表13所示：
[0113] 表13
[0114]
[0115] 当热循环仪温度降至20℃后，应尽快进入试剂盒的纯化步骤以减少DNA损失。
[0116] 2. 用30µl的TE缓冲液洗脱转化完成的DNA。
[0117] 关键步骤：亚硫酸氢盐转化后的DNA应立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于‑80℃下。如果放在室温或4℃，亚硫酸氢盐转化的DNA将迅速降解，造成建库失败。
[0118] 步骤六、文库富集
[0119] 1. （可选）如果有多个相似的混合文库可用，推荐使用其中一个混合文库来验证PCR循环，并利用最低的循环数（从中可以生成足够的库DNA）进行最终的DNA文库富集，PCR反应体系如下表14：
[0120] 表14
[0121]
[0122] 表15PCR扩增引物信息
[0123]
[0124] 2. 将上述50μl的PCR反应混合物分别取10μl分配到4个不同的PCR孔中。简单离心 PCR板孔，进行后续PCR扩增，扩增参数如下表16：
[0125] 表16
[0126]
[0127] 通常从10个循环开始，每次增加2个循环，以找到可以富集文库的最佳循环数，建议不超过20个循环，否则容易出现大量的PCR副产物。
[0128] 3. 准备如下表17的PCR扩增体系：
[0129] 表17
[0130]
[0131] 4. 短暂离心后，进行PCR扩增，扩增参数如下表18：
[0132] 表18
[0133]
[0134] 5.在每个富集后的文库中加入1 .3倍的VAHTS DNA Clean Beads磁珠，在室温下旋转试管30分钟，以促进磁珠和文库DNA的结合。
[0135] 6. 短暂离心样本管，将样本管置于DynaMagTM‑2(Life Technologies)磁力架上分离磁珠，室温分离10分钟，小心取出上清溶液，注意不要碰到磁珠。
[0136] 7. 用1毫升80％新鲜配制的乙醇清洗磁珠两次。
[0137] 8. 待乙醇完全挥发后，用20μl low TE缓冲液洗脱文库DNA。
[0138] 步骤七、片段回收
[0139] 1. 使用Agilent生物分析仪（Agilent Technologies，Agilent Bioanalyzer 2100）和高灵敏度DNA分析试剂盒 (Agilent Technologies, cat. no. 5067‑4626) 生成的4个文库片段质控图，FFPE‑RRBS文库质检结果如图3所示，目标文库片段均在180‑1000bp之间，大量的PCR引物二聚体已被去除。
[0140] 2. 制备4％agarose TAE‑gel琼脂糖凝胶。
[0141] 3. 将DNA文库在4％agarose TAE‑gel琼脂糖凝胶上电泳2小时，在1：10000稀释的SYBR Green I中染色1小时。
[0142] 4. 根据DNA ladder切胶回收170‑400bp的DNA片段。用QIAGEN MinElute凝胶纯化试剂盒纯化170‑400bp的DNA片段，去除非目标序列（含PCR引物序列、引物二聚体和大片段序列）。
[0143] 5. 用20μl low TE缓冲液洗脱文库DNA。
[0144] 6. 文库DNA QC使用Invitroge的Qubit dsDNA HS Assay Kit和安捷伦HS高敏芯片分别测定文库的质量浓度和DNA片段大小。
[0145] 7. 对相同条带大小的不同文库根据所需数据量的多少进行等比例摩尔量混合。
[0146] 8. 将混合后的文库在Illumina测序平台上进行100bp双末端测序。与其他亚硫酸氢盐测序文库一样，单细胞简化代表性甲基化文库也应该以相对较低的簇密度(常规Illumina测序文库的～60％密度)加载至测序芯片上(flow cell)。同时，添加30‑50％的phiX DNA平衡文库，以增加测序文库的碱基多样性，提高测序质量。
[0147] 本发明的方法通过用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复，解决了现有技术福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题，提高接头和酶切位点结合的效率，提高CpG岛的覆盖度，使酶切富集CpG岛区域的效果得到放大，从而以更经济高效的方式提供甲基化信息，具有广大的应用前景和市场价值。
[0148] 除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
