一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法

摘要

本发明涉及一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法，具体步骤如下：1)以黄薇属的柳叶黄薇为母本、紫薇属的紫薇为父本，进行属间人工杂交；2)杂交后对母本柱头喷施激素保果，取未成熟果实进行胚拯救，获得杂交后代材料；3)对杂种后代进行形态学观察，并采用SSR分子标记进行杂种鉴定，获得紫薇属与黄薇属属间杂种。利用本发明提供的方法，实现了紫薇属与黄薇属属间基因交流，获得了属间杂交新种质，使利用属间杂交培育紫薇新品种成为可能，本发明提供的方法也可用于近缘属亲缘关系研究。

权利要求

1.一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法，其特征在于，亲本人工杂交后，对母本柱头喷施2,4‑D；人工授粉后，在杂种胚由心形胚转向鱼雷胚时，进行胚拯救，获得杂交后代，对杂交后代进行形态学及分子标记鉴定，获得紫薇属与黄薇属属间杂种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，人工杂交后2h和24h，对母本花柱喷施

20mg/L2,4‑D；人工授粉20‑25d后，取未成熟果实，进行胚拯救。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胚拯救培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、0.5‑1.5mg/L GA3和0‑0.5mg/L NAA，pH为5.8‑6.0的MS培养基；

优选的，所述培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、1mg/L GA3和0.5mg/L NAA，pH 5.8‑6.0的MS培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胚拯救的处理包括：将果实置于流水下冲洗12h以上，以75％酒精冲洗果实表面25‑30s，用2％次氯酸钠溶液浸泡8‑10min，无菌水冲洗果实3‑4次，剖开子房，取出种子，将种子接于胚拯救培养基上。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚拯救的培养条件为：温度为24‑26℃，光照度1500‑2000lx，光照12h/d。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述亲本以黄薇属的柳叶黄薇为母本，以紫薇属的紫薇为父本。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)清晨5‑7时将柳叶黄薇去雄套袋，采集紫薇的鲜花粉；

(2)上午9‑11时，将采集的紫薇花粉人工授粉到柳叶黄薇的柱头上并套袋，每天1次，重复2次，授粉后套硫酸纸袋，花柱萎蔫后换成网袋；

(3)在人工授粉后2h和24h，对柳叶黄薇花柱喷施20mg/L2,4‑D；

(4)对人工授粉后20‑25d的果实，进行胚拯救，将果实置于流水下冲洗12h以上，用75％酒精冲洗果实表面25‑30s，用2％次氯酸钠溶液浸泡8‑10min，无菌水冲洗3‑4次，将种子接于培养基上获得杂种后代；所述培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、1mg/L GA3和0.5mg/L NAA，pH 5.8‑6.0的MS培养基；

(5)根据亲本形态对杂种进行形态学观察，采用分子标记进行杂种鉴定，获得紫薇属与黄薇属属间杂种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述分子标记鉴定所用引物对为以下任一：YYJ‑281

上游引物：5’‑GTTAGAGCCCTTCCGCACTT‑3’，下游引物：5’‑GAAGATCCAGCACAGCCCAT‑3’；

YYJ‑656

上游引物：5’‑AGGAGGAAGGAGACGAGCTT‑3’，下游引物：5’‑CTCCTTCCCCTGGTAGTGGA‑3’；

YYJ‑951

上游引物：5’‑GTTCCTGGAGACTTGGGCTC‑3’，下游引物：5’‑TCCGAACTTCCCGACGAATG‑3’；

YYJ‑998

上游引物：5’‑AATCCGTGGCCAAGAGGAAG‑3’，下游引物：5’‑GGGAACTCCAATGTGGGCTT‑3’。

9.权利要求1‑8任一项所述方法在培育紫薇新品种中的应用。

10.权利要求1‑8任一项所述方法在植物亲缘关系研究中的应用。

说明书

一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法。

背景技术

[0002] 紫薇属(Lagerstroemia)植物为千屈菜科(Lythraceae)落叶或常绿的灌木或乔木，是重要的夏季观花植物。全球约有紫薇属植物55种，在亚洲南部、东部、东南部及澳大利亚北部等地多有分布。目前，国内外正在开展紫薇属植物育种的相关工作包括种质资源、繁殖、栽培、病虫害防治、分子生物学研究等方面，抗性育种、香花育种、矮化育种、大花育种和新花色育种已成为紫薇育种研究的热点，通过杂交育种手段，已获得抗白粉病的紫薇品种、矮生紫薇品种、大花紫薇品种以及红色花紫薇品种。

[0003] 花色是紫薇的重要观赏性状之一，自然界中紫薇花色有紫、红、粉、白四种色系，未见黄色品种。由于紫薇属植物中没有黄色花的种类，所以利用传统的种间杂交无法培育出开黄色花的紫薇品种。

[0004] 黄薇属柳叶黄薇(Heimia salicifolia)，是紫薇属的近缘属植物，开黄色花，采用柳叶黄薇与紫薇进行属间杂交，有望获得黄色花的紫薇品种。进行两属间远缘杂交对探讨紫薇与近缘属远缘杂交亲和性、基因交流机制也具有重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明针对目前紫薇属植物缺少黄色花的现状，提供一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法，以改良紫薇属植物的花色性状。

[0006] 远缘杂交可以有效地转移和重组两个或多个进化积累的优良性状，获得由近缘杂交难以获得的优异特性，从而实现对植物有针对性的改良。由于生殖隔离的存在，自然条件下远缘杂交通常无法形成具生活力的后代，随着亲本种族之间的亲缘距离的增大，会出现花粉无法萌发、花粉管无法伸长、杂种胚败育等问题，使得获得杂种后代的难度也随之增大。

[0007] 本发明在经过多次不同方向的尝试后，提供一种获得紫薇属与黄薇属属间杂种的方法，其特征在于，亲本人工杂交后，对母本柱头喷施2,4‑D；人工授粉后，在杂种胚由心形胚转向鱼雷胚时，进行胚拯救，获得杂交后代，对杂交后代进行形态学及分子标记鉴定，获得紫薇属与黄薇属属间杂种。

[0008] 在本发明提供的方法中，人工杂交后2h和24h，对母本花柱喷施20mg/L2,4‑D；人工授粉20‑25d后，取未成熟果实，进行胚拯救。

[0009] 基于获得紫薇属与黄薇属属间杂种这个目的，以黄薇属的柳叶黄薇为母本，以紫薇属的紫薇为父本进行杂交。由于两亲本亲缘关系非常远，存在严重的受精前障碍，以柳叶黄薇为母本的果实在杂交后虽然不脱落，但是随着发育时间的延长，杂交果实在10‑15d后完全变褐干枯。本发明发现喷施激素2,4‑D后，约有10％‑12％的果实可在15d之后仍保持绿色(成活)，大大延长了远缘杂交果实的发育进程。

[0010] 本发明发现杂种胚由心形胚转向鱼雷胚时，进行胚拯救成功的可能性增加。因此，本发明选择人工授粉后20‑25d，取未成熟果实进行胚拯救。由于2,4‑D浓度过高，会影响植物生长发育，本发明进一步探究发现最适合促进母本产生杂交果实，且保护果实发育的2,4‑D浓度为20mg/L。

[0011] 在本发明提供的方法中，胚拯救培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、0.5‑1.5mg/L GA3和0‑0.5mg/L NAA，pH5.8‑6.0的MS培养基；

[0012] 优选的，胚拯救培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L6‑BA、1mg/L GA3和0.5mg/L NAA，pH 5.8‑6.0的MS培养基。

[0013] 本发明提供的胚拯救培养基，可以在不更换培养基的情况下，使得杂交后代顺利生根出芽。

[0014] 在本发明提供的方法中，所述胚拯救包括：将果实置于流水下冲洗12h以上，以酒精冲洗果实表面25‑30s，用次氯酸钠溶液浸泡8‑10min，无菌水冲洗果实3‑4次，剖开子房，取出种子，将种子接于胚拯救培养基上。

[0015] 在本发明提供的方法中，所述胚拯救的培养条件为：温度为24‑26℃，光照度1500‑2000lx，光照12h/d。

[0016] 在本发明提供的方法中，所述亲本以黄薇属的柳叶黄薇为母本，以紫薇属的紫薇为父本。

[0017] 具体地，作为本发明的一个具体实施例方式，本发明提供的方法，包括如下步骤：

[0018] (1)清晨5‑7时将柳叶黄薇去雄套袋，采集紫薇的鲜花粉；

[0019] (2)上午9‑11时，将采集的紫薇花粉人工授粉到柳叶黄薇的柱头上并套袋，每天1次，重复2次，授粉后套硫酸纸袋，花柱萎蔫后换成网袋；

[0020] (3)在人工授粉后2h和24h，对柳叶黄薇花柱喷施20mg/L2,4‑D；

[0021] (4)对人工授粉后20‑25d的果实，进行胚拯救，将果实置于流水下冲洗12h以上，用75％酒精冲洗果实表面25‑30s，用2％次氯酸钠溶液浸泡8‑10min，无菌水冲洗3‑4次，将种子接于培养基上获得杂种后代；所述培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、
0.5‑1.5mg/L GA3和0‑0.5mg/L NAA，pH为5.8‑6.0的MS培养基；

[0022] 优选的，所述培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、1mg/L GA3和0.5mg/L NAA，pH 5.8的MS培养基；

[0023] (5)根据亲本形态对杂种进行形态学观察，采用分子标记进行杂种鉴定，获得紫薇属与黄薇属属间杂种。

[0024] 在本发明提供的方法中，所述分子标记鉴定所用引物对为以下任一：

[0025] YYJ‑281

[0026] 上游引物：5’‑GTTAGAGCCCTTCCGCACTT‑3’(SEQ ID No.1)，

[0027] 下游引物：5’‑GAAGATCCAGCACAGCCCAT‑3’(SEQ ID No.2)；

[0028] YYJ‑656

[0029] 上游引物：5’‑AGGAGGAAGGAGACGAGCTT‑3’(SEQ ID No.3)，

[0030] 下游引物：5’‑CTCCTTCCCCTGGTAGTGGA‑3’(SEQ ID No.4)；

[0031] YYJ‑951

[0032] 上游引物：5’‑GTTCCTGGAGACTTGGGCTC‑3’(SEQ ID No.5)，

[0033] 下游引物：5’‑TCCGAACTTCCCGACGAATG‑3’(SEQ ID No.6)；

[0034] YYJ‑998

[0035] 上游引物：5’‑AATCCGTGGCCAAGAGGAAG‑3’(SEQ ID No.7)，

[0036] 下游引物：5’‑GGGAACTCCAATGTGGGCTT‑3’(SEQ ID No.8)。

[0037] 根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述方法在培育紫薇新品种、在植物亲缘关系研究中的应用。

[0038] 本发明的有益效果：

[0039] (1)本发明通过在母本柱头喷施2,4‑D，使得杂交果实在15d之后仍保持绿色(成活)，大大延长了远缘杂交果实的发育进程。

[0040] (2)本发明发现杂种胚由心形胚转向鱼雷胚时，进行胚拯救成功的可能性增加；因此，本发明选择人工授粉后20‑25d，取未成熟果实进行胚拯救。

[0041] (3)本发明通过特定的胚拯救培养基，在不更换培养基的情况下，促使杂交后代生根发芽。

[0042] (4)本发明利用紫薇属紫薇与黄薇属柳叶黄薇进行远缘杂交，实现了紫薇属与黄薇属属间基因交流，获得了属间杂交新种质。

[0043] (5)采用本发明提供的方法，可丰富紫薇属植物的遗传信息，使得利用属间杂交进行紫薇新品种培育成为可能，同时可进行近缘属的亲缘关系研究。

附图说明

[0044] 图1是本发明实施例1中柳叶黄薇(左)、杂种(中)与紫薇(右)叶片的对比照片。

[0045] 图2是本发明实施例1中引物YYJ‑281在亲本及子代中的分离检测结果图。

[0046] 图3是本发明实施例1中引物YYJ‑656在亲本及子代中的分离检测结果图。

[0047] 图4是本发明实施例1中引物YYJ‑951在亲本及子代中的分离检测结果图。

[0048] 图5是本发明实施例1中引物YYJ‑998在亲本及子代中的分离检测结果图。

具体实施方式

[0049] 以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

[0050] 若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0051] 实施例1

[0052] 本实施例提供的是一种获得紫薇属与黄薇属杂交后代的方法。

[0053] (1)材料选择

[0054] 本实施例选择紫薇属的紫薇‘Sarah Favorite’作为父本；选择黄薇属的柳叶黄薇作为母本。

[0055] (2)杂交方法及杂种获得

[0056] 2019年夏季，在国家花卉工程中心小汤山苗圃，上午5‑7时将361朵柳叶黄薇进行人工去雄并套袋隔离，采集紫薇‘Sarah Favorite’新鲜花粉，于上午9‑11时授粉，每天一次，连续授粉2次。

[0057] 人工授粉后2h和24h后摘下硫酸纸袋，向柱头喷施20mg/L2,4‑D，待柱头萎蔫后，将套袋所用硫酸纸袋换成网袋。

[0058] 以柳叶黄薇为母本的杂交果实与杂交20‑25天后采下，在361个人工授粉的花朵中，共获得杂交果实15个，座果率为4.16％。

[0059] 用流水冲洗杂交果实12h以上，经过75％酒精冲洗果实表面25‑30s，2％次氯酸钠溶液浸泡8‑10min，用无菌水冲洗3‑4次。

[0060] 制备培养基，培养基为含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.5mg/L 6‑BA、0.5‑1.5mg/L GA3和0‑0.5mg/L NAA，pH为5.8‑6.0的MS培养基。剖开果实表面，将2次人工授粉处理，共获得的720个杂交种子接种在培养基上进行胚拯救，于24‑26℃，光照度1500‑2000lx，光照时长12h/d环境下培养，共出苗11株，总出苗率为1.53％。

[0061] 出苗后，11株幼苗部分出现长势弱、干枯发黄等早衰现象，最后获得1株属间杂交后代植株，杂交幼苗成活率为9.09％。

[0062] (3)紫薇与柳叶黄薇杂种的鉴定

[0063] 亲本与杂交后代表型比较见图1。从表型看，杂交后代叶片大小介于父母本之间，其表型更接近于母本柳叶黄薇，母本柳叶黄薇叶片大小3.48cm×0.61cm，父本紫薇‘Sarah Favorite’叶片大小6.51cm×4.42cm，杂交后代叶片大小为5.83cm×1.15cm。

[0064] SSR分子标记鉴定设计4对引物对，提取亲本及子代幼嫩叶片的DNA进行扩增，对比亲本及子代特异性条带：

[0065] YYJ‑281

[0066] 上游引物：5’‑GTTAGAGCCCTTCCGCACTT‑3’

[0067] 下游引物：5’‑GAAGATCCAGCACAGCCCAT‑3’

[0068] YYJ‑656

[0069] 上游引物：5’‑AGGAGGAAGGAGACGAGCTT‑3’

[0070] 下游引物：5’‑CTCCTTCCCCTGGTAGTGGA‑3’

[0071] YYJ‑951

[0072] 上游引物：5’‑GTTCCTGGAGACTTGGGCTC‑3’

[0073] 下游引物：5’‑TCCGAACTTCCCGACGAATG‑3’

[0074] YYJ‑998

[0075] 上游引物：5’‑AATCCGTGGCCAAGAGGAAG‑3’

[0076] 下游引物：5’‑GGGAACTCCAATGTGGGCTT‑3’

[0077] 结果发现，在获得的1株杂交后代中SSR分子记条带中出现了父、母本所特有的标记，同时也出现父母本所没有的条带(见图2‑图5)。

[0078] 因此本发明提供的方法可以改变属间物种的杂交不亲和性，获得属间杂交品种，为其他属间杂交后代的获取提供背景资料。

[0079] 对比例1

[0080] 柳叶黄薇正常发育的果实会一直保持绿色并逐渐膨大，而与紫薇杂交后果实不会脱落，但会随着发育时间的延长，果实在枝条上逐渐变褐干枯。

[0081] 不喷施2,4‑D，以柳叶黄薇为母本的果实在杂交后不脱落，从杂交后第3‑5d开始出现黄化，且果实不会随时间延长而膨大，随着在枝条上的时间延长，杂交果实在10‑15d后完全变褐干枯，干枯率100％。

[0082] 柳叶黄薇和紫薇杂交后，喷施20mg/L 2,4‑D，以柳叶黄薇为母本的果实在杂交后不脱落且能够膨大，有10％‑12％的果实可在15d之后仍保持绿色(成活)，大大延长了远缘杂交果实的发育进程，杂交果实可发育到鱼雷胚时期，进行胚拯救成功的可能性增加。

[0083] 对比例2不同胚拯救培养基配方

[0084] 本对比例提供不同配方的胚拯救培养基，获得的杂交种的出苗率。

[0085] 本对比例中所有培养基均添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂和0.5mg/L6‑BA，pH均调整为5.8‑6.0，但添加的GA3与NAA浓度有所不同。培养条件均为24‑26℃，光照度1500‑2000lx，光照时长12h/d环境下培养。

[0086] (1)在1mg/L GA3和0.5mg/L NAA的MS培养基上，接种144个种子，出苗6株，出苗率为4.17％；

[0087] (2)在1mg/L GA3和0.5mg/L NAA的1/2MS培养基生，接种144个种子，出苗3株，出苗率为2.08％；

[0088] (3)在1mg/LGA3且不添加NAA的MS培养基上接种144个种子，出苗1株，出苗率为0.69％；

[0089] (4)在0.5mg/L GA3且不添加NAA的MS培养基上接种144个种子，出苗1株，出苗率为0.69％；

[0090] (5)在1.5mg/L GA3且不添加NAA的MS培养基上接种144个种子，出苗0株，出苗率为0.00％。

[0091] 对比例3

[0092] 本对比例提供不同亲本进行属间杂交的结果。

[0093] (1)以屋久岛紫薇和紫薇品种‘Dallas Red’、‘Catawba’、‘Centennial Spirit’、‘Near East’或‘Pocomoke’为母本，以黄薇或柳叶黄薇为父本的杂交组合，均无法获得果实；

[0094] (2)以紫薇品种‘Sarah Favorit’为母本，以黄薇或柳叶黄薇为父本的杂交组合，可以获得极少量杂交果实但胚拯救无法获得幼苗；

[0095] (3)以黄薇为母本，以紫薇品种‘Dallas Red’、‘Catawba’、‘Centennial Spirit’或‘Near East’为父本的杂交组合，均无法获得果实；

[0096] (4)以黄薇为母本，以屋久岛紫薇或紫薇品种‘Sarah Favorit’为父本的杂交组合，可以获得极少量杂交果实但胚拯救无法获得幼苗。

[0097] 对比例4不同胚拯救时期

[0098] 本对比例提供在胚不同发育时期进行胚拯救操作，获得杂交种的出苗率结果。

[0099] (1)选用授粉后10‑20d之间的果实进行胚拯救，出苗率为0.00％；

[0100] (2)选用授粉后20‑25d之间的果实进行胚拯救，出苗率为1.53％。

[0101] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。