纳米复配液在软骨细胞自体修复及再生医学美学中的应用

摘要

本发明提供了用于软骨修复的纳米复配液，包括PBS缓冲液、透明质酸以及纳米微球粒子复合物，其中纳米微球粒子复合物包括微球粒子，填充剂以及骨形态发生蛋白类似物。本发明进一步公开了用于软骨修复的纳米复配液的制备方法。本发明利用骨形态发生蛋白类似物活性肽制备了具有缓释功能的纳米微球粒子复合物以及对应的纳米复配液，利用制备的复配液实现了软骨细胞的诱导，基于液态分层水动力软性剥离(水剥离)技术，经过激活人体自愈系统，可以广泛应用于关节、软骨的损伤以及美容修复，具有极高的推广价值，可以广泛应用于软骨细胞自体修复及再生医学美学。

权利要求

1.一种用于软骨修复的纳米复配液，其特征在于，所述复配液包括：PBS缓冲液、透明质酸以及纳米微球粒子复合物，所述纳米微球粒子复合物包括微球粒子，填充剂以及骨形态发生蛋白类似物，所述骨形态发生蛋白类似物采用人工合成的方式制备，其序列为RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

2.如权利要求1所述的复配液，其特征在于，所述微球粒子选自壳聚糖微球，所述填充剂选自牛血清白蛋白。

3.一种美容制品，其特征在于，所述美容制品包括权利要求1‑2任一权利要求所述的复配液。

4.权利要求1所述的纳米复配液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)微球粒子制备：称取壳聚糖，溶解于2％v/v醋酸，滴加到正辛醇，1500rpm拨拌

30min；离心，弃上层水相；加入异丙醇，离心弃上清；加入双蒸水离心，弃上清，环氧乙焼消毒,保存备用；

(2)将BSA溶于盐酸水溶液中，过滤除菌，再加入骨形态发生蛋白类似物，得到骨形态发生蛋白类似物保存液；

(3)称取步骤(1)的微球粒子，加入步骤(2)制备的保存液，置于摇床中，充分振荡均匀；

(4)离心，双蒸水洗涤，离心获得纳米微球粒子复合物；所述骨形态发生蛋白类似物采用人工合成的方式制备，其序列为RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：(5)将透明质酸原液溶于PBS缓冲液中；

(6)将步骤(4)制备的纳米微球粒子复合物溶于步骤(5)制备的缓冲液。

6.一种用于软骨修复的纳米复配液，其特征在于，采用权利要求4‑5所述的方法制备得到。

7.权利要求6所述的纳米复配液在制备美容产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述美容产品为软骨损伤美容修复产品。

说明书

纳米复配液在软骨细胞自体修复及再生医学美学中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物医学工程领域，具体涉及软骨损伤再生的纳米复配液，以及采用所述纳米复配液在软骨细胞自体修复及再生医学美学中的应用。

背景技术

[0002] 近年来因外伤、炎症、或退变等导致的关节软骨损伤在临床上十分常见，并伴有关节疼痛、关节畸形、甚至关节功能障碍等明显症状，严重影响着国民的健康状况和生活质量。

[0003] 由于关节软骨没有血管、淋巴管和神经支配，一旦发生磨损或创伤，很难恢复到原来的结构和状态。关节软骨只包含单一种类的细胞‑‑软骨细胞(chondrocytes)。软骨细胞本身的生长受到了限制，因此，关节软骨受损后很难自我修复。软骨的无血管微环境导致关节软骨中的营养交换或软骨前体细胞循环受到限制，阻碍了受损区域的愈合过程。尽管外科治疗，如干细胞刺激、同种异体移植和自体移植在某些方面有助于恢复软骨功能，但这些传统治疗方法仍存在局限性，包括软骨退化、与宿主组织整合力差及二次手术等。

[0004] 此外，软骨缺损和损伤可引起创伤后骨关节炎(OA)，增加了软骨损伤愈合的难度。因此，关节软骨损伤修复一直是临床的重大难题之一。软骨修复型治疗方法中，包括微骨折技术、组织工程学技术、软骨及骨膜移植技术、基因治疗技术。其中微骨折技术是利用在软骨缺损区打孔释放的骨髓间充质干细胞、生长因子等形成显微血凝块，分化为纤维软骨组织，促进软骨再生传统治疗方法如微骨折、镶嵌成形术、自体软骨细胞移植和同种异体骨/软骨移植等可以减轻疼痛并改善关节功能，然而，这些方法产生的新生软骨通常构成I型胶原，缺乏II型胶原的透明软骨特性，远期临床效果欠佳。人工关节置换则存在假体磨损、腐蚀及松动等问题，且适用人群有限。因此目前针对关节软骨损伤的修复方法都只是暂时缓解症状，而不是治愈，没有再生功能软骨。另外还有骨软骨移植和自体软骨细胞移植。骨软骨移植是从膝关节内的次要部位取出符合受伤部位尺寸的软骨，然后植入软骨缺损处。虽然手术能成功，也能排除免疫反应的风险，但是次要部位的软骨会较薄弱。自体软骨细胞移植(ACI)则是从膝关节内次要部位取出正常的活软骨组织，然后将软骨细胞培养在实验室，繁殖到足够数量，再把软骨细胞植到软骨缺损位置中，此方法中新的软骨细胞状态会与天然的关节软骨相似。如果关节病变情形非常严重，临床医生就会进行抢救类型的手术，如截骨术或全关节置换术。

[0005] 药物缓释就是将小分子药物与高分子载体以物理或化学方法相结合，在体内通过扩散、渗透等控制方式，将小分子药物以适当的浓度持续地释放出来，其有利于提高药物的生物利用度，降低毒副作用，减轻患者多次用药的痛苦，进而提高临床用药水平。目前，主要开发的药物缓释高分子载体材料主要有天然高分子材料、合成高分子材料及无机材料。

[0006] 目前，壳聚糖常作为多肽、蛋白质及抗肿瘤类药物的载体，通过其自身降解来调节药物释放，可在几周或几个月内以较稳定的速率释放药物，维持有效血药浓度，减少药物半衰期的给药次数，适用于半衰期短而又需要长期使用的药物。

[0007] 随着组织工程技术的发展，关节软骨的损伤修复进入了一个新高度，该技术主要包括种子细胞、支架材料及细胞生长因子三个要素，其中支架材料用来模拟细胞外基质，为缺损部位细胞的生长、增殖和分化提供适宜的微环境，利用细胞和生物分子之间相互作用的天然生物过程促进关节软骨的修复再生。因此，组织工程的成功很大程度上依赖于支架在结构和成分方面模仿相应组织的细胞外基质(ECM)的程度。

[0008] 可注射水凝胶作为软骨修复的候选材料受到了广泛的关注。其宗旨是将负载有细胞或生长因子的水凝胶前驱液直接注入关节软骨的缺损部位进行原位填充，然后在短时间内快速聚合形成固体凝胶。这种策略的优势在于可以通过微创手术很容易地填充不规则形状的缺损，不仅能够与缺损部位融合良好，而且细胞和生物活性因子可以均匀地结合在水凝胶中，纳米颗粒的可注射纳米复配液用于软骨修复示意图参见图1。

[0009] 为了进一步提高可注射水凝胶的机械强度和稳定性，一些研究者将微球粒子(如明胶、海藻酸钠、壳聚糖微球)、纳米颗粒(如羟基磷灰石、金属粒子、粘土)和纳米纤维(如白蛋白、静电纺丝PCL、二氧化硅纳米纤维[45])等填充剂加入作为可注射水凝胶材料用于关节软骨修复。复合水凝胶具有孔隙连通、压缩模量高、成形性好、降解性合理等优良特性，是一种适合软骨组织工程的基质。

[0010] 自体软骨移植有利有弊，优点是不存在免疫排斥反应，缺点是低分化、低生物活性，且获取软骨细胞属于有创操作，易引起感染、术后疼痛等并发症，主要用于中小面积的软骨损伤。异体骨膜移植来源充足，但容易发免疫排斥反应。两种方法均限制了临床应用。基因治疗技术在软骨损伤中的应用目前仍停留在理论层面，基因的提取生和转染并在临床上成熟应用仍然在探索中。

[0011] 先进的皮肤生态学，唤醒了“水剥离”细胞再生医学和美学领域，再生美水剥离是来自欧美的尖端技术，专业抗衰除皱经过激活人体自愈系统，让操作过的部位，在28天内“逆生长”。这段时间重生的细胞数量，大于衰亡的细胞数量，皮下网状纤维得到修正和重建。所谓“剥离”，就是依靠水的涨力，分离细胞与细胞之间的距离，“水”进入皮下后，会主动避开毛细血管和神经网，即完成剥离细胞距离又不会构成创面。

[0012] 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)最早由Urist发现并命名。BMPs是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白,属于转化生长因子‑P(TGF‑P)超家族。近些年的研究发现，BMPs有多种生物学功能。其最为研巧者关注的功能为其能够在体内诱导骨和软骨形成。

[0013] BMP‑2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMPs之一。目前国内用化学合成法合成含有17个氨基酸的新型短肽P17‑BMP‑2。该短肽克服了国内外基因工程技术制备的rhBMP‑2的缺点。其与BMP2的骨诱导活性相类似,同时应用了固相合成法，工艺更为简单。解决了rhBMP‑2无法大规模生产以及安全性的难题。P17‑BMP‑2仅含有17个氨基酸,可以有效地克服大分子所带来的抗原性以及其他一些生物副作用，其氨基酸序列为IVAPPGYHAFYCHGECP。该短肽的结构简单,生物性状更加稳定,活性更好。而且,非常方便对该肽链进行修饰。可以说，该核苷酸序列继承了BMP‑2的活性,克服了其缺点。

[0014] 富含精氨酸的细胞穿膜肽中含有的胍基可以和细胞膜表面带负电的磷酸基和硫酸基结合，使其能高效地穿越细胞膜。同时，细胞穿膜肽具有较低的细胞毒性，因而在细胞穿膜领域有应用用途(孙春萌等，细胞穿膜肽的研究进展。由非天然的D型精氨酸(R)及天然的L型精氨酸(R)杂合的一种聚精氨酸(rR)3R2能高效、低毒性地进入细胞；同时具有一定的抗酶解、抗血清降解能力，因而备受关注。然而，该聚精氨酸需要将标记物和包覆的分子以共价键的形式连接在肽链的N端或者C端。

[0015] 世界范围内，由创伤、肿瘤和感染等原因引起的骨缺损正逐年增加，对人们的健康产生越来越大的影响。在我国，由于骨缺损而需要接受治疗的患者每年大约有400万。除了疾病引起的骨缺损需要骨移植外，整形美容外科手术中也经常需要骨移植来塑形。骨移植材料已成为仅次于输血的需求量最大的移植物,而且有逐年增多的趋势。

发明内容

[0016] 本发明针对现有技术中软骨修复移植材料紧缺，且效果不够理想的问题，提供一种用于软骨修复的生物组合制剂，该生物组合制剂能够适用于组织工程学技术进行软骨修复，且对软骨损伤的修复效果好，治疗省时、显效快。

[0017] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0018] 对于已知的新型短肽P17‑BMP‑2进行序列的改造优化，以增加其穿膜性。

[0019] 优选的，是基于已知的P17‑BMP‑2序列中引入有助于穿膜的氨基酸修饰。

[0020] 优选的，是采用精氨酸或亮氨酸或色氨酸等具有穿膜性质的氨基酸进行多肽的修饰。

[0021] 优选的，修饰后的P17‑BMP‑2短肽分子的序列为XXIVXPPXYHAFYCHGECP，其中X可以选自精氨酸、亮氨酸、色氨酸中的一种。

[0022] 优选的，修饰后的P17‑BMP‑2短肽分子的长度为19个氨基酸，优选序列可以是RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

[0023] 本发明公开了一种用于软骨修复的纳米复配液，所述复配液包括：PBS缓冲液、透明质酸以及纳米微球粒子复合物，所述纳米微球粒子包括微球粒子，填充剂以及骨形态发生蛋白类似物。

[0024] 优选的，所述微球粒子选自壳聚糖微球，所述填充剂选自牛血清白蛋白。

[0025] 优选的，所述骨形态发生蛋白类似物采用人工合成的方式制备，其序列为RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

[0026] 本发明公开了一种美容制品，所述美容制品包括所述的复配液。

[0027] 本发明公开了纳米复配液的制备方法，包括如下步骤：

[0028] (1)微球粒子制备：称取壳聚糖，溶解于2％v/v醋酸，滴加到正辛醇，1500rpm拨拌30min；离心，弃上层水相；加入异丙醇，离心弃上清；加入双蒸水离心，弃上清，环氧乙烷消毒,保存备用；

[0029] (2)将BSA溶于盐酸水溶液中，过滤除菌，再加入骨形态发生蛋白类似物，得到骨形态发生蛋白类似物保存液；

[0030] (3)称取步骤(1)的微球粒子，加入步骤(2)制备的保存液，置于摇床中，充分振荡均匀；

[0031] (4)离心，双蒸水洗涤，离心获得纳米微球粒子复合物。

[0032] 优选的，所述骨形态发生蛋白类似物采用人工合成的方式制备，其序列为RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

[0033] 优选的，还包括：(5)将透明质酸原液溶于PBS缓冲液中；

[0034] (6)将步骤(4)制备的纳米微球粒子溶于步骤(5)制备的缓冲液。

[0035] 本发明公开了一种用于软骨修复的纳米复配液，采用所述的方法制备得到。

[0036] 本发明公开了所述的纳米复配液在制备美容产品中的应用。

[0037] 优选的，所述美容产品为软骨损伤美容修复产品。

[0038] 有益效果

[0039] 本发明公开了一种骨形态发生蛋白类似物，所述类似物多肽可以诱导骨细胞的形成，本发明进一步利用所述活性肽制备了具有缓释功能的纳米微球粒子以及对应的纳米复配液，利用制备的复配液实现了软骨细胞的修复和再生，可以广泛应用于关节、软骨的损伤以及美容修复，具有极高的推广价值。

附图说明

[0040] 图1为添加纳米颗粒的可注射纳米复配液用于软骨修复示意图；

[0041] 图2为制备的微球粒子的电镜检查结果；

[0042] 图3为BMSC细胞分化为软骨细胞的II型胶原免疫组化检测图；

[0043] 图4为光学显微镜观察培养的MSC细胞的结果，其中A为培养1天后的观察结果，而B为培养7天后的结果；

[0044] 图5为MSC细胞中的AKP检测结果，其中横坐标是细胞培养的天数，而纵坐标是AKP的含量，单位μg/mL；

[0045] 图6为MSC细胞诱导后约2周的茜素红染色结果。

具体实施方式

[0046] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0047] 实施例1微球粒子的制备以及微球形态鉴定

[0048] 1)称取200mg壳聚糖,溶解于8ml2％v/v醋酸溶液中；

[0049] 2)将上述溶液逐渐滴加到150ml正辛醇中,不断拨拌30min；

[0050] 3)加入10ml 8％w/vTPP溶液,1200rpm揽拌30min；

[0051] 4)4000rpm离心、弃上层水相；

[0052] 5)加入异丙醇8ml,2500转离心弃上清；

[0053] 6)加入双蒸水8ml,2500转离心弃上清；

[0054] 7)重复5、6步骤2‑3次；

[0055] 8)环氧乙烷消毒,制备得到壳聚糖微球粒子，保存备用；

[0056] 9)采用SEM电镜扫描观察制备得到的微球的分布及形态。

[0057] 电镜观察结果表明，制备的微球粒径均一，形态近似，且分散均一，是良好的缓控载体，电镜检查结果参见图2。

[0058] 实施例2纳米微球粒子复合物的制备

[0059] (1)将人工合成的骨形态发生蛋白类似物溶于PBS中，其序列为RRIVLPPWYHAFYCHGECP。

[0060] (2)将BSA溶于盐酸水溶液中，过滤除菌，再加入骨形态发生蛋白类似物，得到骨形态发生蛋白类似物保存液；

[0061] (3)称取实施例1中制备的的微球粒子，加入步骤(2)制备的保存液，置于摇床中，充分振荡均匀；

[0062] (4)离心，双蒸水洗涤，离心获得纳米微球粒子复合物。

[0063] 实施例3纳米微球粒子复合物对体外软骨细胞分化的诱导

[0064] 取BMSC细胞，以6X103/孔密度接种于16孔细胞培养板,待细胞融合至70％左右时，培养基中加入实施例2制备的纳米微球粒子复合物，浓度约为0.5‑2mg/L。继续培养15‑20天，在培养15天后，每天吸取部分细胞进行II型胶原免疫组化的检测试验，鉴定BMSC细胞分化成软骨细胞的情况。其中，在培养18天左右，可以免疫组化试验可以鉴定出阳性细胞，表明，在体外经过纳米微球粒子复合物的诱导，有部分BMSC细胞已经分化为软骨细胞，其中II型胶原免疫组化的检测结果参见图3。

[0065] 实施例4纳米复配液的制备

[0066] (1)将透明质酸钠于室温溶于水中，形成质量分数为0.1％的透明溶液，加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸原液；

[0067] (2)透明质酸原液溶解在PBS溶液，按照体积比2:1分别储存；

[0068] (3)将实施例2制备的纳米微球粒子溶于上述溶液中，按照质量体积比1:5(g/mL)混匀；

[0069] (4)储存在并联的两支针筒内，并采取无菌包装。

[0070] 实施例5纳米复配液的对体外骨细胞分化的诱导

[0071] (1)从温箱中取出培鼠MSC细胞的培养板,弃培养液,PBS洗3次,每孔加入1ml胰蛋白酶消化液成品,消化细胞；

[0072] (2)光学显微镜观察,当细胞间隙増大,细胞变圆,立即完全终止消化；

[0073] (3)将细胞转移至离心管中,再次加入培养基,吹打,反复多次,至镜下见细胞均飘起,将洗液转移至离心管中；

[0074] (4)离心后弃上清,加入培养液,吹打混匀,置于37℃的二氧化碳培养箱中培养；

[0075] (5)加入实施例4配制的纳米复配液，浓度约为1‑2.5mg/L。继续培养，细胞融合达到75％以上时，进行成骨诱导，每三天进行诱导换液；

[0076] (6)对诱导的细胞进行碱性磷酸酶(按照碱性磷酸酶测定试剂盒的操作说明书进行)的测定，其中取不同诱导培养时间点的培养的细胞1mL，镜检稀释成相同的细胞浓度后，采用试剂盒测定；

[0077] (7)对于成骨诱导后约2周的细胞进行茜素红染色，并在光学显微镜下观察。

[0078] 其中光学显微镜观察培养的MSC细胞的结果参照图4，其中A为培养1天后的观察结果，其中的细胞已经呈梭状，而B为培养7天后的结果，细胞生长加速，出现融合，大部分细胞均呈现梭状。

[0079] 细胞中的AKP检测结果如图5所示，随着时间的培养，诱导细胞中的AKP的含量逐渐增加。

[0080] 诱导后约2周的细胞进行茜素红染色结果参见图6，结果表明在诱导的MSC细胞中已经有钙结节的形成。

[0081] 采用本申请提供的纳米复配液以及纳米微球粒子复合物均能够成功实现骨细胞的诱导分化。因此，可以广泛应用于关节、软骨的损伤以及美容修复，具有较高的推广应用价值。

[0082] 本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。